Un dosage automatisé rapide géotaxie négative itérative pour analyser le comportement d’escalade adultes dans un modèle drosophile de la neurodégénérescence
12 septembre 2017
Ce protocole étape par étape analyse le comportement de géotaxie négative de drosophile à l’aide d’un système automatisé de multicylindre qui héberge des centaines de mouches et synchronise leur action par un moteur électrique. Lors de la synchronisation, comportement de la mouche géotaxie négative est analysé, enregistrés numériquement et analysées en utilisant le logiciel RflyDetection individu-conçu.
L'objectif global de ce test automatisé de géotaxie négative rapide et itérative est d'analyser les déficits d'escalade des adultes de Drosophila associés à la neurodégénérescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences telles que le mécanisme des déficits locomoteur associés à la neurodégénérescence. Le principal avantage de cette technique est que l'activité d'escalade des mouches peut être analysée de manière automatisée et professionnelle avec une haute précision.
Les implications de cette technique s'étendent vers la thérapie et le diagnostic de la neurodégénérescence, car les maladies neurodégénératives sont fréquemment associées à une perte progressive de la capacité de mouvement, une réduction de l'espérance de vie et une neurodégénérescence dépendante de l'âge. Nous avons d'abord eu l'idée de cette méthode. Nous voulions mesurer l'activité locomotrice des adultes de Drosophila de manière plus précise.
Pour effectuer la collecte des mouches, commencez par maintenir les mouches sur une nourriture standard pour mouches à 25 degrés Celsius, 70% d'humidité et dans un cycle de 12 heures de lumière, 12 heures d'obscurité. Collectez les vierges UAS-Dicer2 DDC-GAL4 sous anesthésie au dioxyde de carbone. Faites croiser les vierges avec des mâles adultes âgés de deux jours portant les génotypes suivants, avec un rapport mâle/femelle de un à deux.
Collectez séparément les mâles et les femelles nouvellement éclos dans trois flacons pour chaque groupe par expérience, en plaçant 10 mouches dans chaque flacon de mouches standard avec de la nourriture standard. Placez ensuite les flacons à 25 degrés Celsius. Pour effectuer le test RING automatisé, transférez 10 mouches unisexes par génotype dans chaque flacon.
Ensuite, fixez le flacon avec une vis. Analysez les mouches témoins et les mouches portant différents génotypes ensemble pour chaque ensemble d'expériences. Allumez la caméra numérique placée devant l'appareil, et une fois que les mouches sont chargées et prêtes, commencez l'enregistrement.
La caméra doit être placée horizontalement et à une distance appropriée de l'appareil RING pour capturer les positions dans des emplacements relativement précis de toutes les mouches. Après avoir laissé une minute aux mouches pour s'installer dans les flacons, allumez le contrôleur de pas qui contrôle le pilote de pas. Cela fait fonctionner le petit moteur électrique pour contrôler le levier attaché, de sorte qu'il se lève consécutivement et frappe l'appareil quatre fois en deux secondes.
Après avoir frappé l'appareil, notez que les mouches commencent à remonter le mur. En gardant l'enregistrement en marche, répétez la synchronisation comme précédemment, à des intervalles de 60 secondes pendant trois à cinq essais consécutifs. Répétez l'expérience pour les mouches âgées de cinq, 15, 25 et 35 jours.
Effectuez au moins trois expériences indépendantes pour chaque groupe pour chaque expérience, avec au moins 30 mouches collectées ou trois flacons. Pour analyser les données, importez la vidéo enregistrée dans l'ordinateur. Pour chaque essai, prenez une capture d'écran de la vidéo six secondes après le frappement.
Dans le logiciel de détection R-fly, utilisez le menu Fichier pour importer l'image de capture d'écran. Ensuite, en utilisant l'icône de ligne de base sur la barre d'outils, définissez précisément les lignes de base supérieure et inférieure du flacon, puis utilisez le curseur pour marquer les lignes de base supérieure et inférieure sur l'image. Dans la barre Paramètres, dans le champ Mouches dans le rectangle, entrez le nombre de mouches par flacon, et dans le champ Hauteur du tube, entrez la longueur du flacon.
Les positions individuelles des mouches sont détectées et étiquetées avec des points à l'écran pour chaque flacon. Notez que dans un tableau sur le panneau de droite, le logiciel détermine automatiquement la distance de grimpe pour chaque mouche et affiche les valeurs moyennes de 10 mouches dans chaque flacon. Présentez les données sous forme de moyenne plus ou moins l'EPM.
Calculez les valeurs P de signification en utilisant une ANOVA à un facteur avec un test de comparaison multiple de Bonferroni. L'analyse des mouches désignées Dicer2 en utilisant le test RING automatisé présenté dans cette vidéo a montré une diminution dépendante de l'âge de la distance de grimpe dans un laps de temps de six secondes pour les mouches mâles et femelles, suggérant que l'expression aux dans les neurones dopaminergiques ou DA est cruciale pour l'activité locomotrice des mouches. La capacité de grimpe ne semble pas être affectée par la surexpression d'auxGFP dans les neurones DA et la cochercher d'auxR et auxGFP dans les neurones DA a permis de sauver le phénotype RNAi.
Une fois maîtrisée, cela peut être fait en deux à trois heures si cela est effectué correctement. Avoir ce développement est maintenant un moyen pour les chercheurs dans le domaine des neurosciences d'explorer la neurodégénérescence chez Drosophila melanogaster. N'oubliez pas que travailler avec un appareil RING électrique peut être extrêmement dangereux et chaque confirmation doit être serrée fermement et soigneusement vérifiée avant d'effectuer cette procédure.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode automatisée d'analyse du comportement de géotaxie négative de Drosophila, en se concentrant sur les déficits de grimpe chez les adultes liés à la neurodégénérescence. La technique utilise un système à cylindres multiples pour synchroniser et enregistrer les mouvements des mouches, fournissant des informations sur les déficits locomoteurs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Analyse comportementale
- Neurodégénérescence
Contexte
- Drosophila sert d'organisme modèle pour l'étude des maladies neurodégénératives.
- Le comportement de géotaxie négative est un indicateur de la capacité locomotrice des mouches.
- La neurodégénérescence conduit souvent à une perte progressive de la mobilité et de la durée de vie.
- Les systèmes automatisés améliorent la précision des tests comportementaux.
Objectif de l'étude
- Analyser les déficits d'escalade chez la Drosophile associés à la neurodégénérescence.
- Explorer les mécanismes sous-jacents aux déficits locomoteurs.
- Améliorer la précision des mesures de l'activité locomotrice des mouches.
Méthodes utilisées
- Système automatisé à plusieurs cylindres pour le mouvement synchronisé des mouches.
- Enregistrement numérique du comportement de géotaxie négative.
- Analyse à l'aide du logiciel RflyDetection conçu par nos soins.
- Essai itératif rapide pour la collecte de données à haut débit.
Résultats principaux
- Synchronisation réussie des mouvements des mouches pour une analyse précise.
- Identification de déficits locomoteurs liés à la neurodégénérescence.
- L'analyse automatisée s'est révélée efficace et fiable.
- Implications potentielles pour le traitement et le diagnostic des maladies neurodégénératives.
Conclusions
- Le test automatisé fournit une méthode robuste pour étudier le comportement locomoteur chez Drosophila.
- Les connaissances acquises pourraient orienter les approches thérapeutiques contre la neurodégénérescence.
- Cette technique améliore la compréhension de la relation entre le mouvement et les affections neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai automatisé à haut débit permet une quantification rapide des déficits locomoteurs chez des modèles de drosophiles de la neurodégénérescence, en appuyant la validation précoce de cibles grâce à des lectures comportementales objectives et reproductibles. La méthode améliore la confiance prédictive dans le criblage préclinique en permettant l'analyse simultanée de centaines de mouches appartenant à plusieurs génotypes et groupes d'âge, facilitant ainsi l'évaluation efficace de composés ou de modificateurs génétiques. Son intégration dans les flux de découverte contribue à réduire les risques mécanistiques liés aux cibles neurodégénératives par un phénotypage standardisé et évolutif.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les déficits d'escalade dépendants de l'âge, liés à la neurodégénérescence dans des modèles génétiques.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle de cibles grâce à la mesure en haut débit de l'activité locomotrice, utilisée comme indicateur de l'intégrité neuronale.
- Valeur prédictive : Génère des données comportementales quantitatives qui aident au tri des portefeuilles en identifiant les génotypes présentant un déficit moteur significatif.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des métriques standardisées et reproductibles de géotaxie négative, adaptées à la validation d'essais dans le cadre de campagnes de criblage axées sur la neurodégénérescence.
- Valeur opérationnelle : Permet le criblage rapide de modificateurs génétiques ou pharmacologiques grâce à la capture vidéo automatisée et à l'analyse par le logiciel RflyDetection.
- Extensibilité : Traite les données de centaines de mouches par essai, augmentant le débit et réduisant la variabilité par rapport aux essais manuels.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence translationnelle : Fournit un système pertinent pour la maladie permettant d'évaluer des phénotypes locomoteurs qui reflètent les déficits moteurs cliniques observés dans les troubles neurodégénératifs.
- Continuité préclinique : Permet une évaluation longitudinale à différents âges des mouches (5, 15, 25, 35 jours) afin de modéliser une neurodégénérescence progressive.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'évaluer des expériences de sauvetage génétique (par exemple, co-expression de auxR/auxGFP) afin de valider la spécificité de la cible et l'implication des voies biologiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés d'intérêt, en fournissant un critère d'évaluation comportemental quantitatif qui fait le lien entre la manipulation génétique et le résultat phénotypique dans les modèles de neurodégénérescence.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en reliant l'expression génique (par exemple, aux neurones dopaminergiques) à la fonction locomotrice par des mesures itératives de géotaxie négative.
- Écrantage : Fournit des résultats normalisés prêts à l'analyse (distance d'escalade sur 6 secondes) permettant des comparaisons fiables entre différentes conditions expérimentales.
- Analyse : Produit des données exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM) avec une rigueur statistique (ANOVA à un facteur, correction de Bonferroni) afin de permettre des comparaisons entre groupes et des tests de significativité.
- Recherche translationnelle : Relie les mesures comportementales aux mécanismes neurodégénératifs, facilitant une évaluation phénotypique alignée sur les biomarqueurs dans les modèles précliniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour l'écrantage comportemental longitudinal couvrant plusieurs génotypes, âges et groupes de traitement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à un phénotypage comportemental quantifiable et à haute résolution.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par une synchronisation automatisée, un enregistrement numérique et une analyse assistée par logiciel.
- Valeur stratégique : Renforce l'efficacité des décisions d'aller/arrêt en permettant une évaluation rapide des déficits locomoteurs sur de grands échantillons.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur des données solides de progression phénotypique dépendante de l'âge.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de Drosophila, le maintien de croisements génétiques et la mise en place de tests comportementaux.
- Dépend d'un équipement spécialisé comprenant l'appareil RING automatisé, un contrôleur pas à pas, une caméra numérique et un éclairage compatible.
- Requiert une infrastructure informatique pour l'importation de vidéos, l'extraction d'images fixes et l'utilisation du logiciel RflyDetection.
- Implique la standardisation des conditions environnementales (25°C, 70 % d'humidité, cycle lumière/obscurité de 12 h) et des protocoles de préparation des tubes.
- Comprend des considérations de sécurité liées aux composants électriques ; l'appareil doit être sécurisé et vérifié avant toute utilisation.
