Name: Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Apprenez à produire des anticorps monoclonaux humains entièrement humains à partir de lymphocytes B circulants dans le sang. Cette méthode permet d'isoler des cellules rares et de générer des anticorps capables de discriminer des antigènes étroitement liés pour des applications en immunothérapie.

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Nous remercions la Cytometry Facility « CytoCell » (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) d’assistance technique d’experts. Nous remercions également tout le personnel de production de protéines recombinantes (P2R) et des plates-formes des IMPACT (INSERM 1232, Santé SFR, Biogenouest, Nantes) pour leur soutien technique. Nous remercions Emmanuel Scotet et Richard Breathnach pour des commentaires constructifs sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet IHU-Cesti, financé par le gouvernement Français « Investissements d’avenir », géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire. Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme IGO LabEX pris en charge par l’Agence nationale de la recherche par l’intermédiaire de l’investissement du futur programme ANR-11-LABX-0016-01.

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<li>Hamilton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Approach+for+Tetramer-Based+Identification+of+Autoantigen-Reactive+B+Cells%3A+Characterization+of+La-+and+snRNP-Reactive+B+Cells+in+Autoimmune+BXD2+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice.</a> J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le projet de protocole est une méthode puissante pour la production d’ACM humains directement à partir de cellules spécifiques Ag B circulant dans le sang. Il combine trois aspects importants : (i) l’utilisation d’un enrichissement magnétique tétramère-associés, qui permet une isolation ex vivo des cellules de B de liaison Ag même rares ; (ii) une stratégie de blocage qui utilise trois tétramères Ag (deux des plus pertinentes et un non pertinent) étiquetés avec trois fluorochromes différents d’isoler, par cytomé...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

La méthode décrite ici permet la production rapide et versatile de pleinement humains anticorps monoclonaux (ACM) contre un antigène désiré (Ag). mAbs sont des outils essentiels dans beaucoup de demandes de recherche fondamentale in vitro et in vivo: flow cytometry, histologie, expériences western-blot et blocage par exemple. En outre, mAbs sont utilisés plus en médecine pour traiter les maladies auto-immunes, cancer et de contrôler le rejet de greffe1. Par exemple, ACM anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) ont été récemment utilisés comme inhibiteurs de point de contrôle immunitaire cancer traitements2.
Le mAbs première ont été produit par les immunoglobulines (Ig)-sécrétant des hybridomes obtenus des cellules spléniques de souris immunisées ou de rats. Cependant, la forte réponse immunitaire contre ACM murin ou rat entrave leur utilisation thérapeutique chez l’humain, en raison de leur apurement rapide et l’induction probable d’hypersensibilité réactions3. Pour résoudre ce problème, des séquences de protéines animales du mAbs ont été partiellement remplacées par humain pour produire ce qu’on appelle anticorps chimériques de souris-humain ou humanisés. Toutefois, cette stratégie ne diminue que partiellement immunogénicité, tout en augmentant considérablement le coût et les délais de production. Une meilleure solution consiste à générer le mAbs humaine directement à partir de cellules B humaines et il existe plusieurs stratégies pour cela. L’un d’eux est l’utilisation de l’affichage bactériophage ou de la levure. Cela implique l’affichage variables domaines auprès d’une bibliothèque combinatoire d’aléatoire Ig humaine lourde et des chaînes de lumière sur les phages ou levures et effectuer une étape de sélection à l’aide de l’antigène spécifique d’intérêt. Un inconvénient majeur de cette stratégie est que les chaînes lourdes et légères sont aléatoirement associés, conduisant à une augmentation très importante de la diversité des anticorps générés. Les anticorps obtenus ne devraient pas correspondent à celles qu’induirait une réponse immunitaire naturelle contre une Ag particulier. En outre, le repliement des protéines humaines et modifications post-traductionnelles ne sont pas systématiquement reproduites chez les procaryotes ou même chez les levures. Une deuxième méthode de production de mAb humaine est l’immortalisation des cellules B humaines naturelles, par infection à virus Epstein - Barr ou expression des facteurs anti-apoptotique BCL-6 et BCL-XL4. Toutefois, cette méthode est applicable uniquement aux cellules B mémoire et est inefficace, exigeant que le dépistage des nombreux mAb immortalisées B cellules productrices d’identifier les clones mAb peu (ou pas) avec la spécificité antigénique désirée. La méthode est donc coûteuses et chronophages.
Un nouveau protocole a été décrite récemment pour la production du mAbs humaine de simple isolé de cellules B5. Elle s’appuie sur une optimisée unicellulaires Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour l’amplification des deux la lourds - et chaînes légères encodage des segments d’une seule cellule B triée. Il est suivi par le clonage et l’expression de ces segments dans un système d’expression eucaryote, permettant ainsi la reconstitution d’un mAb pleinement humain. Ce protocole a été utilisé avec succès à partir de cellules de B de donneurs vaccinés. Les cellules ont été récoltées plusieurs semaines après la vaccination pour obtenir des fréquences plus élevées des lymphocytes B dirigés contre le Ag souhaitée et de limiter ainsi le temps nécessaire pour le dépistage de6. Autres mAbs pleinement humaines ont également été produites de patients7 et mélanome les patients infectés par le VIH+ (Virus de l’immunodéficience humaine)8. Malgré ces avancées, toujours aucune procédure n’est disponible que permet l’isolement Ag spécifiques de cellules de B indépendamment de leur phénotype mémoire ou la fréquence.
La procédure décrite ici conduit à l’isolement efficace ex vivo de cellules B circulantes humaines fondée sur leur spécificité BCR, suivie par la production de pleinement humain mAbs antigène-spécifiques dans le rendement élevé et avec un temps de projection basse. La méthode ne se limite pas aux cellules B mémoire ou les cellules B sécrétant des anticorps induits après une immuno-réaction, mais peut également être appliquée pour le répertoire de cellules B naïves humaines. Qu’il fonctionne même à partir de cellules de B Ag spécifiques présents à très basses fréquences est une bonne indication de son efficacité. Le principe de la méthode est la suivante : les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont colorées avec deux tétramères présentant l’antigène d’intérêt, chacun marqué avec un fluorochrome différent (p. ex., phycoérythrine (PE) et Allophycocyanin (APC)), et un troisième tétramère présentant un antigène étroitement apparenté conjugué avec un fluorochrome tiers (p. ex., Brillant Violet 421 (BV421)). Pour enrichir pour cellules de liaison de l’antigène, les cellules sont ensuite incubées avec perles recouvertes d’anti-PE et Abs anti-APC et triés dans les colonnes de séparation cellulaire. La fraction de cellules APC PE+ + est sélectionnée, colorées avec une variété de mAbs spécifiques pour différents types de cellules PBMC permettre l’identification des cellules B et soumis à l’écoulement cytometry cellule Tri. Les lymphocytes B qui sont PE+ et APC+, mais brillant Violet-, sont isolés. Cette étape sélectionne dans les cellules qui ne sont pas des cellules B ou ne se lient pas à l’antigène tétramères, mais faire un bind PE ou APC (ces cellules sera PE+ – d’APC ou PE– APC+) ou à la partie non-antigène des tétramères utilisé (ces les cellules seront BV421+). Cellules B pas très spécifiques pour l’épitope d’intérêt sont également Counter-sélectionnés à cette étape (ces cellules seront également BV421+). Ainsi, cette méthode peut purifier hautement spécifique B cellules exprimant des récepteurs de B-cellule (RCO) capables de distinguer les deux antigènes très étroitement apparentées. Des cellules de B spécifiques uniques sont recueillis dans des tubes et leurs ADNc amplifié par PCR Ig (complémentaires acides désoxyribonucléiques) cloné et exprimé par une lignée cellulaire humaine comme sécrétées IgG mAbs.
Comme une preuve de concept, cette étude décrit la génération efficace du mAbs humaine, qui reconnaît un peptide présenté par une classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-je) molécule et peut distinguer ce peptide et d’autres peptides chargés sur le même MHC-j’ai allèle. Même si le niveau de complexité de cette Ag est important, cette méthode (i) permet la récupération de rendement élevé du mAbs Ag spécifiques ; (ii) la production du mAbs capables de distinguer deux Ags structurellement proches. Cette approche peut être étendue aux patients vaccinés ou infectés sans aucune modification du protocole et a également déjà été implémentée avec succès dans un système de rat humanisé9. Ainsi, cette étude décrit une approche polyvalente et efficace pour générer des mAbs entièrement humains qui peut être utilisés en immunothérapie et de la recherche fondamentale.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire HEK 293A</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate Saline Tamponné (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylènediaminetétraacétique) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - séparation des lymphocytes densité moyenne</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>streptavidine R-phycoérythrine conjuguée</td><td>Invitrogen par Life Technologies</td><td>S21388</td><td>premiun grade 1mg/ml contient 5mM d’azoture de sodium</td></tr><tr><td>Streptavidine, allophycocyanine conjuguée</td><td>Invitrogen par thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM azide premium grade</td></tr><tr><td>Violet brillant 421 streptavidine</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Microbilles magnétiques conjuguées anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles magnétiques conjuguées anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs ou QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Dilution usagée 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Dilution usagée 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Dilution usagée 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Dilution usagée 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Dilution d’occasion 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR à 8 bandelettes</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks pour 96 microtubes</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inhibiteur de la ribonucléase (recombinant)</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>qté :5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Eau distillée Dnase/Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Hexamères aléatoires</td><td>Invitrogen par thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>qté : 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase inverse</td><td>Invitrogen par thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>qté : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymérase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, Biologie moléculaire grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Capteurs avancés</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Capteurs avancés</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces extérieures - Amorces avancées</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces externes -Amorces inverses pour Ig- Bactéries Dépistage PCR</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Premier tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces externes -Amorces inverses pour Ig humaines</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTAGCTGTTGGAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes -Amorces avant</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes -Amorces directes</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT Deuxième</td><td>tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGAGCTGCAGCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification de chaînes lourdes - Amorces internes - Amorces inversées</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces extérieures -Amorces directes</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces externes -Amorces inverses- Dépistage PCR des bactéries</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash ; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACACAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces</td></tr><tr><td>avant 5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces directes</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes - Amorces avant</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces internes -Amorces avant</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères k - Amorces intérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Forward amorces</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces avant</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères & lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Amorces directes</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td></td><td>Eurofins CACCAGTGTCC TTGTTGGCTTG</td><td>Premier tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces extérieures -Forward amorces</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes - amorces avant</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Deuxième tour de PCR - Amplification des chaînes légères &lambda ; - Amorces internes -Amorces inverses - Dépistage PCR des bactéries</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Dépistage PCR des bactéries</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Biologie moléculaire Grade</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plaque</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Numéro d’enregistrement Genbank FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Numéro d’enregistrement Genbank FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Adhésion Genbank nombre FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>Invitrogen par thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Plasmid ADN, ARN et purification des protéines</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI Réactif de transfection d’ADN</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Fond platPlaque à 96 puits</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en V à 96 puits</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 flacons</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT tampon d’enrobage</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp fond plat 96 puits Plaques ELISA</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>liaison protéique</td></tr><tr><td>élevée IgG Ab anti-humain conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>Substrat TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap protein A colonne HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus Système de chromatographie</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène b circulant dans le sang

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Anticorps monoclonaux (ACM) sont de puissants outils utiles pour les deux la recherche fondamentale et en biomédecine. Leur spécificité élevée est indispensable lorsque l’anticorps doit faire la distinction entre les structures fortement connexes (p. ex., une protéine normale et une version mutée de celle-ci). La façon actuelle de générer ces mAbs discriminatif implique une vaste sélection de multiples cellules productrices de Ab B, qui est coûteux et fastidieux. Nous vous proposons ici une méthode rapide et rentable pour la génération de discriminatoire, mAbs entièrement humain à partir de sang humain, les lymphocytes B circulants. L’originalité de cette stratégie est due à la sélection des cellules de liaison B antigène spécifique combinée à la Counter-sélection de toutes les autres cellules, à l’aide de facilement disponible Peripheral Blood mononucléaires cellules (PBMC). Une fois que les cellules B spécifiques sont isolés, cDNA (l’acide désoxyribonucléique complémentaire) séquences codant pour le mAb correspondant sont obtenus utilisant la technologie de cellule unique Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) et par la suite exprimé en homme cellules. Dans aussi peu que 1 mois, il est possible de produire des milligrammes de hautement discriminatoires mAbs humain dirigé contre pratiquement n’importe quel antigène désiré naturellement détectée par le répertoire des cellules B.

À partir de PBMC de donneurs sains, ce présente projet la génération du mAbs humaine, qui reconnaît le peptide Pp65495 (Pp65, du cytomégalovirus humain) présentés par la classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-I) molécule HLA - A * 0201 () HLA-A2). Ces mAbs peuvent distinguer entre ce complexe et complexes qui représentent les autres peptides chargés sur le même MHC-I molécule.
PBMC ont été colorées avec HL...

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

L’objectif global de cette procédure est de produire des anticorps monoclonaux entièrement humains contre un antigène souhaité à partir des lymphocytes B humains circulant dans le sang. Ce protocole permet de générer des anticorps monoclonaux capables de distinguer des antigènes hautement apparentés. Pour certaines applications telles que l’immunothérapie, un ciblage précis d’un antigène peut être indispensable.Les avantages de cette technique sont qu’elle peut être réalisée à partir du sang de donneurs sains ou immunisés et permet d’isoler même des lymphocytes B rares se liant à l’antigène. Bien que cette méthode soit décrite à partir d’échantillons humains, elle peut également être appliquée aux animaux qui peuvent être pré-immunisés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la procédure est en réalité soumise à une stratégie de contrôle analytique multiple assez complexe de lymphocytes B discriminés.La procédure sera effectuée par Melinda. C’est une assistante ingénieur de notre laboratoire. Première pipette de 35 millilitres de suspension cellulaire diluée sur 15 millilitres de gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, placez le tube conique dans un rotor à godets pivotants avec les freins désactivés et centrifugez à 1290 fois la gravité pendant 25 minutes à température ambiante. Ensuite, à l’interface du milieu à gradient de densité et de la couche de plasma, aspirez soigneusement la couche de cellule mononucléaire et transférez-la dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajoutez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 460 fois la gravité pendant cinq minutes.Ensuite, mettez à nouveau la pastille en suspension dans 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate avec 2 % de sérum bovin fœtal. Ajouter les tétramères conjugués à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Bien mélanger puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans la hotte à flux laminaire, à l’abri de la lumière.Ajoutez ensuite 10 millilitres de tampon de séparation cellulaire glacé à la suspension cellulaire. Centrifugez la suspension cellulaire à 460 fois la gravité pendant cinq minutes. À la pastille cellulaire obtenue, ajoutez 500 microlitres de tampon de séparation cellulaire glacé et 50 microlitres de deux variantes de microbilles magnétiques et incubez la suspension cellulaire pendant 20 minutes.Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule dans un tampon de séparation de cellules glacial. Transférez soigneusement la suspension de la cellule sur le dessus d’une colonne équilibrée et laissez-la s’écouler complètement. Rincez ensuite le tube avec trois millilitres de tampon de séparation cellulaire et transférez le tampon dans la colonne.Après avoir rincé la colonne trois fois, retirez-la de l’aimant et placez-la sur un tube collecteur conique de 25 millilitres. Après avoir ajouté cinq millilitres de tampon de séparation glacé sur le dessus de la colonne, rincez rapidement les cellules de la colonne à l’aide d’un piston. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un cocktail d’anticorps anti-humains et de 7AAD dans un volume total de 100 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate avec 2 % de sérum bovin fœtal.Ensuite, incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, utilisez un cytomètre de tri de cellules pour trier des lymphocytes B spécifiques au niveau de la cellule unique, sans dépasser 1 000 événements par seconde. Ensuite, collectez les lymphocytes B triés individuellement dans des tubes PCR à 8 bandelettes préalablement remplis de 10 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X et de 10 unités d’inhibiteur de RNAse et placez-les sur un support pour 96 microtubes.Congelez rapidement les tubes à moins 80 degrés Celsius. Chauffez les échantillons congelés dans un bain sec maintenu à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes pour lyser les cellules. Placez ensuite la bande sur de la glace et commencez à constituer le master-mix de transcription inversée.Une fois que le master-mix de transcription inverse est préparé, programmez les instructions du thermocycleur. À la fin de la transcription inverse, effectuez des PCR imbriquées pour amplifier les gènes des immunoglobulines. Identifiez les clones positifs en visualisant sur un gel d’agarose à 1,5 % la migration d’un produit PCR à 500 paires de bases pour les segments variables à chaîne lourde et codante et d’un produit PCR à 350 paires de bases pour les segments d’encodage à chaînes légères variables.Ajoutez un microlitre du produit de clonage à 45 microlitres de cellules E. coli TOP10 électrocompétentes. Électroporate. Ajoutez ensuite rapidement 500 microlitres de milieu 2X YT dans les cellules et incubez dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Étalez les bactéries transformées sur une plaque d’ampicilline 2X YT.Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, installez un prémélange réactionnel et ajoutez-en 25 microlitres dans un tube PCR à 8 bandes maintenu sur de la glace. Ensuite, utilisez un cure-dent stérile pour cueillir les colonies et strier les colonies sur la plaque d’ampicilline 2X YT.Ensuite, trempez les cure-dents dans le tube de réaction PCR. Identifiez les clones positifs en visualisant sur un gel d’agarose à 1,5 % la migration d’un produit PCR à 850 paires de bases pour le vecteur à chaîne lourde et d’un produit PCR à 600 paires de bases pour le vecteur à chaînes légères. Dans deux millilitres de milieu LB, inoculer quatre colonies positives.Incuber l’inoculer à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 200 tours par minute en secouant. Ensemencez 15 000 cellules rénales embryonnaires humaines dans 200 microlitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits un jour avant la transfection. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 5 % de dioxyde de carbone.Cotransfectez les cellules à l’aide d’un réactif de transfection dérivé de la polyéthylénamine linéaire. Diluez 0,5 microlitre de réactif de transfection d’ADN avec 10 microlitres de 150 millimolaires de chlorure de sodium. Ensuite, diluez 0,125 microgramme de chaque chaîne lourde et légère variable exprimant des vecteurs dans 10 microlitres de chlorure de sodium de 150 millimolaires.Vortex toutes les dilutions pendant 10 secondes chacune. Ensuite, mélangez le réactif de transfection d’ADN préalablement dilué avec 10 microlitres de solution d’ADN. Agitez rapidement le mélange de transfection de l’ADN pendant 15 secondes et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.Ajoutez le mélange de transfection d’ADN goutte à goutte sur les cellules, puis faites tourner doucement la plaque. Replacez le milieu 16 heures après la transfection et cultivez les cellules pendant cinq jours dans un milieu sans sérum à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour aspirer le surnageant et transférez-le dans la plaque à 96 puits à fond en V.Enduire chaque puits d’une plaque ELISA de 96 puits avec l’antigène pertinent à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans 100 microlitres de tampon de revêtement ELISA reconstitué à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’un surnageant cellulaire transfecté dans les puits d’une plaque ELISA de 96 puits et incubez la plaque pendant deux heures à température ambiante. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps anti-immunoglobuline G humaine conjugués à l’enzyme peroxydase de raifort à une concentration d’un microgramme par millilitre et incubez le puits à température ambiante pendant une heure.Enfin, ajoutez 50 microlitres de substrat chromogène dans le puits et incubez pendant encore 20 minutes. À la fin de l’incubation, lecture de la densité optique à 450 nanomètres sur un spectrophotomètre. Pour isoler les lymphocytes B spécifiques, une stratégie de contrôle a été utilisée qui discriminait les récepteurs exprimant les lymphocytes B contre le complexe HLA-A2/Pp65.Initialement, les cellules étaient CD19 positives, CD3 négatives. Enfin, les cellules ont été colorées à la fois avec HLA-A2/Pp65PE et HLA-A2/Pp65APC, mais pas avec les tétramères HLA-A2/MelABV421, qui ont été contrôlés pour obtenir les lymphocytes B hautement spécifiques. En utilisant cette stratégie de déclenchement, des lymphocytes B sélectifs peuvent être isolés, qui peuvent différencier HLA-A2/Pp65 et d’autres complexes peptidiques HLA-A2 apparentés.Ensuite, pour étudier la présence d’anticorps PC1.02 contre le tétramère HLA-A2/Pp65, un test ELISA a été effectué. Dans le diagramme à barres obtenu, l’axe des y correspond aux lectures de densité optimales et l’axe des x correspond aux peptides HLA-A2. D’après le test, il montre qu’un anticorps monoclonal se lie au tétramère HLA-A2/Pp65 de manière dépendante du peptide et du complexe majeur d’histocompatibilité.Ensuite, la résidence de la plasmine de surface a été utilisée pour étudier l’affinité de liaison de l’anticorps PC1.02. Ensuite, des données tabulaires ont été obtenues pour analyser les lymphocytes B spécifiques de HLA-A2/Pp65. L’impact de la stratégie d’exclusion des lymphocytes B non spécifiques, les rendements de l’amplification du gène des immunoglobulines et la production d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques HLA-A2/Pp65 ont été mis en évidence.Une fois maîtrisée, la technique allant de l’isolement de lymphocytes B spécifiques d’antigènes dans le sang humain à la production d’anticorps monoclonaux peut être réalisée en aussi peu qu’un mois. Lors de l’exécution de cette procédure, n’oubliez pas de passer directement du tri des lymphocytes B à la RT-PCR sans faire de pause.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une méthode de génération d’anticorps à partir de cellules de mammifères en introduisant des vecteurs plasmidiques avec des gènes à chaîne lourde et légère. Ces vecteurs interagissent avec la polyéthylénimine et pénètrent dans les cellules en formant des polyplexes ; Plus tard, ils sont traduits en protéines individuelles et assemblés en anticorps complets, qui sont sécrétés dans le milieu extracellulaire.

Génération d’anticorps monoclonaux recombinants à partir de cultures de cellules de mammifères

La vidéo montre une technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène. Des vecteurs d’expression eucaryotes codant pour les chaînes lourdes et légères d’anticorps, clonés à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène isolés, sont introduits dans des cellules de mammifères à l’aide de polyplexes. Une fois à l’intérieur des cellules, ces vecteurs subissent une traduction, et les peptides à chaîne lourde et légère qui en résultent...

Technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène

Cet article décrit une méthode de génération et de propagation de clones de lymphocytes T humains qui répondent spécifiquement à un alloantigène défini. Ce protocole peut être adapté pour le clonage de lymphocytes T humains spécifiques à une variété de ligands peptide-CMH.

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La synthèse d’anticorps monoclonaux humains est la première étape des études visant à démêler les mécanismes physiopathologiques des réponses immunitaires médiées par les auto-anticorps. Nous avons mis au point un protocole pour générer des anticorps monoclonaux d’immunoglobuline G (IgG) humaines recombinantes à partir de lymphocytes B triés dans le sang, y compris l’isolement de lymphocytes B, le clonage d’anticorps et la synthèse in vitro.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Le sang périphérique humain est couramment utilisé pour l’évaluation de la réponse immunitaire humorale. Ici, les méthodes permettant d’isoler les lymphocytes B humains du sang périphérique, de différencier les lymphocytes B humains en cellules B sécrétant des anticorps (AB) en culture et d’énumérer les ASC IgM et IgG totales via un test ELISpot sont décrites.

L&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

Un protocole optimisé est présenté pour la génération d’anticorps monoclonaux basé sur la technologie des hybridomes. Les souris ont été immunisées avec un immunoconjugué. Les cellules de la rate ont été fusionnées par PEG et une impulsion électrique avec des cellules myélomateuses immortelles. Les cellules d’hybridome productrices d’anticorps ont été sélectionnées par THA et par criblage ELISA spécifique de l’antigène.

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Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.

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La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

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Apprenez à produire des anticorps monoclonaux humains entièrement humains à partir de lymphocytes B circulants dans le sang. Cette méthode permet d'isoler des cellules rares et de générer des anticorps capables de discriminer des antigènes étroitement liés pour des applications en immunothérapie.

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