Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des bactéries intactes et enrichies contenant des phagosomes. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que les changements dans la maturation des phagosomes et le traitement de l’antigène lorsque des micro-organismes pathogènes envahissent les cellules hôtes. Le principal avantage de la technique est qu’elle produit des bactéries de haute qualité contenant des phagosomes en utilisant des étapes simples et sans nécessiter d’équipement spécialisé.

Les personnes novices dans la méthode la trouveraient techniquement accessible par rapport aux non-méthodologies. Nous avons d’abord eu l’idée de développer cette méthode lorsque nous étudiions les mécanismes par lesquels les pathogènes intracellulaires détournent les Phagosomes à leur avantage. La démonstration de cette procédure sera faite par Saray Gutierrez, une post-doc de mon laboratoire.

Pour commencer la culture de Salmonella Typhimurium, utilisez une boucle bactérienne pour inoculer une seule colonie bactérienne dans 5 millilitres de bouillon d’infusion cerveau-cœur. Ensuite, incubez la suspension dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit en secouant. Transférez un millilitre de cette suspension bactérienne dans 19 millilitres de bouillon BHI dans une fiole conique le lendemain.

Incuber à nouveau dans un incubateur à 37 degrés Celsius en secouant. Lorsque l’OD600 atteint un, retirez le flacon de l’incubateur et transférez la culture dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube à 5400 x G à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans 10 millilitres de PBS stérile. Après avoir répété la centrifugation une fois, remettez la pastille en suspension dans 4,9 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de liaison à la biotine fraîchement préparée à la suspension bactérienne.

Après avoir divisé cette suspension en cinq tubes de 1,5 millilitre, incubez dans un bloc thermique à température ambiante avec une agitation constante à 350 tr/min pendant deux heures. Après avoir centrifugé les tubes à 15 000 x G à température ambiante pendant dix minutes, jetez le surnageant. Après deux autres étapes de centrifugation et l’élimination complète de la solution de liaison à la biotine, réinstallez cette bactérie codée à la biotine dans un PBS stérile d’un millilitre dans un seul tube de 1,5 millilitre.

Transférez 100 microlitres de solution de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine dans un tube frais de 1,5 millilitre et placez-le dans un support magnétique pendant cinq minutes. Après avoir retiré le solvant du tube, retirez le tube du rack magnétique. Ensuite, remettez en suspension les billes qui sont restées dans le tube avec un millilitre de suspension bactérienne codée à la biotine.

Incuber le tube sur un bloc thermique à température ambiante pendant une heure en secouant à 350 tr/min. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, retirez les bactéries qui n’ont pas adhéré à la paroi et transférez-les dans un nouveau tube étiqueté bactéries non codées.

Le tube avec des billes magnétiques adhérant à la paroi contient des bactéries codées Biotine Streptavidine. Retirez le tube contenant des bactéries codées en biotine Streptavidine du support magnétique et mettez-le en suspension dans un millilitre de PBS stérile. Une fois que le tube a été sur le support magnétique pendant cinq minutes, retirez le PBS.

Enfin, remettez en suspension les bactéries codées à la biotine Streptavidine lavées dans 500 microlitres de PBS stérile et étiquetez le tube comme bactérie codée. La veille de l’infection, des BMDM entièrement différenciés ont été disposés dans une boîte de six centimètres dans des RPMI complétés par dix pour cent de FBS. Le lendemain, centrifugez la suspension bactérienne codée à 15 000 x G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans un milieu RPMI complété par dix pour cent de FBS. Retirez le milieu des BMDM et ajoutez cinq millilitres de suspension bactérienne codée dans un milieu RPMI afin d’infecter les cellules. Pour synchroniser la phagocytose, incubez à température ambiante pendant dix minutes.

Ensuite, pour initier la phagocytose, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le milieu de la vaisselle et lavez les cellules trois fois à l’IPRP pour éliminer les bactéries non internalisées. Pour tuer toute bactérie non phagocytisée à dix millilitres de RPMI contenant dix pour cent de FBS dans 50 microgrammes par millilitre de gentamicine.

Enfin, incubez les BMDM infectés à 37 degrés Celsius dans un incubateur à cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’au moment souhaité. Tout d’abord, préparez le volume de tampon d’isolement de phagosome A requis en ajoutant du DTT et de la cytochalasine B juste avant l’utilisation et des inhibiteurs de protéase et de phosphatase comme recommandé par le fabricant. Retirez le milieu des cellules infectées au moment souhaité et lavez les cellules avec du PBS stérile préchauffé à température ambiante.

Ajoutez ensuite 750 microlitres de tampon d’isolement de phagosome A dans le plat et incubez sur de la glace pendant 20 minutes. N’oubliez pas de secouer l’assiette de temps en temps. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon d’isolation Phagosome B, puis basculez les plaques pour vous assurer que le tampon recouvre complètement la surface.

Grattez doucement les cellules à l’aide d’un policier en caoutchouc pour retirer les cellules de la parabole et transférez-les dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre. Ensuite, utilisez une seringue d’un millilitre pour faire passer la suspension cellulaire à travers une aiguille de calibre 26 au moins 15 fois. Ensuite, placez la suspension de la cellule sur le support magnétique pendant cinq minutes.

Les particules attachées aux billes magnétiques sont des phagosomes contenant du S. Typhimurium codé. Transférez ensuite la suspension qui contient le reste des composants cellulaires dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté Cytosol. Retirez le tube contenant les phagosomes isolés du rack et remettez-le en suspension dans un millilitre de PBS stérile.

Replacez le tube sur la grille magnétique pendant cinq minutes, puis retirez le PBS. Après avoir répété ce lavage avec du PBS une fois, retirez le PBS et enfin, remettez en suspension S.Typhimurium contenant des phagosomes dans le tampon requis. Pour évaluer l’efficacité de la biotinylation de S. Typhimurium par microscopie confocale, les BMDM ont été infectés par mCherry S.Typhimurium marqué à la biotine.

Après fixation et incubation avec Cy5-Streptavidin, la biotinylation réussie a été confirmée par le signal fluorescent Cy5-Streptavidin. Ce signal a été observé exclusivement chez le mCherry S.Typhimurium biotinylé alors qu’il n’y avait aucun signal chez le mCherry S.Typhimurium non biotinylé. L’analyse immunobloc de phagosomes isolés a montré un enrichissement significatif de mCherry exprimant S.Typhimurium dans les phagosomes par rapport à la fraction cytosolique.

L’analyse immunobloc à l’aide de marqueurs endosomiques et lysosomes chez des phagosomes isolés a montré un enrichissement des marqueurs testés chez les phagosomes isolés quatre heures après l’infection, contre 30 minutes après l’infection. Lorsque ce protocole a été appliqué à Staphylococcus aureus, une biotinylation réussie de la GFP exprimant S. aureus a été démontrée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure et demie selon le temps d’incubation choisi pour l’infection par l’investigateur.

Pour assurer le succès de l’isolement des bactéries contenant des phagosomes, assurez-vous que les tampons contiennent les concentrations indiquées et que les plaques sont secouées pour assurer la couverture homogène des cellules. Soyez également doux lorsque vous grattez les cellules et lorsque vous passez la suspension cellulaire à travers l’aiguille. Suite à cette procédure, d’autres techniques telles que la protéomique ou la métabolomique peuvent être réalisées avec des phagosomes isolés pour étudier l’altération causée par des agents pathogènes sous des facteurs pathogènes impliqués.