Name: Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez une méthode simple pour isoler des phagosomes contenant Salmonella typhimurium à partir de macrophages en utilisant la biotine et la streptavidine. Cette technique accessible permet d'étudier la maturation des phagosomes et le traitement des antigènes en immunologie.

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Recherche au laboratoire de la Robinson est financée par Cologne Cluster d’Excellence sur les réactions de Stress cellulaire dans les maladies Aging-Associated, Université de Cologne, Allemagne (CECAD ; subventionné par la DFG au sein de l’Initiative d’Excellence de la fédérale et gouvernements des États) et les subventions accordées par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune et Maria-Pesch Fondation de l’Université de Cologne (Allemagne).

toutes les étapes impliquant l’utilisation de pathogènes S. Typhimurium doit être effectué dans un BSL-2 ou supérieure installation de niveau de sécurité biologique. La culture et le revêtement de l’art. Typhimurium, ainsi que l’infection des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. L’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes peut être exécutée sur n’importe quel banc de laboratoire BSL-2.
 l’extraction de la moelle osseuse de souris pour sa différenciation en macrophages a été réalisée conformément aux lignes directrices sur le bien-être animal et approuvée par l’Agence d’Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie pour la Nature, Environnement et Protection des consommateurs [Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen ; N° du greffe : 84-02.05.40.14.082 et 84-02.04.2015.A443] et l’Université de Cologne.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>ensemencer S. Typhimurium (Souche SL1344) d’une seule colonie bactérienne dans 5 mL de bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI) en utilisant une boucle bactérienne.</li>
	<li>Incuber la suspension bactérienne dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit, avec agitation.</li>
	<li>Le lendemain, transvaser 1 mL de la suspension bactérienne dans 19 mL de bouillon BHI dans une fiole conique et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation.</li>
	<li>Surveiller l' S. croissance de Typhimurium en mesurant la densité optique (do) à 600 nm (OD 600) avec un spectrophotomètre. Mesures environ chaque 30 min.</li>
	<li>OD lorsque 600 atteint 1,0, retirer une suspension bactérienne de l’incubateur et le transfert en tube de 50 mL. Centrifuger les bactéries à 5 400 g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Supprimer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Centrifuger à 5 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le surnageant et remettre en suspension les bactéries en 4,9 mL de PBS stérile.</li>
</ol> 2. Revêtement de S. typhimurium avec billes magnétiques conjugué NHS-biotine/streptavidine <ol><li>Ajouter 100 µL de 10 mg/mL de biotine reliant solution (NHS-biotine dissous dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) fraîchement préparée, à la suspension bactérienne préparé à l’étape précédente. Par exemple, diluer de 5 mg de NHS-biotine dans 0,5 mL de DMSO stérile. Mélanger correctement en pipettant également monter et descendre plusieurs fois.</li>
	<li>Diviser le mélange en cinq tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Laisser incuber pendant 2 h à température ambiante (RT) sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile, centrifuger à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Répéter l’étape 2.5 deux fois plus pour supprimer complètement la biotine excès reliant solution.</li>
	<li>Après le dernier lavage, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Transférer 100 µL de solution de billes magnétiques conjugué streptavidine 10 mg/mL dans un tube de 1,5 mL et laissez-le sur le support magnétique pendant 5 min.</li>
	<li>Supprimer le solvant avec une pipette, prendre la solution de billes magnétiques conjugué streptavidine-de la grille magnétique et il resuspendre avec 1 mL de suspension bactérienne enduite de biotine préparée à l’étape 2.7.</li>
	<li>Laisser incuber pendant 1 h à RT sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.</li>
	<li>Placer la solution sur la grille magnétique ; attendre 5 min et puis retirez avec une pipette les bactéries qui n’adhèrent pas au mur (Gardez-le dans un tube étiqueté comme &#34; non couché bactéries &#34;). La fraction adhérant à la paroi du tube en contact avec l’aimant est la bactérie biotine-streptavidine.</li>
	<li>Enlever le tube contenant la bactérie étiquetée de la grille magnétique et remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Placer à nouveau sur le support magnétique, attendre 5 min et utilisez une pipette pour supprimer le PBS.</li>
	<li>Répéter les étapes 2.13 et 2.14 deux fois plus pour éliminer toutes les bactéries qui ne sont pas recouvertes de billes magnétiques conjugué streptavidine.</li>
	<li>Après le dernier lavage, remettre en suspension les bactéries recouvertes dans 500 µL de PBS stérile et le tube sous l’étiquette &#34; enduit bactéries &#34;.</li>
	<li>Compter la colonie (UFC) d’unités des deux formant &#34; bactéries non couché &#34; et &#34; enduit bactéries &#34; solutions en ensemençant des dilutions en série sur plaques de gélose BHI. Environ la 2 x 10 8 UFC/mL de bactéries recouvertes sont obtenus à partir de 20 mL de la suspension bactérienne avec OD 600 de 1.0. Garder la suspension bactérienne couché à 4 ° C à utiliser le jour suivant pour infecter les macrophages.</li>
</ol> 3. Infection de BDMDs <ol><li>le jour même où les bactéries sont recouvertes de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine, plaque entièrement différenciés BMDMs 22 dans les plats de 6 cm à une densité de 5 x 10 6 cellules / plat.</li>
	<li>Le lendemain, centrifuger la suspension bactérienne enduit à 15 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) à une concentration de 10 x 10 6 UFC/mL.</li>
	<li>Pour infecter les macrophages à une multiplicité d’infection (MOI) de 10, retirer le support des BMDMs et ajouter 5 mL de suspension bactérienne enduit préparée. MOI optimale peut être évalué pour chaque type de cellule ou but expérimental des phagosomes isolés.</li>
	<li>Incuber à ta pendant 10 min pour synchroniser phagocytose.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve à 2 CO 5 % pendant 30 min à ouvrir la phagocytose. Autres types de cellules peuvent nécessiter des temps d’incubation différents afin d’assurer l’internalisation des bactéries.</li>
	<li>Enlever le support contenant des bactéries de la vaisselle et laver les cellules avec RPMI trois fois pour éliminer les bactéries non intériorisé.</li>
	<li>Enfin ajouter 10 mL de milieu RPMI contenant 10 % de SVF et 50 µg/mL de gentamycine pour tuer toutes les bactéries non-phagocytose.</li>
	<li>Incuber les BMDMs infectés à 37 ° C, avec 5 % de CO 2 jusqu'à ce que le point de la durée désirée. Le point de la durée souhaitée doit être déterminé expérimentalement selon les bactéries et cellules du type utilisé et le but de l’analyse. Pour l’étude des événements de fusion phagosome-endosome précoce en S. Typhimurium infectés par BMDMs, il est recommandée d’une incubation de 30 min. Pour l’analyse des événements ultérieurs, les phagosomes peuvent être extraites après 2 h ou 4 h d’incubation. Incubation prolongée des macrophages avec S. Typhimurium au-delà de 24h entraîne la mort des macrophages. Avant l’extraction du phagosome pourrait probablement mener à la dégradation des molécules de biotine a étendu l’infection intracellulaire. Cependant, nous n’avons pas observé perte de biotine sur enduit-bactéries jusqu'à 24 h.</li>
</ol> 4. Isolement de S. Typhimurium-contenant des Phagosomes tampon d’isolement <ol><li>Prepare le volume du phagosome requis un (50 mM tuyaux, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) en ajoutant le dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 1 mM, la cytochalasine B vers une finale concentration de 10 µM et protéase et phosphatase des inhibiteurs tel que recommandé par le fabricant. 
	NOTE : TNT et cytochalasine B doivent être ajoutés pour les tampons d’isolement phagosome A toujours immédiatement avant leur utilisation. Cytochalasine B perturbe le cytosquelette, faciliter la rupture de la membrane cellulaire.</li>
	<li>Au moment voulu pointer, retirer le support des cellules infectées et laver avec du PBS stérile réchauffée à RT.</li>
	<li>Ajouter 750 µL de phagosome isolation tampons A par plat et incuber 20 min sur la glace. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume des tampons d’isolement A doit être ajusté proportionnellement.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de tampon d’isolement phagosome B (tubes de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM de Mannitol et saccharose 68 mM). Roche la plaque pour faire en sorte que la mémoire tampon atteint la surface complète du plat. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume de tampon isolation B doit être ajusté proportionnellement.</li>
	<li>Enlever les cellules de la capsule en grattant doucement à l’aide d’une spatule en caoutchouc et transférez-les sur un tube préalablement réfrigérées 1,5 mL.</li>
	<li>Passer la suspension cellulaire à travers une aiguille 26G à l’aide d’une seringue de 1 mL au moins 15 fois (une aspiration plus une éjection des suspension de globules en une seule fois). C’est assez pour libérer le contenu cytosolique de BMDMs. Le nombre de passes par l’intermédiaire de l’aiguille doit être optimisé pour chaque type de cellule.</li>
	<li>Placer la suspension cellulaire sur la grille magnétique et attendre 5 min. Les particules attachées à l’aimant sont les phagosomes contenant couché - S. Typhimurium. La suspension contient le reste des composants cellulaires.</li>
	<li>Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL étiqueté comme &#34; cytosol &#34;.</li>
	<li>Retirer le tube avec les phagosomes isolés de la grille magnétique et les remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Placer la suspension phagosome sur la grille magnétique, attendre 5 min et retirer le PBS.</li>
	<li>Répéter les étapes 4.9 et 4.10 pour laver l' isolé S. Typhimurium-contenant des phagosomes.</li>
	<li>Enfin supprimer les PBS et remettre en suspension les phagosomes dans la mémoire tampon requise, par exemple, dans une immunoprécipitation (RIPA) tampon pour l’analyse des protéines. Environ 50-200 µg de protéine est obtenue par l’échantillon suivant ce protocole, selon le montant initial des cellules et le ministère de l’intérieur de l’infection.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une nouvelle méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes en enduisant les bactéries avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine est décrite ici. Après perturbation douce de la membrane cellulaire, phagosomes contenant des bactéries peuvent être facilement extraites à l’aide d’un support magnétique. Nous montrons que l’étiquetage des bactéries conserve la capacité de l’agent pathogène d’induire une inflammation et n’altère pas la propriété phagocytaire de la cellule hôte....

Macrophages circulent des cellules phagocytaires spécialisées qui détectent, engloutissent et dégradent toute particule étrangère présente dans les tissus périphériques, allant des cellules apoptotiques à envahir les micro-organismes comme les bactéries. Dès la surface médiée par les récepteurs de reconnaissance de marqueurs spécifiques pathogène communément présentes à la surface des microorganismes (appelés profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés ou PAMPs), macrophages initier une réorganisation complexe de la membrane cellulaire en afin d’entourer et de phagocyter l' agent pathogène1.
L’agent pathogène phagocytée figure ensuite par les macrophages dans une vésicule intracellulaire appelé phagosome. Grâce à une série de fusion et d’événements de fission avec autres vésicules comme endosomes et les lysosomes, le phagosome contenant des agents pathogènes acquiert un ensemble de protéines nécessaires à l’élimination du contenu phagosome. Par conséquent, la composition enzymatique du phagosome est très variable au cours de ce processus, appelé phagosome maturation2.
Peu de temps après la phagocytose, les multimères complexe ATPase vacuolaire (v-ATPase) est incorporé dans la membrane du phagosome par fusion avec les endosomes3. Ce complexe utilise l’ATP aux protons de la pompe du cytosol vers la lumière du phagosome4. L’acidification du phagosome est essentielle pour les événements de fusion avec d’autres vésicules5 et pour l’activation d’un grand nombre d’enzymes de dégradation dépend du pH6. Un autre complexe enzymatique multimériques qui est rapidement monté sur la membrane du phagosome est le complexe NADPH oxydase (NOX). NOX complexe oxyde NADPH afin de produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont sécrétés dans la lumière du phagosome et qui contribuent significativement à la mise à mort des micro-organismes ingérés7.
Pendant les premières étapes de maturation, phagosomes présentent marqueurs généralement comme Rab5 et Rab7 des endosomes précoces et tardifs respectivement avec la sous-unité de0 V de la v-ATPase8. Fusion des phagosomes avec les lysosomes et endosomes fin se traduit par l’exposition de l’agent pathogène phagocyté à une grande variété d’enzymes hydrolytiques telles que la cathepsine protéases, lipases et9de la β-galactosidase. L’acidification de la lumière est également nécessaire pour l’activation de ces enzymes. Par exemple, le clivage de la cathepsine D pour produire la forme abrégée active est dépendante du pH10. Ces enzymes dégradent l’agent pathogène et agir comme médiateur de la production de peptides courts pathogène dérivées qui sont présentés par les macrophages majeur d’histocompatibilité (MHC) classe II des molécules complexes de lymphocytes T pour déclencher une réponse immunitaire adaptative11.
Par conséquent, maturation phagosome est cruciale pour la réponse immunitaire innée et relie les bras innées et adaptatives du système immunitaire. C’est sans surprise que les pathogènes ont évolué des stratégies pour surmonter l’élimination par les macrophages à travers le processus décrit ci-dessus de la maturation du phagosome. Par exemple, la bactérie intracellulaire, Mycobacterium tuberculosis et Legionella pneumophila empêche la maturation phagosome par Assemblée de v-ATPase inhibiteur et lumen conséquente l’acidification12,13 . D’autres bactéries, comme Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induisent la formation de pores dans la membrane du phagosome s’échapper dans le cytosol14,15. En revanche, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) est capable de modifier les propriétés du phagosome dans la vacuole pour le transformer en un endroit approprié pour sa réplication16. Cette capacité en fait S. typhimurium un modèle très intéressant pour étudier les interférences induite par l’agent pathogène de la maturation du phagosome.
S. typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les phagosomes17. Certains rapports ont décrit précédemment S. Typhimurium-phagosomes contenant présentent à thé pour les endosomes et les lysosomes18, et autres études ont révélé la fusion phagosome-lysosome empêchée sur S. Typhimurium infection19.
Au départ, phagosome maturation sur S. Typhimurium infection a été étudiée par microscopie d’immunofluorescence. Le développement des techniques d’isolement de bactéries contenant les phagosomes a permis une étude plus précise du contenu en termes de marqueurs endosome et lysosome phagosome. À ce jour, la principale méthode utilisée pour l’isolement des bactéries contenant les phagosomes est le fractionnement subcellulaire le saccharose étape dégradés18,20. Toutefois, cette méthode nécessite plusieurs étapes de centrifugation qui peuvent causer des dommages mécaniques aux phagosomes, peuvent influer sur la stabilité des composants phagosome (protéines et lipides) et prend du temps. En outre, il nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse : une pièce d’équipement spécialisé qui n’est pas accessible pour tous les laboratoires.
Récemment, une nouvelle approche a été appliquée à l’isolement bactérien contenant des phagosomes, dans lequel les bactéries pathogènes sont étiquetés avec lipopetide biotinylé (Lipobiotin) et plus tard extraite à l’aide de billes magnétiques conjugué streptavidine21 . Nous vous proposons une méthode alternative complémentaire par marquage bactériennes surfaces contenant des amines macromolécules avec NHS-biotine suivie de billes magnétiques conjugué streptavidine. Les phagosomes obtenus par cette méthode sont fortement enrichis en marqueurs endosome et lysosome et peuvent être utilisés pour un large éventail de tests, de l’analyse de la protéine à omics analyse. En outre, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé comme ultracentrifugeuses. De plus, en éliminant les étapes de centrifugation, les dommages mécaniques aux phagosomes tant la quantité de temps employé sont réduites considérablement. Cette méthode peut être facilement adaptée pour l’isolement des phagosomes contenant d’autres bactéries telles que les Gram positif Staphylococcus aureus, également inclus dans ce manuscrit. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est un simple, rentable, et moins de temps que l’isolation classique de saccharose gradient-ultracentrifugation, rendu hautement enrichi phagosomes contenant des bactéries.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protéase et Phosphatase cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL ou DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotomètre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Boucle bactérienne (10&micro ; l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Sérovar de Salmonella enterica Typhimurium SL1344</td><td>Institut Leibniz Collection allemande de micro-organismes et de cultures</td><td></td><td></td>cellulaires</tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr> anticorps <tr><td>anti-bêta-actine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-mCherry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Rab5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Rab7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-v-ATPase (V0)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-v-ATPase (V1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-cathepsine D</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Tomm20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-calnexine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les vésicules appelés phagosomes afin d’être dégradée. Isolement de S. Typhimurium-phagosomes contenant ont été largement utilisées pour étudier comment S. Typhimurium infection modifie le processus de maturation du phagosome pour empêcher la dégradation bactérienne. Classiquement, l’isolement des bactéries contenant les phagosomes a été réalisée par centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, ce processus prend du temps et nécessite un équipement spécialisé et une certaine dextérité. Décrite ici est une méthode simple et rapide pour l’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec des billes magnétiques conjugué streptavidine-biotine. Les phagosomes obtenus par cette méthode peuvent être suspendus dans un buffer quelconque de choix, ce qui permet l’utilisation des phagosomes isolés pour un large éventail de tests, tels que l’analyse de protéines, lipides et métabolite. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est précis, efficace, rapide, nécessite l’équipement minimal et est plus souple que la méthode classique d’isolement par gradient de saccharose-ultracentrifugation.

Isolement des bactéries contenant les phagosomes par ce protocole requiert la biotinylation des bactéries dans un premier temps. Nous avons donc évalué l’efficacité de l’art. Typhimurium biotinylation par analyse de microscopie confocale de BMDMs infecté par biotinylé mCherry -S. typhimurium marquées avec la Streptavidine-Cy5. Brièvement, les BMDMs étaient infectés comme décrit dans le présent protocole avec mCherry -S. Typhimurium bio...

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour l’isolement de Salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec biotine et streptavidine.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des bactéries intactes et enrichies contenant des phagosomes. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que les changements dans la maturation des phagosomes et le traitement de l’antigène lorsque des micro-organismes pathogènes envahissent les cellules hôtes. Le principal avantage de la technique est qu’elle produit des bactéries de haute qualité contenant des phagosomes en utilisant des étapes simples et sans nécessiter d’équipement spécialisé.Les personnes novices dans la méthode la trouveraient techniquement accessible par rapport aux non-méthodologies. Nous avons d’abord eu l’idée de développer cette méthode lorsque nous étudiions les mécanismes par lesquels les pathogènes intracellulaires détournent les Phagosomes à leur avantage. La démonstration de cette procédure sera faite par Saray Gutierrez, une post-doc de mon laboratoire.Pour commencer la culture de Salmonella Typhimurium, utilisez une boucle bactérienne pour inoculer une seule colonie bactérienne dans 5 millilitres de bouillon d’infusion cerveau-cœur. Ensuite, incubez la suspension dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit en secouant. Transférez un millilitre de cette suspension bactérienne dans 19 millilitres de bouillon BHI dans une fiole conique le lendemain.Incuber à nouveau dans un incubateur à 37 degrés Celsius en secouant. Lorsque l’OD600 atteint un, retirez le flacon de l’incubateur et transférez la culture dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube à 5400 x G à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans 10 millilitres de PBS stérile. Après avoir répété la centrifugation une fois, remettez la pastille en suspension dans 4,9 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de liaison à la biotine fraîchement préparée à la suspension bactérienne.Après avoir divisé cette suspension en cinq tubes de 1,5 millilitre, incubez dans un bloc thermique à température ambiante avec une agitation constante à 350 tr/min pendant deux heures. Après avoir centrifugé les tubes à 15 000 x G à température ambiante pendant dix minutes, jetez le surnageant. Après deux autres étapes de centrifugation et l’élimination complète de la solution de liaison à la biotine, réinstallez cette bactérie codée à la biotine dans un PBS stérile d’un millilitre dans un seul tube de 1,5 millilitre.Transférez 100 microlitres de solution de billes magnétiques conjuguées à la streptavidine dans un tube frais de 1,5 millilitre et placez-le dans un support magnétique pendant cinq minutes. Après avoir retiré le solvant du tube, retirez le tube du rack magnétique. Ensuite, remettez en suspension les billes qui sont restées dans le tube avec un millilitre de suspension bactérienne codée à la biotine.Incuber le tube sur un bloc thermique à température ambiante pendant une heure en secouant à 350 tr/min. Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, retirez les bactéries qui n’ont pas adhéré à la paroi et transférez-les dans un nouveau tube étiqueté bactéries non codées.Le tube avec des billes magnétiques adhérant à la paroi contient des bactéries codées Biotine Streptavidine. Retirez le tube contenant des bactéries codées en biotine Streptavidine du support magnétique et mettez-le en suspension dans un millilitre de PBS stérile. Une fois que le tube a été sur le support magnétique pendant cinq minutes, retirez le PBS.Enfin, remettez en suspension les bactéries codées à la biotine Streptavidine lavées dans 500 microlitres de PBS stérile et étiquetez le tube comme bactérie codée. La veille de l’infection, des BMDM entièrement différenciés ont été disposés dans une boîte de six centimètres dans des RPMI complétés par dix pour cent de FBS. Le lendemain, centrifugez la suspension bactérienne codée à 15 000 x G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans un milieu RPMI complété par dix pour cent de FBS. Retirez le milieu des BMDM et ajoutez cinq millilitres de suspension bactérienne codée dans un milieu RPMI afin d’infecter les cellules. Pour synchroniser la phagocytose, incubez à température ambiante pendant dix minutes.Ensuite, pour initier la phagocytose, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le milieu de la vaisselle et lavez les cellules trois fois à l’IPRP pour éliminer les bactéries non internalisées. Pour tuer toute bactérie non phagocytisée à dix millilitres de RPMI contenant dix pour cent de FBS dans 50 microgrammes par millilitre de gentamicine.Enfin, incubez les BMDM infectés à 37 degrés Celsius dans un incubateur à cinq pour cent de dioxyde de carbone jusqu’au moment souhaité. Tout d’abord, préparez le volume de tampon d’isolement de phagosome A requis en ajoutant du DTT et de la cytochalasine B juste avant l’utilisation et des inhibiteurs de protéase et de phosphatase comme recommandé par le fabricant. Retirez le milieu des cellules infectées au moment souhaité et lavez les cellules avec du PBS stérile préchauffé à température ambiante.Ajoutez ensuite 750 microlitres de tampon d’isolement de phagosome A dans le plat et incubez sur de la glace pendant 20 minutes. N’oubliez pas de secouer l’assiette de temps en temps. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de tampon d’isolation Phagosome B, puis basculez les plaques pour vous assurer que le tampon recouvre complètement la surface.Grattez doucement les cellules à l’aide d’un policier en caoutchouc pour retirer les cellules de la parabole et transférez-les dans un tube pré-refroidi de 1,5 millilitre. Ensuite, utilisez une seringue d’un millilitre pour faire passer la suspension cellulaire à travers une aiguille de calibre 26 au moins 15 fois. Ensuite, placez la suspension de la cellule sur le support magnétique pendant cinq minutes.Les particules attachées aux billes magnétiques sont des phagosomes contenant du S. Typhimurium codé. Transférez ensuite la suspension qui contient le reste des composants cellulaires dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté Cytosol. Retirez le tube contenant les phagosomes isolés du rack et remettez-le en suspension dans un millilitre de PBS stérile.Replacez le tube sur la grille magnétique pendant cinq minutes, puis retirez le PBS. Après avoir répété ce lavage avec du PBS une fois, retirez le PBS et enfin, remettez en suspension S.Typhimurium contenant des phagosomes dans le tampon requis. Pour évaluer l’efficacité de la biotinylation de S. Typhimurium par microscopie confocale, les BMDM ont été infectés par mCherry S.Typhimurium marqué à la biotine.Après fixation et incubation avec Cy5-Streptavidin, la biotinylation réussie a été confirmée par le signal fluorescent Cy5-Streptavidin. Ce signal a été observé exclusivement chez le mCherry S.Typhimurium biotinylé alors qu’il n’y avait aucun signal chez le mCherry S.Typhimurium non biotinylé. L’analyse immunobloc de phagosomes isolés a montré un enrichissement significatif de mCherry exprimant S.Typhimurium dans les phagosomes par rapport à la fraction cytosolique.L’analyse immunobloc à l’aide de marqueurs endosomiques et lysosomes chez des phagosomes isolés a montré un enrichissement des marqueurs testés chez les phagosomes isolés quatre heures après l’infection, contre 30 minutes après l’infection. Lorsque ce protocole a été appliqué à Staphylococcus aureus, une biotinylation réussie de la GFP exprimant S. aureus a été démontrée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure et demie selon le temps d’incubation choisi pour l’infection par l’investigateur.Pour assurer le succès de l’isolement des bactéries contenant des phagosomes, assurez-vous que les tampons contiennent les concentrations indiquées et que les plaques sont secouées pour assurer la couverture homogène des cellules. Soyez également doux lorsque vous grattez les cellules et lorsque vous passez la suspension cellulaire à travers l’aiguille. Suite à cette procédure, d’autres techniques telles que la protéomique ou la métabolomique peuvent être réalisées avec des phagosomes isolés pour étudier l’altération causée par des agents pathogènes sous des facteurs pathogènes impliqués.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Gutiérrez, S., et al., Isolement des phagosomes contenant Salmonella typhimurium à partir de macrophages. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la culture et la préparation de Salmonella typhimurium pour obtenir une suspension bactérienne propre et métaboliquement active adaptée à une utilisation expérimentale.

Préparation de la culture de Salmonella typhimurium

Source : Sigal, N., et al. Purification de l’ARN à partir de Listeria monocytogenes cultivée intracellulairement dans des cellules macrophages.  J. Vis. Exp. (2016).Cette vidéo montre l’isolement de bactéries pathogènes intériorisées à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse infectés (BMDM). Les bactéries sont laissées s’attacher aux cellules de l’hôte, et les bactéries non attachées sont emportées. Après l’internalisation, un antibiotique est ajouté pour éliminer les bactéries non...

Isolement des bactéries pathogènes intracellulaires à partir de cellules hôtes infectées

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

Cette vidéo présente un test permettant de quantifier la présence cytosolique et vacuolaire de Salmonella typhimurium à l’intérieur de macrophages dérivés de la moelle osseuse à l’aide de la perméabilisation différentielle. Les macrophages sont infectés par une protéine fluorescente exprimant Salmonella, qui est internalisée à l’intérieur d’une structure vacuolaire spécialisée appelée vacuole contenant Salmonella ou SCV. Un sous-ensemble de bactéries s’échappe du VCS et pénètre dans le cytosol.

Un test pour quantifier les salmonelles cytosoliques et vacuolaires dans les macrophages primaires infectés

Cette vidéo présente une technique de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) à haute résolution pour la visualisation en temps réel de la formation et de la fermeture des phagosomes pendant la phagocytose médiée par les macrophages de globules rouges (GR) opsonisés par les IgG fixés à la surface d’une boîte à fond de verre. Les macrophages étendent les pseudopodes autour des globules rouges et les engloutissent à l’intérieur des phagosomes, les détachant de la surface du...

Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.

À haut débit de dosage de phénotype Salmonella enterica Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Nous décrivons ici un protocole simple pour isoler les macrophages péritonéaux murins. Cette procédure est suivie d’une extraction de l’ARN pour effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation des récepteurs de type Toll.

Isolement d&#39;anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

Nous décrivons la quantification de Salmonella typhimurium cytosolique et vacuolaire dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse en utilisant la perméabilisation différentielle des digitonines.

Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Les bactériophages, omniprésents et diversifiés sur Terre, infectent et se répliquent au sein d’hôtes bactériens, jouant un rôle crucial dans les écosystèmes microbiens. Malgré leur importance, leur présence peut perturber les processus industriels. Nous avons développé une méthode utilisant des lipopolysaccharides bactériens pour éliminer les bactériophages des cultures de Salmonella .

Élimination des bactériophages dans des cultures de salmonelles infectées

Découvrez une méthode simple pour isoler des phagosomes contenant Salmonella typhimurium à partir de macrophages en utilisant la biotine et la streptavidine. Cette technique accessible permet d'étudier la maturation des phagosomes et le traitement des antigènes en immunologie.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

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