Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des lignées de cellules NK ou T à partir de patients atteints de CAEBV, ce qui a une grande importance pour la recherche sur cette maladie mortelle. Cette méthode permet d’obtenir des lignées de cellules NK ou T pour la recherche sur le mécanisme du CAEBV, comme l’étude du VBV brut sur la prolifération cellulaire, le dépistage des inhibiteurs qui interfèrent avec la prolifération des cellules NK/T. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique très simple et efficace qui ne nécessite qu’une petite quantité de sang périphérique et une faible dose de fer deux pour établir des lignées de cellules NK ou T chez les patients atteints de CAEBV.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés, car la survie cellulaire au cours de la première des deux semaines de la culture est incertaine et cette méthode vous montrera comment déterminer la prolifération cellulaire de la culture précoce. Lorsque nous avons eu l’idée de cette méthode, nous avons découvert que le fer sérique humain peut inclure du PBMC jusqu’à deux semaines. Nous avons montré que la démonstration de cette méthode est essentielle, car elle montre la forme des cellules et la cause de la prolifération.

Et cette extension des cellules et la numérotation des cellules Y-bar Pour commencer cette procédure, purifiez la PBMC primaire de deux millilitres de sang total de patients atteints de CAEBV par centrifugation à gradient. Alternativement, décongelez du PBMC cryoconservé à partir d’azote liquide avec le milieu RPMI-1640. Ensuite, ajoutez deux microlitres de bleu de trypan à 0,4 % à 18 microlitres de suspension cellulaire pour colorer les cellules pendant trois minutes, puis transférez la suspension sur la plaque du compteur cellulaire et mesurez la concentration et la viabilité des cellules avec un compteur de cellules automatisé.

Préparez la suspension cellulaire à une densité de deux à trois fois 10 à six cellules par millilitre, complétée par un milieu de culture complet RPMI-1640 contenant 20 % de sérum humain, deux millimolaires de L-glutamine et des antibiotiques. Ensuite, semez un millilitre de suspension PBMC par puits dans les plaques de culture cellulaire à 24 puits. Ensuite, ajoutez 150 unités par millilitre de rhIL-2 dans chaque puits.

Placez les plaques de culture dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Le deuxième jour, observez la morphologie cellulaire au microscope à un grossissement de 200 fois. Les cellules sont en bon état lorsqu’elles sont brillantes et rondes.

Dans cette étape, ajoutez deux microlitres de bleu de trypan à 0,4 % à 18 microlitres de suspension cellulaire et calculez la concentration des cellules. Ensuite, observez la morphologie cellulaire et surveillez l’état de croissance cellulaire en numérotant les cellules avant de changer de milieu. Il est important de surveiller la morphologie cellulaire et son état.

Nous pouvons juger si les cellules survivent par les cellules polymorphes et l’état des cellules au stade précoce d’une culture. Ensuite, retirez 500 microlitres de milieu de chaque puits de la plaque à 24 puits et ajoutez-y 500 microlitres de milieu de culture complet frais. Ajoutez ensuite 150 unités par millilitre de rhIL-2 dans chaque puits.

Changez de support deux fois par semaine. Tracez la courbe de croissance cellulaire. Lorsque la concentration de cellules viables dépasse cinq fois 10 pour six cellules par millilitre, divisez les cellules dans de nouveaux puits à une concentration de une à deux fois 10 pour six cellules par millilitre dans chaque puits.

Ce processus prend de deux à quatre semaines. Lorsque les cellules se sont développées, prélevez une fois 10 à six cellules pour déterminer les phénotypes des lignées cellulaires. Centrifugez-les à 240 fois g pendant cinq minutes à température ambiante pour précipiter les cellules NKNT.

Après cela, jetez le surnageant, lavez les précipitations en ajoutant sept millilitres de PBS. Centrifugez-le pendant cinq minutes à 240 fois g à température ambiante. Répétez la procédure une fois de plus, puis ajoutez 200 microlitres de sérum humain dans chaque tube, mélangez bien et incubez pendant 10 minutes à température ambiante Centrifugez les cellules à 240 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension à raison de 10 à six cellules par millilitre avec du PBSA froid. Par la suite, divisez les cellules en cinq tubes contenant chacun deux fois 10 cellules puissance cinquième. Après cela, centrifugez les cellules à 240 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius Jetez le surnageant et mettez à nouveau en suspension les cellules avec un tampon PBSA ou PBSA contenant 10 microlitres de PE et 10 microlitres d’anticorps marqués FITC pour colorer les récepteurs cellulaires des cellules T ou NK sur de la glace.

Les cellules suspendues avec un tampon PBSA sont utilisées comme contrôle négatif. Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps pendant 20 à 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Lavez les cellules deux fois avec du PBSA froid et remettez les cellules en suspension avec 300 microlitres de PBSA froid avant l’analyse avec le cytomètre en flux.

Une fois l’analyse du phénotype cellulaire terminée, retirez soigneusement la moitié du surnageant et évitez de toucher les cellules au bas de la plaque. Ajoutez le même volume de milieu de culture frais contenant de l’IL-2 à raison de 300 unités par millilitre dans les plaques, puis changez la moitié du milieu tous les trois jours jusqu’à ce que les amas de cellules soient clairement visibles au microscope. Après cela, transférez les cellules des plaques de 24 puits dans des flacons de culture T-25 après avoir mélangé différents puits de la même lignée.

Doublez le volume du milieu de culture lorsqu’il jaunit jusqu’à ce que le volume du milieu atteigne 10 à 15 millilitres. Ensuite, ajoutez-y du rhIL-2 avec une concentration de 150 unités par millilitre. Changez le milieu 24 heures avant la congélation après deux à trois semaines de croissance, lorsque la masse cellulaire peut être observée à l’œil nu.

Mesurez la concentration des cellules à l’aide du compteur de cellules. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 240 fois g et remettez en suspension la pastille cellulaire à une densité de cinq à 10 fois 10 à six cellules par millilitre avec la solution mère congelée qui contient 90 % de sérum de veau fœtal et 10 % de DMSO. Congelez-le à un taux d’un degré Celsius par minute à moins 80 degrés Celsius, puis transférez-le directement dans l’azote liquide.

Après trois jours de culture lors de l’établissement des lignées cellulaires, les cellules polymorphes commencent à apparaître. Après sept jours, les cellules se développent rapidement car le nombre et la viabilité des cellules augmentent à un rythme élevé. De petits amas de cellules sont clairement visibles après 10 à 14 jours de croissance, lorsque la concentration cellulaire dépasse trois à six fois 10 à sixième.

Au cours de cette période, les cellules doivent être dilatées en les divisant en deux ou trois puits de la plaque de culture. Environ un mois plus tard, une fois que le nombre de cellules atteint trois à cinq fois 10 puissance sept, le nombre est suffisamment élevé pour la préservation. Une autre question importante est de déterminer les phénotypes après que les cellules ont été cultivées avec succès.

Nos résultats indiquent que les cellules T et NK peuvent être cultivées par la méthode décrite ci-dessus et que des lignées cellulaires peuvent être établies avec cette technique lorsque les cellules se sont développées plus de trois mois en bon état. Cette méthode, cette technique, peut être encore plus pratiquée. C’est facile à exécuter correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver la variabilité du PBMC. Pour cette procédure, l’une ou l’autre méthode, comme le kit de test MTT 8, peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la toxicité des lignées de cellules NK ou T qui peuvent être utilisées pour l’immunothérapie adoptive. Après chaque développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du CAEBV pour explorer le mécanisme des NK/T associés à l’EBV qui impliquent des maladies opératoires dans le système cellulaire modèle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir une expansion des lignées de cellules NK et T en suivant ce protocole. N’oubliez pas que travailler avec un agent pathogène peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.