Name: Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez une méthode de décellularisation et de décalcification de cochlées de souris pour l'ingénierie tissulaire de l'oreille interne. Cette technique permet d'étudier les interactions cellulaires avec la matrice extracellulaire cochléaire.

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Le projet actuel a été financé par la preuve de l’Université du Kansas de fonds Concept. Nous tenons à remercier le personnel soignant à KUMC (Kansas City, KS) pour nous aider à obtenir des humains des cordons ombilicaux et David Jorgensen pour aider avec les cultures de limaçon.

Toutes les procédures, y compris l’euthanasie animale, ont été effectuées selon le protocole institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) approuvé (APUC #2014-2234) à l’Université du Kansas Medical Center (KUMC).
Remarque : HWJCs ont été isolées de cordons ombilicaux humains qui ont été donnés par les patients qui a donné son consentement éclairé et spécimens ont été utilisés conformément aux protocoles approuvés par le Comité de sujets humains Université du Kansas (KU-CISR #15402).
1. l’OS Temporal récolte et l’isolement de la cochlée
<ol>
	<li>Décapiter une souris convenablement euthanasiée, 15 semaines de coupe entre le crâne et la première vertèbre cervicale avec des ciseaux chirurgicaux aiguisés, puis vaporiser vers le bas de la tête avec l’éthanol à 70 % pour désinfecter (Figure 1 a).</li>
	<li>Coupent le crâne dans un plan longitudinal à l’aide de la même paire forte de ciseaux chirurgicaux (Figure 1 b-C, lignes pointillées).</li>
	<li>Retirez le tissu cérébral du crâne à l’aide d’une paire de pinces (Figure 1, flèche).</li>
	<li>Identifier l’OS temporal à travers la présence de l’auditif et les racines de nerf vestibulaire (Figure 1E-F, pointes de flèche) à l’intérieur du crâne et le conduit auditif de l’extérieur (Figure 1F, flèche). Découpez soigneusement à travers le crâne pour isoler l’OS temporal du reste du crâne (Figure 1). Remarque : Dans certains cas, il peut être possible de dégager délicatement l’OS environnants du crâne de l’OS temporal sans nécessiter de coupe.</li>
	<li>Insérer la pince fine dans l’ouverture du conduit auditif environ 5 mm (Figure 1 H), donc les conseils ne risquent pas de percer la cochlée. Casser délicatement l’os de la bulle tympanique (Figure 1 H, haut rouge zone ombrée) donc il fractures (ligneFigure 1I, rouge pointillée). Remarque : Si nécessaire, un microscope à dissection peut aider dans ce processus afin d’assurer un positionnement précis et la manipulation des instruments.</li>
	<li>À l’aide de pinces fines, dégager loin le reste de la bulle tympanique de l’OS temporal, exposant le labyrinthe osseux de la cochlée (Figure 1J, supports de rouges).</li>
	<li>Placez une boîte de Pétri assez grande pour contenir de l’OS temporal (p. ex., 30 mm ou plus) sous la dissection étendue de champ et remplissez-le avec assez Phosphate Buffered Saline (PBS) pour couvrir l’OS temporal (par exemple, 0,5 à 1 mL).</li>
	<li>Plonger l’OS temporal avec la bulle tympanique supprimée dans le PBS avec les fenêtres ovales et rondes de la cochlée vers le haut. Remarque : Suppression du système vestibulaire de la cochlée n’est pas nécessaire, car le système vestibulaire sert bien une poignée de manipulation et d’orienter les caractéristiques de la cochlée (Figure 1I et Figure 2 b).</li>
	<li>Avec un ultra fine paire de pinces, retirer l’artère stapédiens, qui traverse l’étrier.</li>
	<li>Insérez une extrémité de la pince ultra fine à travers l’arche de l’étrier où l’artère est transmise et soulever délicatement l’étrier. L’étrier désarticulés devrait soulever hors de la fenêtre ovale.</li>
	<li>À l’aide d’une pointe de la pince ultra-fine, perforer l’ovale et ronde de windows.</li>
	<li>À l’aide d’une solution de PBS 1 x rempli de 28,5 calibre seringue avec tuyau (diamètre intérieur 0,28 mm, diamètre extérieur 0,61 mm) attaché, positionner le tube sur la fenêtre ovale (Figure 2 a -B). Remarque : L’ouverture du tube peut être manipulé à l’aide de la pince ultra-fine contribuant à assurer un positionnement précis.<ol>
		<li>Utiliser une seringue fraîche et les tubes pour chaque cochlée.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse 2 mL d’antibiotique-antimycosiques (anti-anti) 10 % et 10 % la pénicilline-streptomycine (stylo-strep) dans du PBS par le biais de la cochlée pendant 5 min pour enlever la périlymphe. Perfusant trop vite avec trop de pression peut endommager les structures fines dans la cochlée. Remarque : Conduire manuellement la seringue à la main pour perfuse le liquide dans la cochlée est efficace, bien qu’une pompe à perfusion pourrait être utilisée comme une alternative.<ol>
		<li>Si perfusant manuellement, utilisez une paire de fines, fermeture automatique des pinces pour stabiliser la cochlée (Figure 2 a) au cours de la perfusion en saisissant la partie vestibulaire de l’OS temporal. Remarque : Bien que non obligatoire, ce qui laisse les deux mains libres pour manipuler les instruments ; une main peut conduire à la seringue (Figure 2 a) tandis que l’autre permet de positionner le tube de façon appropriée (Figure 2 b).</li>
		<li>De cette étape vers l’avant, prenez soin de ne pas exposer la cochlée inutilement à l’air. Introduire des bulles d’air dans les espaces fluides se bloque la circulation du fluide, et les sécher n’endommage les structures fines dans la cochlée.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retirez et jetez n’importe quel muscle tissu et l’OS fragments restants à l’aide de pinces fines.</li>
	<li>Si nécessaire, stocker limaçon isolé à 4 ° C en solution de strep-stylo de 10 % dans du PBS et anti-anti 10 % jusqu'à sept jours, avec des changements réguliers de solution antibiotique toutes les 48 h.</li>
</ol>
2. cochléaire traitement
<ol>
	<li>DÉCELLULARISATION
	<ol>
		<li>Pour chaque cochlée, remplir un flacon à scintillation de verre de 20 mL avec un 1 % sodium dodécyl sulfate solution (SDS) dans de l’eau déminéralisée (DI), qui sert à decellularize la cochlée.</li>
		<li>Couper l’extrémité hors d’une pipette de transfert 7 mL en plastique à l’aide d’une lame de rasoir afin que l’ouverture soit assez grande pour une cochlée de passer à travers.</li>
		<li>À l’aide de la pipette de transfert, doucement dresser la cochlée dans la pipette alors il passe juste au bord de la coupure de quelques millimètres.</li>
		<li>Expulser la cochlée dans le flacon 1 % de scintillation rempli de solution SDS.</li>
		<li>Faire circuler 2 mL de SDS de 1 % dans de l’eau déminéralisée (DI) par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.</li>
		<li>Placer le flacon à scintillation dans une coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante.<ol>
			<li>Changez 1 % SDS solution toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement de SDS pour ne pas exposer la cochlée dans l’atmosphère.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Laver la cochlée trois fois de 30 min chacun, avec l’eau distillée.</li></ol></li></ol>Effectuer les lavages dans le même flacon à scintillation, utilisé pour des charges de la SDD ; à ce stade, la cochlée est DECELLULARISE.
	
	
	<li>Décalcification
	<ol>
		<li>Retirez l’eau DI le flacon à scintillation, laissant juste assez pour garder la cochlée submergés.</li>
		<li>Pour commencer une décalcification, ajouter 5 mL de 10 % d’acide tétraacétique (EDTA) (0,02 M) dans l’eau distillée dans le flacon à scintillation contenant de la cochlée.</li>
		<li>Faire circuler 2 mL d’EDTA 10 % dans l’eau distillée par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.</li>
		<li>Remettre le flacon à scintillation dans la coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante. Changer la solution d’EDTA 10 % toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement des solutions afin que la cochlée n’est pas exposée à l’air.</li>
		<li>Rincer la cochlée 3 fois pendant 2 h chacune avec du PBS 1 x ; à ce stade, la cochlée est détartrée.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stockage
	<ol>
		<li>Stocker le limaçon pendant 72 h dans une anti-anti, 10 % plume strep-solution à 10 % dans du PBS à 4 ° C. Remarque : Les plus longues périodes de stockage peuvent être possibles avec des changements réguliers de solution antibiotique ; Toutefois, un stockage prolongé de limaçon transformés n’a pas été validé dans le présent protocole.</li>
	</ol>
	</li>

3. achats et l’Expansion des hWJCs
<ol>
	<li>Isoler les hWJCs selon les protocoles publiés antérieurement22. En bref, les cordons ombilicaux segment en sections de 3 cm.</li>
	<li>Faites une incision peu profonde avec un scalpel dans la longueur sur chaque segment du cordon ombilical de dérouler et d’exposer la gelée de Wharton du cordon ombilical. Forceps permet de supprimer les vaisseaux sanguins.</li>
	<li>Laver les segments de cordon ombilical deux fois avec assez de PBS (p. ex., 40 mL dans une boîte de Pétri de 60 mm) pour submerger le tissu. Finement hacher des segments de tissus avec un scalpel. Digérer le tissu dans une boîte de Pétri avec 50 mL de milieu de digestion de 100 mm (collagénase de type 2 de 0,2 %, 1 % la pénicilline-streptomycine, en basse-glucose moyen (DMEM d’aigle modifié de Dulbecco)).</li>
	<li>Placer le tissu en digérant moyen dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant la nuit dans un 5 % CO2, incubateur de 37 ° C. Le lendemain, diluer milieu de digestion à un ratio de 01:16 dans 2 % antibiotique-antimycosiques dans du PBS et cellules de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pour 10 min. jetez surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les boulettes dans le cellules souches mésenchymateuses croissance moyen (MSCGM) et recombiner des cellules. Cellules de la plaque à une densité de 7 x 103 cellules/cm2 en culture de tissus traitement flacons T-75. HWJCs en MSCGM de la culture et étendre au passage 5 pour des expériences. Remarque : HWJCs peut être Sub cultivées dans plus grands T-fioles (p. ex., T-150, T-300) lors de passage pour augmenter le rendement des hWJCs pour des expériences.</li>
</ol>
4. l’injection de hWJCs dans Decellularized limaçon
<ol>
	<li>Préparer le limaçon DECELLULARISE
	<ol>
		<li>À l’aide d’une technique aseptique, laver limaçon stockées dans du PBS 1 x trois fois pour chaque 30 min.</li>
		<li>Transférer le limaçon dans puits séparés d’une plaque 24 puits et ajouter 1 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM.</li>
		<li>Incuber le limaçon dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire pendant au moins 1 h avant l’injection de cellules.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissocier hWJCs et remettre en suspension
	<ol>
		<li>HWJCs de lavage avec 37 ° C préchauffé solution 1 PBS x deux fois.</li>
		<li>Ajouter suffisamment 37 ° C préchauffé trypsine avec EDTA 0,5 % pour couvrir la surface du navire cellulaire.</li>
		<li>Incuber les hWJCs jusqu'à 5 min dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire.<ol>
			<li>Vérifiez que 90 % des cellules ont détaché de la surface de culture cellulaire en affichant des cellules sous un microscope inversé. Remarque : Les cellules qui se déplacent lorsque le récipient de culture est tapoté doucement, ont détaché. Les cellules qui restent fixes, n’ont pas détaché.</li>
			<li>Tapoter légèrement les côtés du ballon pour déloger davantage les cellules attachées.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>À l’aide d’une technique aseptique, transfert hWJCs du récipient de culture dans un tube conique de 50 mL contenant un volume équivalent de MSCGM pour le volume de la trypsine permettant de dissocier les cellules.</li>
		<li>Le hWJCs de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pendant 5 min.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les hWJCs en MSCGM à une concentration de 500 000 cellules/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuse limaçon
	<ol>
		<li>Limaçon de transfert à une nouvelle plaque 24 puits à l’aide d’une pipette de transfert.</li>
		<li>Ajouter une goutte de MSCGM à chaque cochlée afin d’empêcher toute cochlée ne se dessèchent pas.</li>
		<li>Délicatement, orienter la cochlée avec une pincette ultra fines pour que la fenêtre ovale et ronde pointent vers le haut. Remarque : Faire extrêmement attention lorsque vous manipulez directement chaque cochlée comme la cochlée est facilement endommagée.</li>
		<li>À l’aide d’une seringue stérile calibre 28,5 insuline avec tuyau connecté, établir 0,2 mL resuspendue hWJCs (100 000 cellules).</li>
		<li>À l’aide de pinces fines stérilisé, positionner le tube au-dessus de la fenêtre ovale.</li>
		<li>Lentement et délicatement perfuse la cochlée avec 0,2 mL de hWJCs remises en suspension à l’aide d’une seringue à insuline 28,5-Manomètre reliée au tuyau de polyéthylène (diamètre extérieur : 0,61 mm, diamètre intérieur : 0,28 mm) pendant environ 5 min.</li>
		<li>Après la perfusion, ajouter 0,8 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM dans la cupule contenant la cochlée pour porter le volume total dans le puits à 1 mL.</li>
		<li>Répétez les étapes 4.3.3-4.3.7 pour chaque cochlée, à l’aide d’une seringue fraîche et tube à chaque fois.</li>
		<li>Place perfusés limaçon dans un 5 % de CO2et 37 ° C incubateur de culture cellulaire changement médias trois fois par semaine.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. préservation et la récolte de la cochlée
NOTE : Limaçon peut-être être cultivés et récoltés à n’importe quel point du temps de perfusion après de jusqu'à 30 jours.
<ol>
	<li>Afin de préserver le limaçon, difficulté à la paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C sur une plate-forme bascule.</li>
	<li>Après fixation, laver le limaçon avec du PBS 1 x trois fois de 5 min chacun.</li>
	<li>Peu à peu déshydrater la cochlée avec de l’éthanol et clair avec un solvant hydrocarbure aliphatique avant l’intégration à la paraffine.</li>
	<li>Section des échantillons jusqu'à une épaisseur de 10 µm à l’aide d’un microtome et monter sur lames de microscope de verre. Remarque : Les échantillons sont maintenant prêts à histologique ou immunohistochimique de traitement à l’aide de protocoles standard.</li>
</ol>

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<li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons démontré avec succès que des cellules cochléaires natifs peuvent être retirés de la cochlée via un processus DÉCELLULARISATION, qui permet l’utilisation de la cochlée comme un échafaudage de tissu complexe, en trois dimensions. Santi et al. 15 mis au point la méthode initiale pour decellularizing limaçon et ont réussi à estimer les volumes de nombreuses structures cochléaires grâce à l’aide d’une nappe de lumière microscopie23. Ce premiers travaux a serv...

La cochlée est une structure complexe en spirale dans l’OS temporal. Il est composé d’un labyrinthe osseux externe et un labyrinthe membraneux concentriques, intérieure1. Le labyrinthe membraneux se compose de trois espaces fluides : Scala vestibulaire, Scala media et Scala timbales1. Les médias de scala abrite l’épithélium sensoriel, qui est composé d’une multitude de types de cellules, mais les cellules sensorielles de cheveux (HC), qui transmettre l’énergie mécanique en ondes sonores d’influx nerveux2, sont particulièrement intéressants. Exposition au traumatisme acoustique3,4,5, médicament6, maladie7,8et vieillissement,9 peut tous entraîner dysfonctionnement auditif par l’intermédiaire de la mort HC. Perte des cellules ciliées chez les mammifères est permanente, contrairement à aviaires HCs, qui peuvent se régénérer après blessure10.
Une variété de recherches contemporaines ont cherché à restaurer perdus HCs, bien que les approches expérimentales spécifiques varient. Manipulation de l’expression génique dans l’épithélium sensoriel et l’implantation de cellules souches différenciées en dehors du corps sont des approches dominantes dans le domaine, bien que les méthodes d’induction qui cherchent à différencier des cellules souches dans cochlear organoïdes ont été tentative de11,12,13. Chacune de ces approches est soit directement sur les cellules souches, ou les indices de développement utilisés par les cellules souches ; Cependant, une seconde partagé, et potentiellement critiques, élément est l’ECM de la cochlée elle-même14,15.
L’ECM propose non seulement un support physique des cellules et des tissus, ce qui inclut une surface pour l’adhésion cellulaire, la prolifération, la survie et la migration, mais joue également un rôle crucial dans le développement du HCs et la spirale ganglion15,16 ,,17. Naturellement présents ECM propose des signaux inductifs qui peuvent guider la détermination du phénotype cellulaire et/ou d’adhérence, la prolifération et la survie cellulaire18. Par conséquent, l’utilisation de la cochlée DECELLULARISE en combinaison avec des hWJCs cultivées offrent une occasion unique d’explorer le rôle de la régénération de l’ECM et HC. HWJCs sont un type de cellule facilement disponible, non sujettes à controverse isolé de cordons ombilicaux humains qui se comportent comme des cellules souches mésenchymateuses19. HWJCs ont démontré la capacité de différencier vers le bas de la cellule neurosensorielle lignées20,21. Ainsi, le protocole actuel en détail l’isolement, DÉCELLULARISATION et la perfusion du limaçon de carcasses de souris C57BL avec hWJCs pour l’ingénierie tissulaire oreille interne.

<table><tbody><tr><td>Centrifugeuse Allegra X-14R</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Tube semi-rigide intramédical</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Pince ultra-fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271 Boîte de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline U-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Flacon à scintillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td> <td>à 24 puitsFisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Lames de microscope en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Incubateur CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture TPP T-75</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture TPP T-150</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture TPP T-300</td> Microscope <td>de</td> dissection TP90301 <td></td><td>MidSci</td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Nikon Eclipse Ts2R-FL</td> Nikon <td>Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Classe II, Type A2 Armoire de biosécurité</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1 % FDS Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10 % EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Chez les mammifères, les cellules ciliées mécanosensoriels qui facilitent l’absence d’audience la capacité de régénération, qui a limité les traitements pour la perte auditive. Les stratégies actuelles de la médecine régénérative ont mis l’accent sur la transplantation de cellules souches ou manipulation génétique d’entourant les cellules de soutien dans l’oreille interne pour encourager le remplacement des cellules endommagées de tige pour corriger une perte auditive. Pourtant, la matrice extracellulaire (ECM) peut jouer un rôle vital dans l’induction et de maintien de la fonction des cellules ciliées et n’a pas été bien étudiée. À l’aide de la vis d’Archimède ECM comme un échafaudage à cultiver des cellules souches adultes peut-être fournir un aperçu unique Comment la composition et l’architecture de l’environnement extracellulaire aide les cellules à maintenir une fonction d’audition. Nous présentons ici une méthode pour isoler et decellularizing limaçon des souris à utiliser comme échafaudages acceptant les cellules souches adultes perfusés. Dans le protocole actuel, limaçon est isolés des souris euthanasiés, DECELLULARISE et détartré. Par la suite, les cellules de la gelée de Wharton humaine (hWJCs) qui ont été isolés dans le cordon ombilical ont été soigneusement perfusés dans chaque cochlée. Le limaçon servaient de bioréacteurs, et les cellules ont été cultivés pendant 30 jours avant de subir le traitement pour l’analyse. Limaçon DECELLULARISE conservé des structures extracellulaires identifiables, mais n’a pas révélé la présence de cellules ou des fragments d’ADN visibles. Les cellules perfusés dans la cochlée envahirent la plus grande partie de l’intérieur et l’extérieur de la cochlée et grandit sans incident pendant une durée de 30 jours. Ainsi, la méthode actuelle peut servir à étudier comment cochléaire ECM affecte le développement de cellules et de comportement.

En utilisant les méthodes présentées ici, DÉCELLULARISATION réussie du limaçon a été évaluée en examinant la présence ou l’absence de l’ADN à travers 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Limaçon était considérés comme pleinement DECELLULARISE si l’ADN n’a pas été identifié dans la cochlée DECELLULARISE. Une cochlée native d’une expérience antérieure qui n’a pas subi de DÉCELLULARISATION ou décalcification a été utilisée comme témoin positif pour illustrer les structures et le...

Le but du présent protocole doit démontrer une méthode efficace pour decellularize et détartre limaçon souris pour utilisation comme échafaudages pour applications d’ingénierie tissulaire.

Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode efficace pour décellulariser et décalcifier les cochlées de souris afin d’utiliser un échafaudage pour des applications d’ingénierie tissulaire de l’oreille interne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’ingénierie auditive et tissulaire, telles que : comment la cochlée 3D et divers composants de la matrice extracellulaire influencent-ils la différenciation des cellules souches ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet au chercheur d’étudier comment les cellules interagissent directement avec la matrice extracellulaire de la cochlée pour former l’épithélium sensoriel.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’isolement de l’os temporal et l’appareil de profusion cellulaire peuvent être difficiles à visualiser correctement sur la seule base de descriptions textuelles. Pour commencer cette procédure, coupez le crâne en deux dans le plan médio-sagittal à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux tranchants. Ensuite, retirez le tissu cérébral du crâne.Identifiez ensuite l’os temporal grâce à la présence des racines nerveuses auditives et vestibulaires à l’intérieur du crâne et du conduit auditif à partir de l’extérieur. Coupez soigneusement le crâne pour isoler l’os temporal du reste du crâne. Ensuite, insérez la pince fine dans l’ouverture du conduit auditif d’environ cinq millimètres afin que les pointes ne risquent pas de percer la cochlée.Ouvrez doucement l’os du bola pour qu’il se fracture. À l’aide d’une pince fine, retirez le reste du bola de l’os temporal en exposant le labyrinthe osseux de la cochlée. Par la suite, immergez l’os temporal dans le PBS avec les fenêtres ovales et rondes de la cochlée vers le haut.À l’aide d’une paire de pinces ultra-fines, retirez l’artère stapédiale qui passe à travers l’étrier. Insérez ensuite une pointe de la pince ultra-fine à travers l’arc de l’étrier où passe l’artère et soulevez délicatement l’étrier vers le haut. Ensuite, percez les fenêtres ovales et rondes.Ensuite, placez le tube qui est relié à une seringue de calibre 28,5 remplie de PBS sur la fenêtre ovale. Appliquez deux millimètres d’antibiotique-atimycotique à 10 % et de pénicilline-streptomycine à 10 % dans le PBS à travers la cochlée pendant cinq minutes pour éliminer la périlymphe. Ensuite, retirez et jetez tout tissu musculaire et fragments osseux restants.Pour la décellularisation, à l’aide de la pipette de transfert, tirez doucement la cochlée vers le haut dans la pipette de sorte qu’elle dépasse à peine le bord coupé de quelques millimètres. Ensuite, expulsez la cochlée dans le flacon à scintillation rempli de solution SDS à 1 %. Faire circuler deux millilitres de SDS à 1 % dans de l’eau désionisée à travers la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.Placez le flacon à scintillation dans un rotateur et laissez-le tourner à 10 tr/min pendant 72 heures à température ambiante. Remplacer par une solution fraîche à 1 % de SDS toutes les 24 heures sur une période de 72 heures et veiller à ne pas exposer la cochlée à l’air pendant le remplacement de la solution. Après cela, lavez la cochlée trois fois dans le même flacon à scintillation pendant 30 minutes chacune dans de l’eau DI.À ce stade, la cochlée doit être décellularisée. Pour le détartrage, retirez le reste de l’eau DI du flacon à scintillation en laissant juste assez pour garder la cochlée immergée. Pour commencer la décalcification, ajoutez cinq millilitres d’eau à 10 % d’EDTA et de DI dans le flacon à scintillation contenant la cochlée.Faites circuler deux millilitres d’EDTA à 10 % dans de l’eau désionisée à travers la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert. Replacez le flacon à scintillation dans le rotateur et laissez le flacon à scintillation tourner à 10 tr/min pendant 72 heures à température ambiante. Changez la solution 10 % EDTA toutes les 24 heures sur une période de 72 heures.Faites attention lorsque vous changez de solution afin que la cochlée ne soit pas exposée à l’air. Ensuite, rincez la cochlée trois fois pendant deux heures chacune avec du PBS. À ce stade, la cochlée doit être décalcifiée.Avant de perfuser des cellules, commencez par incuber des cochlées décellurisées et décalcifiées dans un incubateur de culture cellulaire à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour profuser les cochlées, ajoutez ensuite une goutte de MSCGM à chaque cochlée pour éviter qu’une cochlée ne se dessèche. Transférez-les sur une nouvelle plaque à 24 puits à l’aide d’une pipette de transfert.Orientez délicatement la cochlée à l’aide d’une pince ultra-fine de manière à ce que les fenêtres ovales et rondes soient tournées vers le haut. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline stérile de calibre 28,5 avec tube connecté, prélevez 0,2 millilitre de cellules gélatineuses humaines de Wharton remises en suspension. Par la suite, placez le tube sur la fenêtre ovale à l’aide d’une pince fine stérilisée.Profuser délicatement et lentement la cochlée avec 0,2 millilitre de cellules gélatineuses humaines de Wharton remises en suspension pendant cinq minutes. Cette étape de profusion est importante. La profusion réussie de fluides à travers la cochlée a un impact considérable sur le résultat de ce protocole.Après la profusion, ajoutez 0,8 millilitre de MSCGM préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits contenant la cochlée pour porter le volume total à un millilitre. Répétez la procédure pour chaque cochlée. À l’aide d’une seringue et d’un tube neufs à chaque fois.Placez la cochlée abondante dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et changez de milieu trois fois par semaine. La montre ici la décellularisation et la décalcification réussies d’une cochlée de souris sans aucune cellule injectée. Dans l’ensemble, l’anatomie de la cochlée est préservée avec des vides laissés sans taches de couchette.Voici les résultats représentatifs de la culture réussie de cellules méduses de Human Wharton sur un échafaudage de cochlée. Des taches abondantes sont observées dans toute la cochlée et sur la surface osseuse externe. Un examen plus approfondi des tours individuels révèle que les structures fines de la cochlée sont préservées après la décellularisation et la décalcification et que les cellules injectées sont attachées à la matrice extracellulaire native de la cochlée et/ou interagissent avec celle-ci.La décellularisation dans les cultures cellulaires ultérieures a également été étudiée à l’aide de la coloration H&E. La cochlée décellularisée ne contenait aucune des cellules de la cochlée native mais conserve la majeure partie de l’anatomie de l’organe de Corti car la matrice extracellulaire reste. L’injection dans des cellules cultivées peut être observée à travers l’organe de Corti, interagissant avec la matrice extracellulaire décellularisée.Une fois maîtrisée, la profusion de cellules dans une cochlée décellularisée peut prendre environ 10 à 15 minutes si la cochlée est déjà préparée et que les outils nécessaires sont disposés de manière appropriée. Lors de cette procédure, il est important de manipuler la cochlée avec précaution car elle est fragile. Il est également important d’éviter l’introduction d’air dans la cochlée car les bulles bloqueront l’écoulement des fluides lors des profusions.Cette procédure générale peut être appliquée aux cochlées d’autres espèces et un large éventail de types de cellules peut également être injecté. Les temps spécifiques de décellularisation et de décalcification varieront probablement, mais les concepts sous-jacents resteront les mêmes. Le Dr Peter Santi de l’Université du Minnesota a initialement développé la technique de décellularisation que nous avons modifiée pour ce protocole.Nous espérons mettre notre technique et notre culture cellulaire sur échafaudage de cochlée à la disposition d’autres ingénieurs tissulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler, de décellulariser et de décalcifier avec succès les os temporaux avant d’injecter des cellules pour les utiliser dans des expériences de culture.

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Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

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