Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode efficace pour décellulariser et décalcifier les cochlées de souris afin d’utiliser un échafaudage pour des applications d’ingénierie tissulaire de l’oreille interne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’ingénierie auditive et tissulaire, telles que : comment la cochlée 3D et divers composants de la matrice extracellulaire influencent-ils la différenciation des cellules souches ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet au chercheur d’étudier comment les cellules interagissent directement avec la matrice extracellulaire de la cochlée pour former l’épithélium sensoriel.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’isolement de l’os temporal et l’appareil de profusion cellulaire peuvent être difficiles à visualiser correctement sur la seule base de descriptions textuelles. Pour commencer cette procédure, coupez le crâne en deux dans le plan médio-sagittal à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux tranchants. Ensuite, retirez le tissu cérébral du crâne.

Identifiez ensuite l’os temporal grâce à la présence des racines nerveuses auditives et vestibulaires à l’intérieur du crâne et du conduit auditif à partir de l’extérieur. Coupez soigneusement le crâne pour isoler l’os temporal du reste du crâne. Ensuite, insérez la pince fine dans l’ouverture du conduit auditif d’environ cinq millimètres afin que les pointes ne risquent pas de percer la cochlée.

Ouvrez doucement l’os du bola pour qu’il se fracture. À l’aide d’une pince fine, retirez le reste du bola de l’os temporal en exposant le labyrinthe osseux de la cochlée. Par la suite, immergez l’os temporal dans le PBS avec les fenêtres ovales et rondes de la cochlée vers le haut.

À l’aide d’une paire de pinces ultra-fines, retirez l’artère stapédiale qui passe à travers l’étrier. Insérez ensuite une pointe de la pince ultra-fine à travers l’arc de l’étrier où passe l’artère et soulevez délicatement l’étrier vers le haut. Ensuite, percez les fenêtres ovales et rondes.

Ensuite, placez le tube qui est relié à une seringue de calibre 28,5 remplie de PBS sur la fenêtre ovale. Appliquez deux millimètres d’antibiotique-atimycotique à 10 % et de pénicilline-streptomycine à 10 % dans le PBS à travers la cochlée pendant cinq minutes pour éliminer la périlymphe. Ensuite, retirez et jetez tout tissu musculaire et fragments osseux restants.

Pour la décellularisation, à l’aide de la pipette de transfert, tirez doucement la cochlée vers le haut dans la pipette de sorte qu’elle dépasse à peine le bord coupé de quelques millimètres. Ensuite, expulsez la cochlée dans le flacon à scintillation rempli de solution SDS à 1 %. Faire circuler deux millilitres de SDS à 1 % dans de l’eau désionisée à travers la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.

Placez le flacon à scintillation dans un rotateur et laissez-le tourner à 10 tr/min pendant 72 heures à température ambiante. Remplacer par une solution fraîche à 1 % de SDS toutes les 24 heures sur une période de 72 heures et veiller à ne pas exposer la cochlée à l’air pendant le remplacement de la solution. Après cela, lavez la cochlée trois fois dans le même flacon à scintillation pendant 30 minutes chacune dans de l’eau DI.

À ce stade, la cochlée doit être décellularisée. Pour le détartrage, retirez le reste de l’eau DI du flacon à scintillation en laissant juste assez pour garder la cochlée immergée. Pour commencer la décalcification, ajoutez cinq millilitres d’eau à 10 % d’EDTA et de DI dans le flacon à scintillation contenant la cochlée.

Faites circuler deux millilitres d’EDTA à 10 % dans de l’eau désionisée à travers la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert. Replacez le flacon à scintillation dans le rotateur et laissez le flacon à scintillation tourner à 10 tr/min pendant 72 heures à température ambiante. Changez la solution 10 % EDTA toutes les 24 heures sur une période de 72 heures.

Faites attention lorsque vous changez de solution afin que la cochlée ne soit pas exposée à l’air. Ensuite, rincez la cochlée trois fois pendant deux heures chacune avec du PBS. À ce stade, la cochlée doit être décalcifiée.

Avant de perfuser des cellules, commencez par incuber des cochlées décellurisées et décalcifiées dans un incubateur de culture cellulaire à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Pour profuser les cochlées, ajoutez ensuite une goutte de MSCGM à chaque cochlée pour éviter qu’une cochlée ne se dessèche. Transférez-les sur une nouvelle plaque à 24 puits à l’aide d’une pipette de transfert.

Orientez délicatement la cochlée à l’aide d’une pince ultra-fine de manière à ce que les fenêtres ovales et rondes soient tournées vers le haut. Ensuite, à l’aide d’une seringue à insuline stérile de calibre 28,5 avec tube connecté, prélevez 0,2 millilitre de cellules gélatineuses humaines de Wharton remises en suspension. Par la suite, placez le tube sur la fenêtre ovale à l’aide d’une pince fine stérilisée.

Profuser délicatement et lentement la cochlée avec 0,2 millilitre de cellules gélatineuses humaines de Wharton remises en suspension pendant cinq minutes. Cette étape de profusion est importante. La profusion réussie de fluides à travers la cochlée a un impact considérable sur le résultat de ce protocole.

Après la profusion, ajoutez 0,8 millilitre de MSCGM préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits contenant la cochlée pour porter le volume total à un millilitre. Répétez la procédure pour chaque cochlée. À l’aide d’une seringue et d’un tube neufs à chaque fois.

Placez la cochlée abondante dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et changez de milieu trois fois par semaine. La montre ici la décellularisation et la décalcification réussies d’une cochlée de souris sans aucune cellule injectée. Dans l’ensemble, l’anatomie de la cochlée est préservée avec des vides laissés sans taches de couchette.

Voici les résultats représentatifs de la culture réussie de cellules méduses de Human Wharton sur un échafaudage de cochlée. Des taches abondantes sont observées dans toute la cochlée et sur la surface osseuse externe. Un examen plus approfondi des tours individuels révèle que les structures fines de la cochlée sont préservées après la décellularisation et la décalcification et que les cellules injectées sont attachées à la matrice extracellulaire native de la cochlée et/ou interagissent avec celle-ci.

La décellularisation dans les cultures cellulaires ultérieures a également été étudiée à l’aide de la coloration H&E. La cochlée décellularisée ne contenait aucune des cellules de la cochlée native mais conserve la majeure partie de l’anatomie de l’organe de Corti car la matrice extracellulaire reste. L’injection dans des cellules cultivées peut être observée à travers l’organe de Corti, interagissant avec la matrice extracellulaire décellularisée.

Une fois maîtrisée, la profusion de cellules dans une cochlée décellularisée peut prendre environ 10 à 15 minutes si la cochlée est déjà préparée et que les outils nécessaires sont disposés de manière appropriée. Lors de cette procédure, il est important de manipuler la cochlée avec précaution car elle est fragile. Il est également important d’éviter l’introduction d’air dans la cochlée car les bulles bloqueront l’écoulement des fluides lors des profusions.

Cette procédure générale peut être appliquée aux cochlées d’autres espèces et un large éventail de types de cellules peut également être injecté. Les temps spécifiques de décellularisation et de décalcification varieront probablement, mais les concepts sous-jacents resteront les mêmes. Le Dr Peter Santi de l’Université du Minnesota a initialement développé la technique de décellularisation que nous avons modifiée pour ce protocole.

Nous espérons mettre notre technique et notre culture cellulaire sur échafaudage de cochlée à la disposition d’autres ingénieurs tissulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler, de décellulariser et de décalcifier avec succès les os temporaux avant d’injecter des cellules pour les utiliser dans des expériences de culture.