Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

L’objectif global de la synthèse et de la purification est de produire relativement facilement un analogue du ruthénium 360 utilisé dans les tests d’absorption du calcium mitochondrial qui est 10 fois plus efficace que le ruthénium 360 disponible dans le commerce. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du calcium mitochondrial en fournissant un inhibiteur pur de l’absorption du calcium mitochondrial. Le principal avantage de cette technique est que le produit final est à la fois très puissant et pur.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la purification nécessite du temps et de la patience. La productrice sera Sarah Nathan, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Commencer cette procédure par la synthèse de la pentaammine, du dichlorure de chlororuthénium comme décrit dans le protocole de texte.

Dissoudre 100 milligrammes de dichlorure de chloro-ruthénium pentaammine dans 50 millilitres d’une solution molaire d’hydroxyde d’ammonium dans une fiole à fond rond de 200 millilitres. Fermez le ballon sans serrer avec un bouchon en verre et chauffez le mélange réactionnel à 75 degrés Celsius pendant six heures. Le chauffage d’un récipient scellé entraîne une accumulation de pression.

Assurez-vous que le bouchon en verre est desserré pour permettre la libération de l’excès de pression. Après six heures, retirez le mélange réactionnel du feu. Et remuez à température ambiante pendant quatre jours pour obtenir une solution vert foncé.

Pour purifier l’octo-amine mu-oxo diruthénium résultante par chromatographie d’échange cationique, mettez d’abord en suspension cinq grammes de résine échangeuse de cations dans 10 millilitres de HCL de 0,1 molaire dans un bécher de 25 millilitres. Chargez cette boue dans une colonne de 10 millilitres fixée avec un réservoir de solvant de 50 millilitres. Lavez la résine avec environ 20 à 30 millilitres de HCL 0,1 molaire jusqu’à ce que l’élu soit incolore.

Ensuite, ajoutez du HCL concentré à la solution de réaction verte précédemment isolée pour ajuster le PH à deux, après quoi la couleur de la solution passe au brun. Chargez cette solution acidifiée dans la colonne de résine échangeuse de cations en la pipetant doucement sur la résine. Laissez l’élué s’écouler complètement et continuez à charger la solution.

Répétez ce processus jusqu’à ce que la solution entière ait été ajoutée. Le haut de la résine sera brun foncé ou noir. Le volume de la résine diminuera légèrement.

Ensuite, couvrez le haut de la résine avec des billes de verre pour éviter que la résine ne soit perturbée lorsque de nouvelles solutions sont ajoutées. Éluer la colonne avec 20 millilitres d’une molaire HCL. Ensuite, éluez la colonne avec 50 millilitres d’une concentration accrue de HCL de 1,5 molaire.

Une solution jaune commencera à se détacher de la colonne. Ensuite, augmentez la concentration de HCL à deux molaires et continuez à éluer avec 150 à 200 millilitres. L’éluant commencera par un jaune très pâle et ira vers un jaune vif.

Attendez que l’éluant provenant de la colonne soit à nouveau très pâle. La patience est essentielle à cette étape. L’éluant doit être très pâle.

Augmentez encore la concentration de HCL à 2,5 molaires. Recueillir l’éluant sous forme de fractions dans des tubes à essai. Enfin, augmentez la concentration à trois molaires HCL.

Le produit s’échappera de la colonne sous la forme d’une solution vert-brun. Une fraction rouge-brun peut également commencer à se détacher de la colonne. Ces fractions sont des impuretés brun ruthénium et ne doivent pas être regroupées avec les fractions vert-brun.

Pour tester toutes les fractions par spectroscopie UV-Vis, ajoutez 100 microlitres d’une fraction donnée dans deux millilitres d’ammoniac à trois molaires. Analysez ensuite le mélange par spectroscopie UV-Vis. Les fractions contenant du produit pur auront une grande bande d’absorbance à 360 nanomètres et une absorbance moins intense à 600 nanomètres.

L’absorbance à 480 nanomètres est indicative du brun de ruthénium et l’absorbance à 533 nanomètres représente les impuretés du rouge de ruthénium. D’autres impuretés sont observées à une absorbance inférieure à 300 nanomètres. Regrouper les fractions contenant du produit pur et évaporer la solution à sec par évaporation rotative avant l’analyse de l’échantillon à l’état solide par spectroscopie IR.

Procéder à l’évaluation de l’inhibition de l’absorption du calcium mitochondrial par spectroscopie fluorescente, comme détaillé dans le protocole de texte. Les spectres UV-Vis du pentachlorure de polychlorure de diruthénium trans-diaqua octo amine mu-oxo purifié sont caractérisés par des absorptions majeures et mineures à 360 nanomètres et 600 nanomètres respectivement. À l’inverse, un mélange impur présente des bandes d’absorption à 533 nanomètres des impuretés du rouge de ruthénium et à 275 à 300 nanomètres du matériau de départ.

La caractérisation de l’état solide à l’aide de la spectroscopie infrarouge a les étirements attendus des amines. Ainsi que le ruthénium, l’oxygène et le ruthénium s’étirent à 850 centimètres inverses. Les cellules HeLa perméabalisées traitées avec un colorant fluorescent sensible au calcium et du pentachlorure de diruthénium trans-diaqua octo amine mu-oxo montrent une inhibition de l’absorption du calcium dans les mitochondries.

Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler de laisser les fractions s’éluer complètement. La patience donnera un produit pur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser, de purifier et de caractériser ce puissant analogue du ruthénium 360.

Les niveaux de calcium mitochondrial régulent un large éventail de processus intercellulaires, y compris la bioénergétique et la mort cellulaire contrôlée. L’inhibiteur produit par cette méthode peut être appliqué dans des études pour comprendre le rôle de la biologie du calcium mitochondrial dans la médiation d’autres processus biologiques. N’oubliez pas que le travail avec des acides et des bases concentrés est corrosif et que des précautions telles que le port d’un EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.