Name: Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez la synthèse et la purification d'un inhibiteur de l'absorption du calcium mitochondrial basé sur le ruthénium. Cette méthode produit un analogue 360 plus efficace pour les études de biologie mitochondriale.

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Cette recherche a été financée par l’Université Cornell. Ce travail fait usage du centre Cornell pour matériaux recherche Shared Facilities, qui sont pris en charge par le programme NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconnaît la prise en charge par une bourse de recherche universitaire de la NSF (subvention DGE - 1650441) et Dr. Dave Holowka d’assistance avec les expériences de calcium. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.

Remarque : acides concentrés et bases sont utilisées dans la présente synthèse. Utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution de la réaction, y compris l’utilisation des contrôles d’ingénierie (hotte aspirante) et équipement de protection individuelle (EPI) y compris les lunettes de protection, gants, blouse, pleine longueur pantalons et chaussures fermées.
 1. préparation de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>synthèse de Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12 <ol><li>dissoudre 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru en poids, 4,1 mmol) dans 5 mL d’H 2 O. Cool la solution brune foncée à 0 ° C dans un bain de glace. Ajouter 11 mL (0,23 mol) de solution de l’hydrate d’hydrazine de 80 % d’une manière goutte à goutte. La réaction initiale sera vigoureuse avec le gaz evolution, donnant lieu à une solution brune. Laissez la solution obtenue à remuer à température ambiante pendant 16 h ; la solution finale sera rouge foncé 
		ATTENTION : L’Hydrazine est extrêmement toxiques et cancérigènes. En outre, les formes anhydres de ce réactif sont explosifs. Comme toujours, utilisez appropriés hottes PPE et fumées lors de la manipulation. Pas concentrer ces solutions jusqu'à siccité.</li>
		<li>à cette solution, ajouter environ 5-10 mL d’HCl concentré pour ajuster le pH à 2. À ce stade, la solution sera jaune-brun couleur.</li>
		<li>Chauffer cette solution à 105 ° C sous agitation pendant 1-2 h. Un solide jaune va précipiter hors de la solution. Quand aucuns plus ne précipitent visiblement formes, retirer du feu.</li>
		<li>Laisser le mélange refroidir à la température ambiante, et place ensuite dans un bain de glace de 0 ° C pendant 10 min. recueillir le solide jaune de filtration sous vide et lavage avec 5 mL chacun de l’éthanol et l’éther diéthylique.</li>
		<li>Dissoudre complètement le produit brut de 15 à 25 mL d’eau chaude. Réfrigérer 10 mL d’une solution de HCl concentrée dans une fiole de filtre en le plaçant dans un bain de glace. Filtrer la solution jaune dans la solution de HCl réfrigérée pour induire la précipitation d’un solide pur jaune pâle. Filtrer ce précipité et laver avec 5 mL d’HCl 0,5 M, l’éthanol et l’éther.</li>
		<li>Caractériser les composés en utilisant la spectroscopie IR. Vérifier la pureté de l’identification des fréquences d’élongation à 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 et 801 cm -1. Une souillure mineure commun à 2069 cm -1 est affectée à [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>dissoudre 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 dans 50 mL de 1 M NH 4 OH dans un récipient à pression à fond rond 200 mL paroi épaisse. Vaguement Boucher le ballon avec un bouchon et chauffer le mélange réactionnel à 75 ° C pendant 6 h. retirer du feu et remuer à température ambiante pendant 4 jours obtenir une solution de vert foncée. 
		Mise en garde ! Chauffage un résultats de navire scellé dans une montée en pression. Veillez à utiliser de verrerie de pression-coffre fort approprié. Pour cette réaction, l’étanchéité du navire vise à minimiser la perte de gazeux NH 3. Par conséquent, placez le bouchon vaguement afin de permettre la libération d’une pression excessive.</li>
	</ol></li> <li>Purification par chromatographie échangeuse de cations <ol><li>dans un bécher de 25 mL, suspendre la résine échangeuse de cations g 5 (p. ex., Dowex 50WX2 200-400 de maille (forme H +) dans 10 mL 0,1 M HCl.</li>
		<li>Charger ce coulis dans une colonne de 10 mL (10 mm de diamètre, hauteur 15 cm) munie d’un réservoir de solvant 50 mL. Laver la résine avec environ 20-30 mL de HCl de 0,1 M, jusqu'à ce que l’éluat soit incolore.</li>
		<li>Retour à la solution de réaction vert isolée à l’étape 1.2.1. Ajouter à cette solution, HCl concentré pour ajuster le pH à 2, à quel point la couleur de la solution passe au brun.</li>
		<li>Charger cette solution acidifiée à la colonne de résine échangeuse de cations préparée à l’étape 1.3.2 par pipetage il doucement sur le dessus de la résine. Laissez l’éluat complètement vidanger et poursuivre le chargement de la solution. Répétez ce processus jusqu'à ce que l’ensemble de la solution a été ajouté. La partie supérieure de la résine sera brun foncé/noir. La résine va diminuer en volume légèrement.</li>
		<li>Perles de verre utilisation pour couvrir la partie supérieure de la résine. Ils empêcheront la résine d’être dérangé en nouvelles solutions sont ajoutées.</li>
		<li>Éluer la colonne avec 20 mL de 1 HCl de M.</li>
		<li>Éluer la colonne avec une concentration accrue de HCl de 1,5 M (&#8776; 50 mL). Une solution jaune commence à se détacher de la colonne. Augmenter la concentration de HCl à 2 M et continuer à élution jusqu'à ce que l’éluat soit incolore ou jaune-vert très pâle. Un volume total de 150-200 mL sera nécessaire pour ce processus.</li>
		<li>Augmenter la concentration de HCl à 2,5 M (20 à 50 mL). Recueillir l’éluat sous forme de fractions dans des éprouvettes. Augmenter à 3 M HCl. Le produit va éluer de la colonne comme une solution de vert-brun. Une fraction de brun-rouge peut également commencer à se détacher de la colonne. Comme ces fractions sont les impuretés oxydées rouge de ruthénium, ne pas en commun avec les fractions de brun-vert.</li>
	</ol></li> <li>Caractérisation et la vérification de la pureté de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>tester toutes les fractions de étape 1.3.8. par spectroscopie UV-visible. Pour accomplir cette tâche, ajouter 100 µL d’une fraction donnée dans 2 mL de 3 M NH3 et analyser par spectroscopie UV-visible. Les fractions contenant pur produit aura une bande large absorbance à 360 nm et une moins forte absorbance à 600 nm. Absorbance à 480 ou 533 nm est révélateur oxydé rouge de ruthénium et d’impuretés rouge de ruthénium, respectivement.</li>
		<li>Fractions contenant le pur produit de la piscine et évaporer à sec évaporateur rotatif. Le produit sera isolé comme un solide brun-vert. Les rendements sont en général l’ordre de 5 à 15 mg (taux de rendement de 10 à 20 %). Single-crystals, convenant de la diffraction des rayons x, peuvent être obtenues par la diffusion de la vapeur de l’éthanol dans les solutions aqueuses du composé.</li>
		<li>Pour vérifier la pureté, analyser le composé par spectroscopie UV-visible dans une solution de pH 7,4 tampon phosphate salin (PBS). Pureté peut être évaluée en prenant le ratio d’intensité de la 360 nm et 600 nm pics. Ce ratio est 31 pour un composé pur. Pour les composés impurs, le ratio sera plus petit.</li>
		<li>Analyser l’échantillon à l’état solide par spectroscopie infrarouge. Bandes diagnostiques sont à 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, cm 1313 -1 et 815 cm -1. Bandes d’impureté commune sont vus à 1762 cm -1 et 1 400 cm -1, caractéristique du NH 4 rouge de ruthénium de CL peuvent être identifiés par bandes à 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 et 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Évaluation de l’inhibition de l’absorption de calcium mitochondrial par spectroscopie de fluorescence attention ! Les procédures suivantes utilisent les cellules de mammifères. Travaux devrait être effectués dans les hottes à flux laminaire appropriées qui sont certifiées pour une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 (BSL2) recherche. 
	&#8203; Remarque : [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 sera être dénommé comme [Ru] dans la présente section <ol><li>marque tamponnée contenant du glucose du sérum physiologique (BGSS) les médias de dosage. BGSS est une solution composée de 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4 d’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), succinate sodique de 5 mM, 110 mM KCl, 30 µM éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-tétraacétique (EGTA). Combinez tout sauf l’EGTA, ajuster le pH à 7,4. Ajouter EGTA et réajuster le pH à 7,4. 50 ml de médias de dosage ajouter 0,5 mL de glucose 1 mg/mL.</li>
		<li>Cellules HeLa culture en 500 cm 2 boîtes de Pétri dans Dulbecco &#39; s Modified Eagle moyenne (DMEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO 2 à des cellules de C. amplifier HeLa ° 37 par ensemencement de plus en plus dans une boîte de Pétri de 100 mm les dans un plat de Pétri de 2 500 cm. Le volume total des médias dans le grand plat est 115 mL. Chaque grand plat produira environ 18 millions cellules, assez pour deux expériences de spectroscopie de fluorescence.
		<ol><li>Poussent les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent 90-95 % confluency. Retirez les supports et rincer les cellules avec 15 mL pH 7,4 PBS. Ajouter 15 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM dans du PBS et incuber pendant 10 min détacher les cellules. Les cellules de transfert à 14 mL tubes falcon bas</li></ol></li> <li>compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémocytomètre avec un microscope inversé et calculer le nombre total de cellules et le volume des médias nécessaires pour atteindre 7,5 millions de cellules par volume de 1,8 mL du milieu. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 5310 × g. décanter le liquide surnageant et ajouter le volume calculé de BGSS. Remettre en suspension les cellules doucement.
		<ol><li>Pour cet essai, préparer les solutions de la digitonine 40 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), 1 mM vert de Calcium-5N H 2 O, et 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] des solutions mères, préparées dans l’eau pure, peut varier de 1 à 3 mM. 
			&#8203; Remarque : Calcium vert-5N est sensible à la lumière. Stocker dans l’obscurité et de minimiser l’exposition à la lumière.</li>
		</ol></li> <li>Setup le fluorimètre pour exciter à 506 nm et lire l’émission à 532 nm avec le porte-cuvette réglé à 37 ° C. préparer une cuve acrylique avec une barre de remuer ou de la roue, suspension de cellules de 1,8 mL de 1.5.2 ci-dessus, 1,8 µL de solution de digitonine, 3.6 & #181 ; Calcium L vert-5N (solution) et 9 µL [Ru] (pour la solution mère de 1 mM, concentration finale de 5 µM). Incuber les cellules pendant 15 min dans le fluorimètre.
		<ol><li>Lire les données comme le ratio de l’excitation/émission au lieu de l’absorption de raw. Cette pratique minimise les erreurs liées aux fluctuations de l’intensité de la source lumineuse.</li>
			<li>Effectuer la première analyse de l’échantillon en l’absence de [Ru] pour mesurer l’effet de l’addition de CaCl 2 sur la réponse des cellules.</li>
			<li>Analyse de commencer sur le fluorimètre avec les paramètres décrits au point 1.5.4. Attendez environ 2 minutes pour établir une base d’émission stable et puis ajouter 1,8 µL de CaCl 2 (concentration finale de 10 µM). L’intensité des émissions augmentera immédiatement lors de l’addition du CaCl 2 et décroîtra au cours des minutes alors que les ions de calcium, entrez dans les mitochondries. Attendez que la décomposition se termine (&#8776; 5 min). Ajouter des bolus de calcium supplémentaire pour déterminer la réponse de l’absorption de calcium mitochondrique de cellules non traitées avec [Ru].</li>
		</ol></li> <li>Dans une autre cuve contenant 5 µM [Ru], répéter l’expérience comme décrit ci-dessus dans 1.5.4.3. En présence de l’inhibiteur, intensité d’émission va augmenter, mais pas de désintégration. Cette observation signifie bloqué la capture de calcium mitochondrique.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Le calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 peut être synthétisé de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un bien connu ruthénium à partir de matériel, tel que décrit dans cette procédure. La synthèse de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 est facilement atteint sans trop de difficulté. Après agitation RuCl3 pendant 16 h dans l’hydrazine hydrate, le pH de la sol...

Le calcium mitochondrique est un régulateur clé pour un certain nombre de processus qui sont essentielles à la fonction des cellules normales, y compris la production d’énergie et de l’apoptose. 1 , 2 , 3 le calcium mitochondrique Uniport (MCU), une protéine de transport des ions qui se trouve dans la membrane mitochondriale interne, réglemente l’influx des ions calcium dans les mitochondries. 4 , 5 , 6 les inhibiteurs chimiques de la MCU sont des outils précieux pour la poursuite des efforts pour étudier la fonction et les rôles cellulaires de ce transport des protéines et le calcium mitochondrique. Le composé [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, est un des seuls inhibiteurs sélectifs connus pour le MCU avec une valeur déclarée ded K de 24 µM.7 ,8,9,10 , ce complexe est une impureté commune trouvée dans les formulations commerciales de rouge de ruthénium (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo ponté hexacation de la formule [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, qui a également été utilisé comme un inhibiteur de l’absorption du calcium. Ru360 est disponible dans le commerce, mais il est très coûteux. En outre, la synthèse et l’isolement des Ru360 est contestée par les procédures de purification difficile et méthodes de caractérisation ambiguë.
Nous avons récemment rapporté les procédures alternatives pour accéder à un Ru360 analogique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 ce composé inhibe la MCU avec l’affinité élevée, similaire à Ru360. Dans ce protocole, nous décrirons notre synthèse plus efficace de ce composé, qui commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purification du produit à l’aide de résine échangeuse de cations fortement acide est détaillée, ainsi que les pièges communs pour cette procédure. Aussi, nous présentons des méthodes de caractérisation et d’évaluation de pureté composée et délimiter une approche simple pour tester son efficacité en bloquant l’absorption calcique mitochondriale.

<table><tbody><tr><td>Hydrate de trichlorure de ruthénium</td><td>Pressure Chemical</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique concentré</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium concentré</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Vert de calcium 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Flacon à fond rond</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon en verre</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>Colonne en verre de 10 mm x 15 cm avec réservoirs</td><td>Sur mesure - similaire aux colonnes Chemglass</td><td>Articles similaires à CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon à fond rond</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 boîtes de Pétri</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>hémacytomètre</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>cuvettes acryliques</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre UV-Vis</td><td>Agilent Modèle Cary 8454&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre</td><td>SLM Modèle 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre IR</td><td>Bruker Hyprion FTIR avec accessoire</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>ALC Modèle PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière inversée</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>Référence 89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Nous détaillons la synthèse et la purification d’un inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La synthèse optimisée de ce composé commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH dans un récipient fermé, ce qui donne une solution verte. Purification s’effectue par chromatographie échangeuse de cations. Ce composé est caractérisé et vérifié comme pure par spectroscopie UV-visible et IR. Les propriétés inhibitrices de l’absorption de calcium mitochondrique sont évaluées dans les cellules HeLa perméabilisées par spectroscopie de fluorescence.

Cette méthode décrit une synthèse du calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, une matériel de départ bien connu de ruthénium (III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 est caractérisés par spectroscopie IR, avec des modes de vibration à 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm<sup...

Un protocole pour la synthèse, purification et caractérisation d’un inhibiteur de ruthénium-basée de la capture de calcium mitochondrique est présenté. Une procédure pour évaluer son efficacité dans les cellules de mammifères perméabilisées est démontrée.

Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

L’objectif global de la synthèse et de la purification est de produire relativement facilement un analogue du ruthénium 360 utilisé dans les tests d’absorption du calcium mitochondrial qui est 10 fois plus efficace que le ruthénium 360 disponible dans le commerce. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du calcium mitochondrial en fournissant un inhibiteur pur de l’absorption du calcium mitochondrial. Le principal avantage de cette technique est que le produit final est à la fois très puissant et pur.Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la purification nécessite du temps et de la patience. La productrice sera Sarah Nathan, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Commencer cette procédure par la synthèse de la pentaammine, du dichlorure de chlororuthénium comme décrit dans le protocole de texte.Dissoudre 100 milligrammes de dichlorure de chloro-ruthénium pentaammine dans 50 millilitres d’une solution molaire d’hydroxyde d’ammonium dans une fiole à fond rond de 200 millilitres. Fermez le ballon sans serrer avec un bouchon en verre et chauffez le mélange réactionnel à 75 degrés Celsius p

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Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries...

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Cette vidéo décrit un test basé sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans des mitochondries isolées. Le test analyse le signal de fluorescence d’un colorant fluorescent sensible au calcium pour étudier la cinétique de l’absorption mitochondriale du calcium et de la surcharge calcique.

Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

Cette vidéo décrit un test basé sur l’imagerie par microscopie confocale pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules en culture. Le test utilise le colorant fluorescent sensible au calcium Rhod-2/AM pour mesurer le calcium mitochondrial dans les cellules cultivées perméabilisées.

Dosage de l’influx de calcium pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules cultivées

Des complexes ruthénium phosphine sont largement utilisés pour des réactions catalytiques homogènes comme les hydrogénations. La synthèse d'une série de nouveaux complexes du ruthénium tridentate portant le ligand N de N (CH 2 PPh 2) 3 est rapporté. En outre, la réaction stoechiométrique du complexe d'un dihydrure Ru N avec de l'acide lévulinique est décrite.

La synthèse, la caractérisation et la réactivité d&#39;une série de ruthénium<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Complexes

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Nous présentons ici deux protocoles pour mesurer des influx mitochondriale de Ca2 + dans les mitochondries isolées et des cellules. Pour les mitochondries isolées, nous détaillons une plaque base lecteur Ca2 + importation de dosage à l’aide du Ca2 + sensibles teindre calcium vert-5N. Pour les cellules cultivées, on décrit une méthode de microscopie confocale en utilisant le Ca2 + colorant Rhod-2/AM.

Analyses des Influx de Calcium mitochondrique dans les mitochondries isolées et des cellules

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.

Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

Nous présentons une méthode non invasive et en temps réel pour surveiller la santé mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance (RRS). Nous avons utilisé le RRS pour quantifier les états redox mitochondriaux et développé une métrique de la santé mitochondriale, le rapport mitochondrial réduit par résonance Raman (3RMR), qui montre une réponse plus rapide aux variations d’oxygénation que les analytes hémato-gaz traditionnels.

Évaluation en temps réel et non invasive de la fonction mitochondriale à l’aide de la spectroscopie Raman par résonance

Découvrez la synthèse et la purification d'un inhibiteur de l'absorption du calcium mitochondrial basé sur le ruthénium. Cette méthode produit un analogue 360 plus efficace pour les études de biologie mitochondriale.

Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium

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