Le test de bioluminescence utilisant l'ATP

Le test de bioluminescence ATP est une technique courante utilisée pour quantifier les niveaux d’ATP et de détecter les cellules vivantes, métaboliquement actives. ATP ou adénosine triphosphate est la principale source d’énergie pour tous les organismes vivants, et par « tout » ce que nous entendons tous. Au niveau cellulaire, l’ATP est généré grâce à un ensemble de processus métaboliques, appelé respiration cellulaire.

Aujourd'hui, nous discuterons brièvement les voies impliquées dans la respiration cellulaire. Ensuite, nous allons introduire les principes qui sous-tendent le test de bioluminescence ATP et passent par un protocole étape par étape pour réaliser ce procédé. Enfin, nous verrons comment les scientifiques sont appliqué cette technique dans leurs recherches en cours.

Permet de commencer par l’introduction de la respiration cellulaire. Ce phénomène implique plusieurs processus métaboliques, mais nous allons nous concentrer sur l’un traitant du métabolisme du glucose.

Dans le cytoplasme, la voie de la glycolyse transforme le glucose en pyruvate et dans le processus génère deux molécules d’ATP. Pyruvate est transporté dans la mitochondrie, où il est converti en acétyl-coenzyme A, un processus qui génère également du dioxyde de carbone. Tout en restant dans les mitochondries, l’acétyl-coenzyme A puis pénètre dans l’acide tricarboxylique ou cycle de Krebs, au cours de laquelle le dioxyde de carbone est encore une fois généré, comme sont les molécules à haute énergie du NADH et FADH2. Ces molécules en fin de compte « transportent » électrons dans la chaîne de transport d’électrons ou ETC.

Au sein de l’ETC, les électrons sont séquentiellement transférés entre complexes de différentes protéines dans la membrane mitochondriale interne, avant de convertir l’oxygène en eau. Au cours de ce processus, les protons sont « pompés » dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie. ATP se produit effectivement lorsque ces protons entrez dans la matrice mitochondriale pendant qu’ils traversent une protéine appelée ATP synthase. Ensemble, le cycle de Krebs et etc. entraînent la synthèse de 36 molécules d’ATP. Ventilation d’autres molécules d’éléments nutritifs, tels que les lipides et les protéines, peut aussi alimenter le cycle de Krebs et etc., conduisant à la production d’ATP.

Maintenant que nous savons comment les cellules génèrent de l’ATP, nous allons connaître les principes qui sous-tendent le test ATP bioluminescence, qui est couramment utilisé pour mesurer les concentrations intracellulaires de cette molécule.

Structurellement, l’ATP a une base adénine, un sucre ribose et trois groupements phosphate — laquelle est reliées par des liaisons à haute énergie. Ces obligations libèrent de l’énergie si cassé, et le test de bioluminescence ATP capitalise sur cette énergie.

Fondamentalement, ce test nécessite la luciférine composé, qui est obtenu à partir des organismes « rougeoyant » comme les lucioles, et l’enzyme catalyseur correspondant appelé luciférase. En présence d’oxygène, la luciférase tire l’énergie de l’ATP et convertit la luciférine en oxyluciferin. Sous-produits de cette réaction sont pyrophosphate, c'est-à-dire deux groupes phosphate obtenus à partir d’ATP — convertissant en adénosine monophosphate ou AMP — dioxyde de carbone et de lumière ou de luminescence. Luminescence est lu par un luminomètre, une machine qui quantifie l’émission de lumière. Puisque la quantité de luminescence produit est directement proportionnelle à la quantité d’ATP, c’est un bon indicateur de la viabilité cellulaire et le métabolisme.

Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent le test de bioluminescence ATP, nous allons décrire un protocole général.

Tout d’abord, les cellules sont ensemencées dans une plaque à 96 puits contenant des milieux de culture. Les cellules sont plaquées à différentes densités en trois exemplaires, pour tenir compte de la variation de densité-dépendance. Étant donné que les puits plus externe ne sont pas entourés d’autres puits sur les quatre côtés, le taux d’évaporation et de la température dans ces puits peut être variable. Par conséquent, cellules ne sont pas plaqués dans les puits de l’extérieurs, et au lieu de cela, ils sont remplis d’eau pour éviter les variations évaporation et de la température à l’échelle de la plaque qui peuvent affecter la réaction. Plaques sont ensuite incubés durant une nuit à 37° C pour permettre à des cellules d’adhérer aux plaques de culture.

Ensuite, la presse est supprimée, luciférase et luciférine sont a ajouté à chaque puits et la plaque est placée sur un agitateur de 5 à 15 minutes afin de faciliter la réaction. Ensuite, une partie du mélange dans chaque puits est transférée à une plaque de 96 puits blanche ; plaques blanches sont souvent utilisés car ils réfléchissent la lumière vers le haut, permettant une lecture plus précise de luminescence. En outre, des bulles il faut éviter, car ils pourraient interférer avec les analyses subséquentes. Comme le signal de la luminescence peut diminuer au fil du temps, la plaque est lue dans les 10 à 12 minutes sur un luminomètre.

Pour analyser les résultats de luminomètre, une valeur moyenne de luminescence est calculée à partir de puits avec la même densité de cellules. En comparant les données de luminescence obtenues de cette manière à la fois des échantillons témoins sains et les cellules traitées, les chercheurs peuvent évaluer les effets d’un traitement spécifique sur la viabilité et le métabolisme — plus précisément par la recherche de luminescence a diminué dans le groupe expérimental.

Maintenant que vous avez vu comment effectuer un test de bioluminescence ATP, nous allons discuter de ses applications de recherche.

Les scientifiques cherchent toujours à développer de nouveaux antiviraux qui ne blesser ou tuer des cellules de l’hôte. Dans cette étude, les cellules de mammifères ont été ensemencées dans une plaque multipuite et infectés par un virus spécifique. Divers composés antiviraux ont été ajoutés à ces échantillons, et les courbes concentration-réponse de journal ont été générés pour calculer la concentration effective cinquante ou CE50. CE50 est la concentration du composé à cellule viabilité est 50 pour cent. Il s’agit d’un paramètre couramment utilisé pour évaluer la cytotoxicité d’un composé.

Taux d’ATP peuvent aussi donnent des indices sur l’activité mitochondriale dans diverses conditions. Ici, le test de bioluminescence ATP a été réalisé sur les préparatifs des mitochondries provenant du foie de rongeurs et des cellules musculaires, ce qui a aidé les chercheurs à évaluer l’étendue de la fonction mitochondriale dans les tissus normaux. Ce qui est important, ce protocole pourrait être étendu pour fournir un moyen d’examiner la fonction mitochondriale dans les états pathologiques.

Les scientifiques utilisent également ce dosage pour enquêter sur les éventuels traitements contre le cancer dans les systèmes de in vivo . Dans cet exemple, les cellules tumorales humaines ont été modifiées à la luciférase express et injectés dans le cerveau des souris vivantes. Après que les cellules tumorales s’établissent à ces animaux, ils ont été traités avec un médicament anticancéreux. Un test de bioluminescence subséquent en vivo ATP a révélé que les cellules tumorales chez des souris exposés au médicament des niveaux inférieurs d’ATP.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE au test ATP bioluminescence. Vous devez maintenant être familiarisé avec les voies de la respiration cellulaire et le protocole utilisé pour mesurer l’ATP, qui est le produit final de ces voies. Le test de bioluminescence ATP sert comme un outil de dépistage excellent pour les biologistes cellulaires intéressé à étudier l’effet de facteurs physiologiques et pathologiques sur le métabolisme cellulaire et la viabilité. Comme toujours, Merci pour regarder !