Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir suffisamment de cellules des ganglions de la racine dorsale et des nerfs sciatiques d’une souris individuelle afin de pouvoir effectuer une analyse par cytométrie en flux des cellules. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le matériel neuronal périphérique génère de grandes quantités de débris lors de la digestion. Le principal avantage de cette méthode est que plusieurs marqueurs peuvent être utilisés simultanément pour identifier plusieurs types de cellules.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de l’inflammation et de l’immunopathologie au cours de la neuropathie. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur des modèles murins, elle peut également être appliquée à d’autres organismes, tels que les nerfs humains et porcins, avec des modifications mineures. Généralement, les personnes novices dans la méthode auront du mal en raison des grandes quantités de débris générés par les digestions.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de dissection et de dissociation cellulaire sont difficiles à réaliser car le matériel neuronal par souris est limitant. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons vu un protocole isolant la cellule du cygne du nerf sciatique dans le laboratoire de Steve Lacroix. Pour commencer, préparez la souris comme décrit dans le protocole textuel ci-joint et positionnez-la ventrale vers le bas tout en étirant les membres inférieurs.

Ensuite, utilisez une paire de pinces pour disséquer bilatéralement l’ensemble des nerfs sciatiques. Commencez par séparer le tissu musculaire de la partie supérieure de la cuisse dorsale et suivez le nerf le long de la colonne vertébrale. Coupez le nerf à l’endroit où il sort de la colonne vertébrale et immédiatement au-dessus du genou à l’autre extrémité.

Transférez ensuite les nerfs excisés dans un tube de 1,5 millilitre contenant 1 millilitre de PBS glacé. Stockez les nerfs sur de la glace. Ensuite, isolez le ganglion de la racine dorsale.

Commencez par couper les côtes parallèlement et près de la colonne vertébrale des deux côtés. Ensuite, coupez transversalement la colonne vertébrale au niveau des fémurs sur la face postérieure et près du crâne sur la face antérieure. Retirez la colonne vertébrale et utilisez des ciseaux à iris pour couper tous les muscles, la graisse et les autres tissus mous de la colonne vertébrale.

Ensuite, placez la colonne vertébrale avec la face ventrale vers le haut et ouvrez-la en commençant par l’extrémité caudale en glissant une pointe des ciseaux dans le canal vertébral à la position 12 heures et en coupant l’os. En continuant jusqu’à ce que toute la colonne vertébrale soit coupée, répétez cette procédure à la position six heures jusqu’à ce que la colonne vertébrale soit coupée en deux. Séparez les deux moitiés de la colonne vertébrale, puis placez l’échantillon sous un microscope de dissection.

Retirez la moelle épinière pour exposer les nerfs rachidiens, puis localisez et retirez les ganglions de la racine dorsale lombaire en tirant doucement sur la racine dorsale pour la tirer dans les canaux vertébraux. Ensuite, utilisez des ciseaux à iris pour couper les nerfs et le tissu conjonctif autour du ganglion de la racine dorsale. À l’aide d’une pince, transférez les ganglions de la racine dorsale dans un tube de 1,5 millilitre et rangez-les sur de la glace.

Localiser les ganglions de la racine dorsale, les extraire sans les endommager et les libérer du nerf rachidien nécessite de l’exercice et de l’habileté. Préparez un milieu de digestion, complétez-le avec cent microgrammes par millilitre de désoxyribonucléase et conservez-le sur de la glace. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu de digestion dans chacun des tubes avec les nerfs sciatiques et les ganglions de la racine dorsale.

Pour les nerfs sciatiques, hachez le matériau 15 à 20 fois à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort, puis incubez les suspensions de tissus dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes avec une agitation douce. Après l’incubation, triturez à plusieurs reprises les cellules en suspension à travers une pointe de pipette de 1 000 microlitres pour dissocier mécaniquement tout tissu incomplètement digéré. Répétez la trituration à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres.

Ensuite, incubez l’échantillon pendant 10 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius avec une agitation douce. Préparez le tampon FACS glacé et utilisez-le pour rincer et tremper un tamis en acier inoxydable d’une taille de maille de 140 microns dans une boîte de Pétri de 60 millimètres sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pince émoussée, maintenez le filtre à tamis de 140 microns sur la boîte de Pétri et faites passer à plusieurs reprises les suspensions de tissus à travers le filtre.

Récupérez la suspension cellulaire de la boîte de Pétri et transférez-la dans le même tube de 1,5 millilitre stocké sur de la glace. Poussez tout tissu incomplètement digéré qui reste sur le filtre par trituration répétée avec une pointe de pipette de 1 000 microlitres. Ensuite, rincez deux fois le filtre à tamis avec 500 microlitres de tampon FACS et combinez-le avec la suspension cellulaire dans le tube de 1,5 millilitre.

Si une trop grande partie de l’échantillon n’est pas complètement digérée et passe à travers le treillis métallique, une perte de cellules peut se produire et l’analyse par cytométrie en flux peut être impossible. Centrifugez les suspensions cellulaires et jetez le surnageant. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de tampon FACS.

Répétez cette étape de lavage une fois, en remettant en suspension la pastille de cellule finale dans 150 à 350 microlitres de tampon FACS. Les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration. Sur l’ordinateur, sélectionnez les canaux appropriés pour la détection des fluorophores d’intérêt, le débit approprié des échantillons et le nombre total d’événements à collecter par échantillon.

Le nombre minimum d’événements doit être d’un million. Ensuite, créez des diagrammes de dispersion sous une feuille de calcul globale de la diffusion latérale A par rapport à la diffusion directe A ainsi que pour chaque fluorophore d’intérêt par rapport à la diffusion directe A.Créez également une vue statistique qui affichera le nombre d’événements et l’intensité fluorescente moyenne pour les fluorophores sélectionnés. Déterminez la porte parente, P1, sur la base du nuage de points à partir des contrôles de coloration DAPI uniquement.

Fixez l’échantillon à la cytométrie en flux et cliquez sur acquérir. Observez le graphique DAPI en fonction du FSC et réduisez la tension du canal bleu pacifique de l’ADN jusqu’à ce que la population DAPI+ devienne visible. À l’aide de l’outil de contrôle rectangulaire, dessinez une boîte autour de DAPI+population.

Il s’agit de la porte P1. Sélectionnez les nuages de points pour chacun des fluorophores et affichez uniquement les événements DAPI+. Il s’agit de la fluorescence de fond de chacun des fluorophores.

À l’aide du contrôle rectangulaire, dessinez une case dans les nuages de points pour chacun des fluorophores, en commençant à 103 sur l’axe des y. Cette porte représente la région dans laquelle les événements positifs pour chacun des marqueurs énoncés doivent être trouvés. Ajustez les tensions de chacun des fluorophores à l’aide des commandes de coloration DAPI uniquement.

Fixez l’échantillon à la cytométrie en flux et cliquez sur acquérir. Observez la position de la population DAPI+population pour chacun des fluorophores et ajustez les tensions respectives de sorte que les populations tombent en dehors de la porte rectangulaire. Une fois le cytomètre en flux configuré, analysez les échantillons et exportez les fichiers Forward Scatter pour une analyse plus approfondie.

Le lavage de la coloration DAPI avant l’analyse par cytométrie en flux a diminué l’intensité fluorescente des débris non nucléés. Cela a permis d’exclure le matériel situé à l’extrémité supérieure de l’axe de diffusion vers l’avant, qui contient des tissus incomplètement digérés, dans la sélection de la population singulet. Au total, plus de 30 000 singlets peuvent être obtenus régulièrement à partir de deux nerfs sciatiques complets et plus de 200 000 singlets peuvent être obtenus à partir des ganglions de la racine dorsale.

À partir des nerfs sciatiques, environ 5 % des singlets exprimaient le CD45 à leur surface, tandis qu’environ 5 à 10 % l’exprimaient dans les ganglions de la racine dorsale, définissant ainsi ces cellules comme des leucocytes d’origine hématopoïétique. La majorité des singlets CD45 positifs ont également exprimé le CMH de classe II de manière progressive. Dans les ganglions de la racine dorsale, CD11b peut cependant être utilisé pour détecter des cellules microgliales de type ; Cette population de microglie est absente des nerfs sciatiques.

Dans le nerf sciatique et le ganglion de la racine dorsale, 2 à 5 % des singulets exprimaient CD68. Dans les nerfs sciatiques, environ 60 %80 % des macrophages CD68 positifs exprimaient CD206. Alors qu’une plus petite proportion de CD68 positifs co-exprimait CD206 dans le ganglion de la racine dorsale.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de maintenir une température constante afin d’assurer un résultat cohérent. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du diabète d’explorer les effets toxiques de la streptozotocine utilisée pour induire le diabète chez la souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la cytométrie en flux sur les tissus neuronaux périphériques.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être dangereux et que des précautions doivent toujours être prises, comme le port de gants et de lunettes de sécurité.