Name: Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez une méthode d'histochimie du zinc synaptique pour distinguer les régions et couches cérébrales chez le furet. Cette technique simple et fiable permet d'identifier les structures du cerveau en développement et adulte.

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Ce travail a été soutenu par subventions du National Center for Research Resources (2G12RR03060-26A1) ; L’Institut National sur la santé de minorité et les disparités de santé (8G12MD007603-27) des National Institutes of Health ; Professionnel du personnel Congrès-City University of New York (CUNY-CFP) ; et Faculty Research Grant (FRG II) Université américaine de Sharjah. Nous remercions Vidyasagar Sriramoju pour nous introduire à ces méthodes.

<ol><li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026685">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li>
<li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li>
<li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li>
<li>Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-positive+boutons+in+the+cerebral+cortex+of+lizards+show+glutamate+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity.</a> J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).</li>
<li>Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+localization+of+synaptic+zinc+in+the+developing+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex.</a> J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).</li>
<li>Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse.</a> Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).</li>
<li>Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+%28Macropus+parma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li>
<li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase%2C+zinc%2C+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li>
<li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00543951">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li>
<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li>
<li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li>
<li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17%2C+18%2C+19+and+21+in+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li>
<li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li>
<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
<li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+%28Sciurus+carolinensis.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li>
<li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li>
<li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li>
<li>Timm, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00665092">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La présente étude utilise une technique histochimique basée sur une version modifiée de la Danscher méthode (1982)10, auquel cas localisation synaptique de zinc peut-être être détectée et visualisée dans le cerveau. Cette méthode fonctionne essentiellement en injectant l’animal avec le sélénite de sodium chélateur de zinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Après l’injection, la sélénite se rend au cerveau et se lie au zinc gratuit qui est localisé dans les vésicules présynaptiques de zinc...

Taches histologiques ont été utilisées traditionnellement pour aider à l’identification des aires corticales chez diverses espèces de révéler des différences dans les caractéristiques architectoniques. L’utilisation combinée des techniques histochimiques telles que pour la substance Nissl, réactivité de la cytochrome oxydase (CO) ou la myéline peut se révéler fructueuse qu’ils révèlent des limites areal semblables dans le cerveau adulte. Cependant, ces taches histochimiques ne révèlent pas toujours bien des limites claires entre les aires corticales et les couches dans le cerveau immature.
Dans le système nerveux central, le zinc a plusieurs fonctions essentielles qui incluent de stabiliser la structure de l’ADN, agissant comme un cofacteur de l’enzyme, participant à nombreuses fonctions de réglementation et agissant comme un neuromodulateur grâce à sa présence dans les vésicules synaptiques 1. zinc synaptique est unique car il peut être visualisé à l’aide des méthodes histologiques, tandis que le zinc protéinique ne peut pas être visualisé2. Cette fonctionnalité a été exploitée pour révéler le modèle zinc synaptique dans différentes régions corticales et histochimie synaptique de zinc a été utilisé dans un certain nombre d’études. Un sous-ensemble des neurones glutamatergiques dans le cortex cérébral contiennent du zinc dans les vésicules présynaptiques dans leur axone bornes3,4. Les études histochimiques ont révélé une distribution hétérogène de zinc synaptique dans le cortex cérébral5,6,7. Il semble y avoir une autre distribution surfacique et laminaire zinc histochimiquement réactif dans différentes régions du cortex (par exemple, visual contre cortex somatosensoriel), ou des couches (p. ex., les niveaux de zinc dans la supragranular et infragranular couches du cortex visuel primaire sont sensiblement plus élevés que dans thalamocortical couche d’entrée IV avec des niveaux relativement faibles de zinc synaptique)5,8,9. L’hétérogénéité en zinc synaptique coloration observées dans le cortex est particulièrement avantageuse, car elle facilite l’identification areal et laminaire.
Nous présentons ici une description détaillée d’une procédure histochimiques zinc synaptique, qui est une version modifiée de 1982 méthode10 de Danscher. Cette méthode utilise le sélénite injecté par voie intrapéritonéale (IP) dans les animaux comme agent chélateur. Le sélénite se rend au cerveau à réagir avec des piscines de zinc gratuit trouvé dans les vésicules d’un sous-ensemble des synapses glutamatergiques dans le cerveau. Cette réaction donne un précipité qui peut être amélioré par la suite en développement argent2,10,11.
Cette procédure révèle des tendances laminaires et surfaciques de zinc synaptique coloration ; analyse densitométrique peut servir à évaluer ces patrons qualitativement et quantitativement dans le cerveau adult et immature pour étudier les effets d’autres interventions, comme les manipulations sensorielles, environnementales, pharmacologiques ou génétiques. En outre, on peut vouloir aussi évaluer d’éventuels changements dans la distribution de zinc synaptique dans d’autres structures corticales ou sous-corticales dans d’autres systèmes de modèle. Les informations quantitatives fournies par analyse densitométrique dans cette méthode peuvent être avantageux pour le développement du cerveau suivant au fil du temps. Ce protocole prévoit un compagnon d’autres immuno - histochimiques marqueurs et pour révéler les limites laminaires et surfaciques.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (solution d’euthanasie)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml injectables</td></tr><tr><td>Xylazine (Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml injectables</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilué à 4 %</td></tr><tr><td>Gomme arabique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hydroquinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Lactate d’argent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de poisson</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td>(Type III, du cœur équin)</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Utilisé pour la déshydratation avant le montage des lames</td></tr><tr><td>Brain</td><td>Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Lames dépolies non sous-titrées</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Pour assembler des images</td></tr>, <tr><td>ImageJ</td><td>Un logiciel gratuit peut être téléchargé à l’adresse http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Pour les mesures densométriques</td></tr><tr><td>Plateau en plastique</td><td>Tout plateau en plastique standard peut être utilisé</td><td></td><td>pour immerger les lames dans la solution</td></tr><tr><td>de développement Plaque chauffante</td><td>N’importe quelle plaque chauffante standard peut être utilisée</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et adult

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Caractérisation de l’Organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau et le développement nécessite une identification exacte des circuits neurones distincts et des régions dans le cerveau adulte et immature. Nous décrivons ici une méthode de coloration histochimique zinc qui révèle des différences dans les profils de coloration entre les différentes couches et les régions du cerveau. D’autres ont utilisé cette procédure non seulement pour révéler la distribution des neurones contenant du zinc et des circuits dans le cerveau, mais aussi de délimiter avec succès des limites areal et laminaires dans le cerveau en développement et adult dans plusieurs espèces. Ici, nous illustrons cela souillant le procédé avec des images des pays en développement et de la cervelle de furet adulte. Nous révèlent un modèle zinc-coloration qui sert comme un marqueur anatomique des zones et des couches et peut être utilisés de manière fiable pour distinguer les aires corticales visuelles dans le cortex visuel en développement et les adult. Le principal objectif du présent protocole est de présenter une méthode histochimique qui permet l’identification précise des couches et des régions dans le cerveau en développement et adulte où les autres méthodes ne parviennent pas à le faire. Secondairement, en conjonction avec l’analyse densitométrique image, cette méthode permet d’évaluer la distribution de zinc synaptique pour révéler des changements possibles au cours du développement. Ce protocole décrit en détail les réactifs, des outils et démarches nécessaires pour colorer successivement les sections du cerveau gelé. Bien que ce protocole est décrit à l’aide de tissus cérébraux de furet, il peut être facilement adapté pour être utilisé dans les rongeurs, les chats ou les singes ainsi que dans d’autres régions du cerveau.

Les grandes étapes de ce protocole pour colorer les sections du cerveau pour le zinc synaptique sont présentés dans un organigramme de la Figure 1. Le protocole peut être divisé en trois phases : 1) Perfusion et prélèvement tissulaire, préparation du tissu 2) et coloration et histochimie Zinc 3). En bref, au cours de la première phase du protocole, l’animal est anesthésié et la dose appropriée de sélénite de sodium injection IP. Après une période suffisamment...

Nous décrivons une procédure histochimique qui révèle des caractéristique zinc laminaire et areal coloration modèles dans différentes régions du cerveau. Le patron de coloration zinc peut servir en conjonction avec d’autres marqueurs anatomiques à fiable distinguer des couches et des régions du cerveau en développement et les adulte.

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

L’objectif global de cette méthode est d’effectuer une coloration histochimique sur des sections de cerveau congelées de furet afin d’illustrer l’utilisation des modèles de coloration synaptique au zinc pour distinguer différentes régions et couches du cerveau en développement et du cerveau adulte. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés telles que les différences qualitatives et quantitatives dans le modèle de coloration synaptique du zinc entre différentes régions et couches du cerveau. Le principal avantage est que cette technique est simple et fiable, permettant d’identifier différentes régions et couches du cerveau en développement et adulte sur la base de modèles de coloration uniques.Bien que cette méthode ait été utilisée pour fournir des informations sur la démarcation des zones et des couches du cortex visuel sauvage, elle peut également être utilisée pour différencier les couches de différentes régions du cerveau des rongeurs, des chats ou des primates. Pour préparer 200 millilitres de la solution du révélateur, ajoutez lentement 40 grammes de gomme arabique à 120 millilitres d’eau chaude et continuez à le remuer avec une tige de verre pour le dissoudre complètement. Ensuite, il le laisse refroidir pendant quelques minutes, puis le filtre à travers six à huit couches de tissu de gaze dans un entonnoir.Ajoutez ensuite 5,04 grammes d’acide citrique et 4,7 grammes de citrate de sodium dans 20 millilitres d’eau distillée et dissolvez pour faire le tampon de citrate. Ajoutez ensuite 1,7 gramme d’hydroquinone à 30 millilitres d’eau distillée chauffée. Ajoutez 0,22 gramme de lactate d’argent à 30 millilitres d’eau pour obtenir une solution de lactate d’argent.Dans l’ordre suivant, mélangez les solutions de gomme arabique, de citrate, d’hydroquinone et enfin de lactate d’argent pour préparer la solution du révélateur et la garder dans l’obscurité. Pour commencer cette procédure, injectez une dose de 15 milligrammes par kilogramme de poids corporel de solution de sélénite de sodium, un chélateur de zinc, par voie intrapéritonéale dans le furet anesthésié. Attendez ensuite 60 à 90 minutes pour que la solution de sélénite de sodium atteigne le cerveau.Ensuite, injectez une surdose de 100 milligrammes par kilogramme de phénobarbital par voie intrapéritonéale pour euthanasier l’animal et attendez plusieurs minutes pour que l’euthasol agisse. Effectuez une perfusion transcardique sur le furet euthanasié d’abord avec une solution saline normale pendant une minute, puis avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes. Ensuite, utilisez un fixateur avec du saccharose pour terminer la procédure de fixation totale en une heure.Utilisez un scalpel pour faire une incision médiane en partant du nez vers le cou pour exposer le crâne. Retirez délicatement le cerveau puis utilisez une lame de scalpel pour séparer les hémisphères. Ensuite, coupez et séparez la partie postérieure du reste du cerveau et post-fixez pendant deux à quatre heures.Laissez le cerveau couler en maintenant le tissu dans une solution à 30 % de saccharose dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire. Une fois que le cerveau s’enfonce, utilisez un microtome coulissant congelé pour faire des sections semi-tangentielles de 40 micromètres d’épaisseur à travers le cortex visuel. À l’aide d’un pinceau, rassemblez toutes les sections du cerveau et placez-les dans une boîte à pêche remplie de solution saline tamponnée au phosphate.Ensuite, montez rapidement une ou deux séries de sections cérébrales sur des lames recouvertes de blanc d’œuf. Conservez les lames à température ambiante pendant la nuit pour qu’elles sèchent. Une fois les lames sèches, plongez-les dans de l’alcool absolu pendant 15 minutes.Attendez ensuite une heure pour laisser les lames sécher complètement à température ambiante. Immergez rapidement les sections dans une solution de gélatine à 1 % pendant 10 secondes, puis égouttez-les soigneusement. Gardez les sections à température ambiante pour sécher pendant la nuit.Utilisez un plateau en plastique pour disposer les lames côte à côte. Versez ensuite sur la solution de développement et assurez-vous que les lames y sont complètement immergées. N’oubliez pas de vérifier les sections toutes les 30 minutes pour le développement de la réaction.Si les diapositives ont été tachées de manière appropriée, retirez les sections montées sur les diapositives du plateau et conservez les diapositives sur un support de diapositives. À l’aide d’un grand plat en verre, lavez les diapositives à l’intérieur du support à lames sous l’eau courante tiède pendant 10 minutes pour laver la couche de gélatine et le dépôt d’argent extérieur. Après avoir séché les lames à température ambiante, déshydratez-les pendant cinq minutes dans de l’éthanol à 100 % et éclaircissez-les pendant cinq minutes dans du xylène.Enfin, placez une lamelle avec support de montage sur la diapositive. Utilisez un microscope à fond clair pour examiner les sections et prendre des photos des zones d’intérêt. Sélectionnez des sections colorées au zinc dans des photomicrographies de régions d’intérêt pour choisir au hasard des colonnes corticales d’une largeur d’environ 450 micromètres.Dans chaque région d’intérêt, choisissez un nombre approprié d’échantillons de colonnes provenant de plusieurs sections cérébrales différentes. Transférez ensuite les images des colonnes vers un logiciel de traitement d’images. Dans le logiciel, utilisez l’outil de section rectangulaire pour englober l’ensemble de la colonne corticale.Ensuite, utilisez l’outil d’inversion pour inverser le contraste de l’image. Utilisez ensuite l’outil de profil de tracé pour créer un graphique bidimensionnel des intensités de pixels le long de la ligne afin de produire des profils de densité optique à partir des images. Enfin, utilisez les options de profil de tracé pour convertir le graphique de profil de tracé en profil vertical.Cliquez à nouveau sur le profil de l’intrigue. Des photomicrographies de coupes semi-tangentielles colorées au zinc de cerveau de furet juvénile montrent la caractérisation de tissus sur-colorés et sous-colorés. Les tissus trop colorés développent une couleur brun très foncé avec une variation laminaire insuffisante et une matière blanche densément colorée.En revanche, les tissus sous-colorés développent une couleur brun clair avec une substance blanche peu colorée. Des photomicrographies de coupes semi-tangentielles montrent une coloration synaptique du zinc dans la cytochrome oxydase dans les zones corticales visuelles d’un furet adulte. L’intensité de la coloration du zinc synaptique est élevée dans les couches supragranulaires et infragranulaires des zones 17 et 18, tandis que la couche quatre colore légèrement.Inversement, la couche quatre, d’aire 17 et 18, est fortement colorée lorsqu’elle est colorée pour la réactivité de la cytochrome oxydase. Les photomicrographies colonnaires montrent une distribution laminaire du zinc synaptique dans toutes les couches corticales avec leurs valeurs de densité optique normalisées complémentaires. Pour refléter les changements dans la coloration synaptique du zinc en fonction de la profondeur corticale, des tracés normalisés des valeurs de densité optique ont été générés à chaque aire corticale visuelle.L’auge présente dans les profils des parcelles montre une faible coloration synaptique au zinc dans la couche quatre des zones 17 et 18. Cette procédure peut aider à expliquer s’il y a des changements de développement et d’intensité de coloration dans des régions cérébrales particulières au fil du temps. Cette technique s’est avérée utile pour les chercheurs en neuroanatomie afin d’explorer comment les manipulations sensorielles, environnementales, pharmacologiques ou génétiques peuvent affecter la distribution de la coloration synaptique du zinc chez l’adulte et le cerveau immature chez une gamme d’espèces.Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans vos expériences.

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Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.

Trancher les cultures organotypiques d&#39;études de neurogenèse postnatale

Ce protocole présente un procédé pour la récupération morphologique des neurones corrigés lors des enregistrements électrophysiologiques en utilisant le remplissage de la biocytine et de post-traitement immunohistochimique ultérieure. Nous montrons que les sections de biocytin rempli d'épaisseur qui ont été colorées et sous une lamelle peuvent être recolorées avec un deuxième jours ou des mois d'anticorps primaires plus tard.

Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Un protocole pour correctement identifier et analyser les synapses hippocampiques tranches à l’aide d’immunofluorescence est décrite dans cet article.

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

Le protocole décrit ici décrit immunofluorescence analyse, récupération de la biocytine et reconstitutions de haute qualité d’hippocampe CA2 interneurones suivant le permettant des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires in vitro, neuronale caractérisation et finalement fine anatomie neuronale à étudier.

Récupération de la biocytine et Reconstructions 3D des interneurones CA2 hippocampe rempli

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

Nous décrivons les procédures de traitement du tissu cérébral du rat nouveau-né afin d’obtenir des micrographies électroniques à haute résolution pour l’analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Les micrographies obtenues avec ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la morphologie d’un certain nombre d’autres composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles.

Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux

La cryo-section-dissection permet une préparation fraîche et congelée de la plus grande niche neurogène du cerveau murin pour une analyse quantitative approfondie du protéome. La méthode est précise, efficace et provoque une perturbation tissulaire minimale. Par conséquent, il est idéal pour étudier le microenvironnement moléculaire de cette niche, ainsi que d’autres organes, régions et espèces.

Dissection cryo-section de la zone sous-épendymaire adulte pour une analyse quantitative précise et approfondie du protéome

Le protocole présenté décrit l’utilisation de la microscopie électronique à transmission (MET) pour quantifier les changements circadiens dans le cortex du baril de la souris, en se concentrant principalement sur le nombre de synapses et la morphologie de la colonne dendritique.

La microscopie électronique à transmission comme technique de visualisation pour l’analyse de la plasticité synaptique circadienne dans le cortex cylindrique de la souris

Découvrez une méthode d'histochimie du zinc synaptique pour distinguer les régions et couches cérébrales chez le furet. Cette technique simple et fiable permet d'identifier les structures du cerveau en développement et adulte.

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de Zinc synaptique histochimie pour révéler les différentes régions et les limbes dans le cerveau en développement et Adult

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