Name: In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de culture cellulaire pour évaluer rapidement la variance allélique dans les maladies de Fabry et de Pompe. Cette technique reproductible aide au développement de chaperons pharmacologiques.

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Les auteurs aimeraient remercier Mandy lenainquitousse et Tina Czajka excellent soutien technique. Nous remercions langue édition aide Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, é.-u.).

1. préparation du Mutant pcDNA3.1/GLA et pcDNA3.1/GAA constructions
Remarque : Les stratégies de clonage pour la GLA et GAA (cds) de séquences codantes ont été signalés plus tôt15,18.
<ol>
	<li>Mutagenèse dirigée à l’aide de mutagenèse
	<ol>
		<li>La référence des séquences NM_000169.2 et NM_000152.4 en tant que modèles pour la mutagénèse des gènes GLA et GAA , respectivement. Disposer d’un ensemble de haute pureté sel gratuit amorces (25-37-mers) synthétisé par un fournisseur commercial, avec des amorces sens et anti-sens transportant un des modifications respectives séquence centrales à leur longueur de présenter individuellement la mutation. Utilisez l’outil de conception d’amorce libre pour soutenir l’apprêt conception19.</li>
		<li>Pour le mélange réactionnel, utiliser les conditions standards pour la solution de réaction et des conditions d’amplification fournies par le fabricant.<ol>
			<li>Mix 5 µL de 10 x tampon de réaction, 10 ng de plasmide modèle bicaténaire ADN pcDNA3.1/GLA ou pcDNA3.1/GAA, 125 ng de chaque amorce, 1 µL du mélange dNTP fourni, 3 µL de réactif de DMSO dans un volume approprié d’eau désionisée (volume de réaction finale : 50 ΜL). Enfin, ajouter 2,5 U de l’ADN polymérase et la composition de pipetage de haut en bas. Comme témoin négatif, portent sur un échantillon non-primer.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Commencer la PCR en utilisant le programme suivant : étape 1 : 95 ° C pendant 1 min, étape 2 : 95 ° C pendant 50 s, étape 3 : 60 ° C pendant 50 s, étape 4 : 68 ° C pendant 8 min, répétez l’étape 2-4 18 fois et étape 5 : 68 ° C pendant 10 min.<ol>
			<li>Après les PCR, ajouter 1 µL de la Dpnj’ai enzyme de restriction (10 U/µL) et incuber encore le flacon de réaction à 37 ° C pendant 1 h.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformation et dépistage pour le Clone désiré
	<ol>
		<li>Transformer une partie aliquote de cellules ultracompetent conformément aux recommandations du fabricant. Moyen SOC utilisation (tryptone 2 % (p/v), levure extrait de 0,5 % (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, stériliser à 121 ° C et puis ajoutez les solutions stérile filtrée de MgCl2 et le glucose jusqu'à la concentration finale de 10 et 20 mM, respectivement) au lieu du fabricant milieu. Après l’intervention, plaque 250 µL de la mutagénèse d’échantillon sur un LB plaque contenant 100 ampicilline de µg/mL et incuber à 37 ° C pendant 18 heures.</li>
		<li>S’assurer que le nombre de transformants est &#62; 10 et la réaction des rendements au moins trois fois plus de colonies comme la réaction de contrôle non-apprêt, par exemple, en utilisant une plaque lumineuse pour faciliter le dénombrement de la colonie. Prélever 3 colonies, puis préparer 3 mL cultures une nuit ou Pluss dans un milieu LB bouillon.</li>
		<li>Le lendemain, procéder à la préparation de plasmide avec un kit standard et analyser la séquence entière à l’aide de T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA LTC TAG GG-3ʹ) et le séquençage des amorces BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) par l’intermédiaire de Sanger standard.</li>
		<li>Un outil adapté de biologie moléculaire permet d’analyser la séquence. Quand la mutation souhaitée est détectée et non plus de séquences anomalie par rapport aux NM_000169.2 (α-galactosidase A) ou NM_000152.4 (α-glucosidase acide) apparaît, sélectionnez le clone pour la purification de plasmide de transfection-grade.</li>
		<li>Déterminer la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance dans un spectrophotomètre. Remarque : Laissez seulement des préparations qui donnent une pureté de plasmide avec un ratio d’absorbance 260/280 de &#62; 1.8 pour cell culture expériences.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. culture de cellules de HEK293H
<ol>
	<li>Maintenir les cellules HEK293H à forte concentration de glucose (4,5 g/L) Dulbecco´s mise à jour le Eagle Medium (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine. Garder les cellules un incubateur à 37 ° C sous une atmosphère de2 CO 5 % de water-jacket.</li>
	<li>Cultiver les cellules à une densité de 80 à 90 %.</li>
	<li>Aspirer le milieu et laver une fois à l’aide de phosphate solution saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +.</li>
	<li>Passage en ajoutant 0,05 % trypsine-EDTA et incuber pendant 5 min à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Fractionner les cellules 01:15 dans un milieu frais et graines dans un nouveau ballon T75 pour maintenir la culture permanente. Ne pas utiliser de cellules avec plus de 25 passages.</li>
</ol>
3. pcDNA3.1/GLA et pcDNA3.1/GAA plasmide Transfection et traitement de HEK293H
<ol>
	<li>24 h avant la transfection, laver les cellules de HEK293H dans un flacon de culture cellulaire T75 une fois avec du PBS avec Ca2 +, Mg2 +. Récolter les cellules avec 0,05 % trypsine-EDTA comme indiqué ci-dessus et semences 1,5 x 105 cellules dans les cavités d’une plaque de culture bien 24 à l’aide de 500 µL de milieu DMEM supplémenté de 10 % FBS sans antibiotiques.</li>
	<li>Réaliser un protocole de transfection selon le manuel du constructeur. En général, utilisez un mélange de 1 µg d’ADN plasmidique et 2,5 µL de réactif de transfection dans 100 µL de milieu sans sérum DMEM. Incuber pendant 20 min à température ambiante et ensuite ajouter aux cellules d’une manière goutte-à-goutte.</li>
	<li>Retirer le support contenant le réactif de transfection après une période de 4 h à 37 °C/5% CO2 et ajouter 500 µL de frais DMEM avec 10 % FBS / 1 % pénicilline/streptomycine. Remarque : Au cours de cette étape, le chlorhydrate de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) ou 1-désoxynojirimycine chlorhydrate (DNJ) peut-être être ajouté à du milieu de culture lorsque destiné (utiliser une solution aqueuse de stock de 10 mM afin d’obtenir une concentration finale de 20 µM DGJ et DNJ ). Frais de DGJ ou DNJ a été ajouté 42 h après la transfection de plasmide.</li>
</ol>
4. cellule récolte et α-galactosidase A ou la mesure de l’activité α-glucosidase acide
<ol>
	<li>Récolte de cellules
	<ol>
		<li>Le jour de la récolte, enlever les cellules de l’incubateur et aspirer le milieu. Se laver soigneusement les cellules 2 fois avec du PBS avec Ca2 + et Mg2 +. Remarque : Cette étape est cruciale car DGJ et DNJ sont de puissants inhibiteurs de le α-galactosidase et α-glucosidase, respectivement, et aucun vestige n’invaliderait le test.</li>
		<li>Ajouter 200 µL d’eau désionisée directement sur les cellules. Rincer les cellules de la plaque et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogénéisation de gel et de dégel
	<ol>
		<li>Placer les échantillons dans un carré de mousse appropriées et vortexer pendant 5 s pour accroître l’efficacité de la lyse. Placer les échantillons en alternance dans l’azote liquide pour 10 s et dans un bain d’eau de température ambiante jusqu'à ce que la décongélation a été complète (5 min).</li>
		<li>Répétez l’opération 5 fois et puis essorer les échantillons pendant 5 min à 10 000 x g.</li></ol></li></ol>Conserver le liquide surnageant et pipette dans un nouveau tube de réaction.
	
	
	<li>Détermination de concentration de protéine à l’aide de dosage de l’acide (BCA) bicinchoninic
	<ol>
		<li>Préparer un nouveau tube pour chaque échantillon contenant 40 µL de désionisée H2O et ajouter 10 µL de l’échantillon. Mélanger la solution au vortex brièvement et transférer 10 µL dans une cavité d’une plaque 96 puits (chaque échantillon en triple exemplaire). Diluer une solution albumine sérique bovine (BSA) 2 mg/mL dans désionisée H2O comme suit pour obtenir une courbe standard : 50 µL H2O/50 µL BSA ; 60 µL H2O/40 µL BSA ; 70 µL H2O/30 µL BSA ; 80 µL H2O/20 µL BSA ; 90 µL H2O/10 µL BSA ; 100 µL H2O.</li>
		<li>Démarrer la réaction en ajoutant 200 µL de réactif BCA (réactif A et réactif B mélangé à un ratio de 50 : 1) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation légère dans un agitateur orbital (300 tr/min) dans l’obscurité. Mesurer l’absorbance à 560 nm dans un lecteur de plaque. Remarque : Les échantillons contiennent généralement entre 1 et 1,5 µg de protéines par µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mesure de l’activité enzymatique avec des substrats artificiels 4-méthylumbelliféryl (4-MUG)
	<ol>
		<li>Diluer la quantité calculée de chaque échantillon et la pipette en tubes de réaction des frais de 1,5 mL pour obtenir des solutions de protéine/µL de µg de 0,05 (pour α-galactosidase A) ou 0,5 (pour α-glucosidase acide). Échantillons pour 5 s à nouveau et ajouter 10 µL de cette dilution dans un 96 bien plaque de Vortex (chaque échantillon en double exemplaire).</li>
		<li>Démarrer la réaction en ajoutant 20 µL de la solution de substrat respectifs : Pour α-galactosidase A: 2 mM 4-méthylumbelliféryl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) dans un tampon citrate 0,06 M phosphate, pH 4,7. Pour α-glucosidase acide : 2 mM 4-méthylumbelliféryl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) en acétate de sodium 0,025 M, pH 4,0.</li>
		<li>Incuber les réactions enzymatiques dans l’obscurité à 37 ° C sous agitation légère dans un agitateur orbital (300 tr/min) pendant 1 heure. Mettre fin à la réaction par l’addition de 200 µL de 1,0 M, tampon de pH 10,5 glycine-NaOH ajusté.</li>
		<li>Préparer une courbe standard de 4-méthylumbelliférone (4-MU) d’un stock de 0,01 mg/mL comme suit : 100 µL H2O / 4 non-MU ; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU ; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU ; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU ; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU ; aucun H2O / 4 100 µL-MU, ajouter 10 µL de chaque dilution dans le puits 96 plaque (en double) et ajouter 200 µL de la mémoire tampon glycine-NaOH de 1,0 M dans chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH.</li>
		<li>Mesure l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du filtre approprié, définir et analyser les données en utilisant le logiciel approprié pour le périphérique de lecture de fluorescence. Remarque : Les deux substrats 4-MUG sont réduits à 4-MU pendant l’exposition à le α-galactosidase A ou α-glucosidase acide. Publié 4-MU est un fluorochrome, qui peut être mesuré à 360 et 465 nm par les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescence.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
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<li>Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , <a target="_blank" href="http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en">http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en</a> (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le protocole décrit ci-après fournit des résultats robustes pour l’évaluation des dommages enzyme dans les maladies lysosomales héréditaires du métabolisme. Ce manuscrit est qu'un amendement au protocole publiée plus tôt15. Les plus importantes modifications impliquent la rigueur (c'est-à-dire, dans le processus de préparation de construction de vecteur mutant), normalisation de la protocole de culture cellulaire (p. ex., conditions de maintenance et de transfection cellulaire HE...

Il existe plus d’une douzaine lysosomales (DSL) associés au dysfonctionnement de glycosidase par suite de mutations géniques primaires. Fabry (OMIM #301500) et la maladie de Pompe (OMIM #232300), plus de 500 et 200 mutations faux-sens ont1,2,3 , respectivement, ce qui correspond à environ 60 % du nombre total de mutation. Nombreuses nouvelles variantes du gène sont toujours identifiés, beaucoup dont ayez inconnu signification. Des études biochimiques ont révélé que certains génotypes ne conduisent pas à une perte de fonction complète du gène GLA (OMIM * 300644) dans la maladie de Fabry, mais provoquer l’enzyme correspondante à l’échec atteindre un État thermodynamiquement favorisé pliant4 . Cela se traduit par la rétention de l’ER et la dégradation prématurée de l’enzyme fonctionnelle dans le cas contraire. Des conclusions similaires ont été tirées dans autres DSL, y compris la maladie de Pompe5. De plus, la caractérisation moléculaire des variantes de l’enzyme peut faciliter l’interprétation clinique des mutations au moment du diagnostic6, ce qui suggère que la progression de LSD est un processus individualisé, basé sur la nature de la mutation. Par conséquent, la classification conventionnelle en généralement de 2 à 3 différents types cliniques devrait être réévaluée afin de rationaliser les conseils cliniques et les décisions thérapeutiques.
Enzymatique substitutive (ERT) est disponible pour ces deux maladies. ERT, cependant, a une efficacité limitée en tissus/organes touchés comme le cerveau et les muscles squelettiques. En outre, ERT peut provoquer une réaction d’immunogène qui met en péril ses bienfaits thérapeutiques. Chaperons pharmacologiques (PCs) sont une alternative séduisante de traitement pour les patients présentant des mutations réactives ce qu’on appelle. SCP service un échafaudage moléculaire pour le repliement des protéines correcte et de stabilisation, qui à son tour empêche la rétention de réticulum endoplasmique (re) et ER-associés de la dégradation de l’enzyme. En outre, PCs peuvent être administrés par voie orale et sont potentiellement capables de traverser la barrière hémato-encéphalique. Par conséquent, le PCT peut être une option plus viable pour le traitement des patients atteints de certains génotypes. Pour une étude approfondie sur l’application de PC en DSL, veuillez consulter l’excellente revue par Parenti7.
La découverte de centaines d’allèles mutants pathogène défie le dépistage des drogues précliniques et nécessite une évaluation simple, rapide et hautement normalisée des patients se prêtent à une approche de la médecine personnalisée. Afin d’évaluer les effets néfastes des mutations du gène LSD et de tester des mutations de candidat pour prédire les patients se prêtent pour le PCT, un système très standardisé surexpression dans les cellules HEK293H qui permet de mesurer l’activité enzymatique rapide et fiable a été mis au point. Des systèmes similaires de surexpression ont été décrits précédemment pour la maladie de Fabry et Pompe utilisant COS-78,9,10,11, HeLa cellules12ou HEK29313 ,14,15,16 cellules pour le gène glycosidase.
Une méthode très similaire a même été brevetée comme « Méthode pour prédire la réponse au traitement pharmacologique chaperon des maladies »17 indiquant la pertinence d’une cellule culture système capable de s’intégrer dans la pratique clinique.

<table><tbody>Kit de mutagénèse <tr><td>dirigée site material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL&nbsp ;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, États-Unis</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Apprêt GLA[R301Q]-frw : 5&acute ;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev : 5&acute ;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw : 5&acute ;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev : 5&acute ;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw : 5&acute ;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev : 5&acute ;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw : 5&acute ;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev : 5&acute ;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw : 5&acute ;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev : 5&acute ;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw : 5&acute ;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev : 5&acute ;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7 : 5&acute ;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev : 5&acute ;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute ;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Allemagne</td><td>n.a.Tryptone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>103 753</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 064 041 000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potasium</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 049 360 500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 058 330 250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glucose monohydraté</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 083 422 500</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 064 980 500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>3908.2</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>hydrogénophosphate disodique</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 065 860 500</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>1 062 640 050</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep</td><td>Kit ZymoResearch, Fribourg, Allemagne</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Allemagne</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H lignée cellulaire</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne</td><td>11631-017&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&aigu ; s Eagle Medium modifié&nbsp ;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin HyClone&nbsp ;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, États-Unis</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture cellulaire standard CELLSTAR, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hanovre, Allemagne</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire (24 puits)</td><td>Sarstedt, N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>831,836</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 96 plaque de puits</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Allemagne</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à réaction SafeSeal, 1,5mL&nbsp ;</td><td>Sarstedt, N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Allemagne</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de 1-désoxygalactonojirimycine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de 1-désoxygalactonojirimycine&nbsp ;</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-désoxynojirimycine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco sans calcium, sans magnésium</td><td>Biochrom, Berlin, Allemagne</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Allemagne</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Allemagne</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-méthylumbellifère</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Méthylumbellifèreryl &alpha ;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Méthylumbellifèreryl &alpha ;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma Aldrich, Munich, Allemagne</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>><Société</td><td>Numéro de catalogue </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubateur type T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany</td><td>n.a.Plaque</td><td></td></tr> <tr><td>lumineuse Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Analyseur génétique&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>agitateur bactérien</td><td>GFL, Burgwedel, Allemagne&nbsp ;</td><td>n.a.Centrifugeuse</td><td></td></tr> <tr><td>Avanti J-25</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Allemagne</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Spectrophotomètre</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Royaume-Uni</td><td>n.a.incubateur</td><td></td></tr> <tr><td>à veste d’eau&nbsp ;</td><td>Binder, Tuttlingen, Allemagne</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 touch</td><td>mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 centrifugeuse réfrigérée à microtubes</td><td>Hermle, Tuttlingen, Allemagne&nbsp ;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>appareil à eau ultrapure</td><td>Siemens, Berlin, Allemagne</td><td>n.a.Thermo</td><td></td></tr> <tr><td>Shaker PST-60HL-4 agitateur orbital</td><td>Biosan, Riga, Lettonie</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml ; nnedorf, Suisse</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 PH-mètre à microprocesseur</td><td>HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><<tr><td>br/> Compteur de cellules + système d’analyse Modèle TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zoug, Suisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan data analysis software v6.6</td><td>Tecan, M&auml ; nnedorf, Suisse</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA ; États-Unis</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-Unis</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abréviations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = avant ; rev = inverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = sans objet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro mesure d’enzyme à test pharmacologique chaperon réactivité fabry et la maladie de pompe

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

L’utilisation de la médecine personnalisée pour traiter les maladies monogéniques rares comme lysosomales (DSL) est contestée par des conceptions du procès cliniques complexes, des coûts élevés et faible nombre de patients. Des centaines d’allèles mutants sont impliqués dans la plupart de la DSL. Les maladies sont généralement classés en 2 ou 3 types cliniques différentes selon la gravité. De plus, la caractérisation moléculaire du génotype peut aider à prédire les résultats cliniques et informer des soins aux patients. Donc, nous avons mis au point un essai de culture de cellule simple basé sur des cellules de HEK293H façon hétérologue surexprimant les mutations identifiées dans la maladie de Fabry et Pompe. Un test semblable a récemment été introduit comme un test préclinique pour identifier les mutations se prête pour la thérapie pharmacologique de chaperon (PCT) la maladie de Fabry. Ce manuscrit décrit un essai de culture de cellule modifiée qui permet une évaluation rapide de phénotypique des variants alléliques dans la maladie de Fabry et Pompe pour identifier les patients éligibles pour le PCT et peut aider au développement de nouveaux pharmacochaperones.

La procédure de mutagenèse Afin d’évaluer l’efficacité de la mutagénèse gène GLA , les mutations ont été classées dans une des catégories suivantes. Cette approche pour générer des mutations a révélé qu’environ 66,5 % des mutations GLA ont été obtenus dans la première tentative. Un autre 25 % pourrait être obtenu après une PCR deuxième légèrement modifiée.
Catégorie 1 : La mutagénèse PCR éta...

Il existe une demande pour faire précliniques Essais pour une nouvelle classe de médicaments « orphelins » appelées chaperons pharmacologiques reproductible, rapide et efficace. Nous avons développé un test culture cellule simple, très standardisé et polyvalent à écran pour patients admissibles ainsi que des médicaments nouveaux chaperons pharmacologiques.

In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

L’objectif global de ce protocole de culture cellulaire modifié est de fournir une évaluation phénotypique rapide de la variance allélique dans les maladies de Fabry et de Pompe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies de surcharge lysosomale, telles que les résultats pronostiques et les décisions thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très reproductible et qu’elle peut aider au développement de nouveaux médicaments, tels que les pharmaco-chaperons.Pour effectuer une mutagénèse dirigée, commencez par utiliser les séquences de référence NM 00169.2 et NM 00152.4 comme modèles pour la mutagenèse des gènes GLA et GAA, respectivement. Utilisez l’outil gratuit Primer Design pour soutenir la conception d’apprêt. Ensuite, faites synthétiser un ensemble d’amorces de haute pureté et sans sel par un fournisseur commercial, avec des amorces sensorielles et antisens portant l’une des modifications de séquence respectives, au cœur de leur longueur, pour introduire individuellement la mutation.Préparez le mélange réactionnel dans un volume de 50 microlitres et exécutez le programme PCR en utilisant les conditions standard fournies par le fabricant et énumérées dans le protocole texte. Après la PCR, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction Dpn1 et continuez à incuber les flacons de réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir transformé l’ADN plasmatique en cellules E. coli compétentes et préparé des plasmides de la transformation souhaitée selon le protocole de texte, utilisez un outil de biologie moléculaire approprié pour analyser la séquence.Lorsque la mutation souhaitée est détectée et qu’aucune autre anomalie de séquence n’est observée par rapport à NM 000169.2 pour l’alpha-galactosidase A ou NM 000152.4 pour l’alpha-galactosidase acide, sélectionnez le clone pour la purification plasmidique de qualité transfection. Déterminez la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance dans un spectrophotomètre. Après la culture de cellules HEK293H dans un ballon de culture T75 selon le protocole texte, 24 heures avant la transfection, utilisez du PBS sans calcium ni magnésium pour laver les cellules une fois.Avec 0,05 % de trypsine-EDTA, récoltez les cellules et, dans les cavités d’une plaque de culture à 24 puits, utilisez 500 microlitres de DMEM complétés par 10 % de FBS pour ensemencer 1,5 fois 10 dans les cinq cellules. Effectuez la transfection des cellules conformément au manuel du fabricant. En utilisant un mélange d’un microgramme d’ADN plasmidique dissous dans 100 microlitres de DMEM sans sérum et 2,5 microlitres de réactif de transfection.Incuber la solution pendant 20 minutes à température ambiante, puis l’ajouter aux cellules au compte-gouttes. Après une période de quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, retirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez 500 microlitres de DMEM frais avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Au cours de cette étape, vous pouvez ajouter DGJ ou DNJ au milieu de culture si vous le souhaitez.Le jour de la récolte, retirez les cellules de l’incubateur. Ensuite, aspirez le milieu et utilisez du PBS avec du calcium et du magnésium pour laver soigneusement les cellules deux fois. Cette étape est essentielle car DGJ et DNJ sont des inhibiteurs des deux enzymes, et donc tout résidu restant invaliderait le test.Après le lavage, ajoutez 200 microlitres d’eau déminéralisée directement sur le dessus des cellules. Rincez ensuite les cellules de la plaque et transférez-les dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Placez les échantillons dans un support à mousse approprié et agitez-les pendant cinq secondes pour rendre la lyse plus efficace.Ensuite, alternez les échantillons entre de l’azote liquide pendant 10 secondes et un bain-marie à température ambiante jusqu’à ce que la décongélation soit complète. Après avoir répété la procédure d’homogénéisation cinq fois, faites tourner les échantillons pendant cinq minutes à 10 000 g. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de réaction.Pour effectuer le dosage de l’ACB, préparez un nouveau tube pour chaque échantillon contenant 40 microlitres de H20 désionisé et ajoutez 10 microlitres d’échantillon. Mélangez chaque solution en vortex brièvement et transférez 10 microlitres de chaque échantillon en trois exemplaires dans les cavités d’une plaque de 96 puits. Pour préparer une courbe standard, diluez une solution mère de BSA de 2 milligrammes par millilitre et du H2O désionisé conformément au protocole de texte.Après avoir combiné le réactif A et le réactif B, démarrez la réaction en ajoutant 200 microlitres de la solution de réactif BCA et incubez les échantillons dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 300 tr/min sur un agitateur orbital pendant une heure. Mesurez ensuite l’absorbance à 560 nanomètres dans un lecteur de plaques. Les échantillons contiennent généralement entre un et 1,5 microgramme de protéines par microlitre.Diluez la quantité calculée de chaque échantillon et pipetez-le dans des tubes de réaction frais de 1,5 millilitre pour obtenir 0,05 microgramme d’alpha-galactosidase A ou 0,5 microgramme d’alpha-glucosidase acide par microlitre de solution. Vortex les échantillons pendant cinq secondes à nouveau et pipetez 10 microlitres de cette dilution en double dans une plaque à 96 puits. Démarrez les réactions en ajoutant 20 microlitres de la solution de substrat respective.Pour l’alpha-galactosidase A, ajouter deux millimolaires de 4-méthylombelliféryl alpha-D galactopyranoside, ou 4-MU-gal, dans un tampon phosphate-citrate de 0,06 molaire, pH 4,7. Pour l’alpha-glucosidase acide, ajoutez 2 millimolaires de 4-méthylumbellifèreryl alpha-D glucopyranoside, ou 4-MU-glu, dans de l’acétate de sodium 0,025 molaire, pH 4,0. Incuber les réactions enzymatiques pendant une heure dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 300 tr/min sur un agitateur orbital.Ensuite, terminez la réaction en ajoutant 200 microlitres de tampon glycine sodium-hydroxyde ajusté à 1,0 pH molaire et 10,5. Préparez une courbe standard de 4-MU à partir d’un stock de 0,01 milligramme par millilitre conformément au protocole de texte et pipetez 10 microlitres des solutions en double dans une plaque de 96 puits. Ajoutez 200 microlitres du tampon 1,0 molaire d’hydroxyde de sodium de glycine dans chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH.Enfin, mesurez l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du jeu de filtres approprié. Et analysez les données à l’aide du logiciel approprié pour le lecteur de fluorescence. Pour évaluer l’efficacité de la mutagenèse du gène GLA, les mutations ont été classées en trois catégories et ont révélé qu’environ 66,5 % avaient été obtenues lors de la première tentative.25 % supplémentaires ont pu être obtenus après une deuxième PCR légèrement modifiée. Dans la troisième catégorie, il a fallu déployer davantage d’efforts, tels que la refonte de l’amorce, pour obtenir le clone souhaité. Ce tableau fait référence aux résultats de mesure de l’activité enzymatique pour trois mutations de l’alpha-galactosidase A et de trois mutations de l’alpha-glucosidase acide, non traitées ou traitées par DGJ et DNJ.Les données sont affichées sous forme de valeurs absolues pour le renouvellement du substrat et ont des valeurs relatives normalisées par rapport à l’enzyme de type sauvage. Les données absolues d’activité enzymatique ont été corrigées pour tenir compte de l’activité enzymatique endogène des cellules HEK293H à l’aide de cellules transfectées avec un vecteur 3.1 d’ADNpc vide. Les valeurs d’activité enzymatique ont été normalisées en enzyme de type sauvage à partir d’expériences correspondantes, ce qui explique l’écart des valeurs relatives entre les différents mutants.Une fois maîtrisée, la fraction post-culture cellulaire de cette expérience, qui représente la majeure partie du temps de manipulation, peut être réalisée en quatre heures. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies de surcharge lysosomale pour explorer les corrélations génotype-phénotype dans les maladies de Fabry et de Pompe. Ce protocole peut aider au développement de nouveaux médicaments dans les maladies de surcharge lysosomale.

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