In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe

Il existe une demande pour faire précliniques Essais pour une nouvelle classe de médicaments « orphelins » appelées chaperons pharmacologiques reproductible, rapide et efficace. Nous avons développé un test culture cellule simple, très standardisé et polyvalent à écran pour patients admissibles ainsi que des médicaments nouveaux chaperons pharmacologiques.

L’objectif global de ce protocole de culture cellulaire modifié est de fournir une évaluation phénotypique rapide de la variance allélique dans les maladies de Fabry et de Pompe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies de surcharge lysosomale, telles que les résultats pronostiques et les décisions thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très reproductible et qu’elle peut aider au développement de nouveaux médicaments, tels que les pharmaco-chaperons.

Pour effectuer une mutagénèse dirigée, commencez par utiliser les séquences de référence NM 00169.2 et NM 00152.4 comme modèles pour la mutagenèse des gènes GLA et GAA, respectivement. Utilisez l’outil gratuit Primer Design pour soutenir la conception d’apprêt. Ensuite, faites synthétiser un ensemble d’amorces de haute pureté et sans sel par un fournisseur commercial, avec des amorces sensorielles et antisens portant l’une des modifications de séquence respectives, au cœur de leur longueur, pour introduire individuellement la mutation.

Préparez le mélange réactionnel dans un volume de 50 microlitres et exécutez le programme PCR en utilisant les conditions standard fournies par le fabricant et énumérées dans le protocole texte. Après la PCR, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction Dpn1 et continuez à incuber les flacons de réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir transformé l’ADN plasmatique en cellules E. coli compétentes et préparé des plasmides de la transformation souhaitée selon le protocole de texte, utilisez un outil de biologie moléculaire approprié pour analyser la séquence.

Lorsque la mutation souhaitée est détectée et qu’aucune autre anomalie de séquence n’est observée par rapport à NM 000169.2 pour l’alpha-galactosidase A ou NM 000152.4 pour l’alpha-galactosidase acide, sélectionnez le clone pour la purification plasmidique de qualité transfection. Déterminez la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance dans un spectrophotomètre. Après la culture de cellules HEK293H dans un ballon de culture T75 selon le protocole texte, 24 heures avant la transfection, utilisez du PBS sans calcium ni magnésium pour laver les cellules une fois.

Avec 0,05 % de trypsine-EDTA, récoltez les cellules et, dans les cavités d’une plaque de culture à 24 puits, utilisez 500 microlitres de DMEM complétés par 10 % de FBS pour ensemencer 1,5 fois 10 dans les cinq cellules. Effectuez la transfection des cellules conformément au manuel du fabricant. En utilisant un mélange d’un microgramme d’ADN plasmidique dissous dans 100 microlitres de DMEM sans sérum et 2,5 microlitres de réactif de transfection.

Incuber la solution pendant 20 minutes à température ambiante, puis l’ajouter aux cellules au compte-gouttes. Après une période de quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, retirez le milieu contenant le réactif de transfection et ajoutez 500 microlitres de DMEM frais avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Au cours de cette étape, vous pouvez ajouter DGJ ou DNJ au milieu de culture si vous le souhaitez.

Le jour de la récolte, retirez les cellules de l’incubateur. Ensuite, aspirez le milieu et utilisez du PBS avec du calcium et du magnésium pour laver soigneusement les cellules deux fois. Cette étape est essentielle car DGJ et DNJ sont des inhibiteurs des deux enzymes, et donc tout résidu restant invaliderait le test.

Après le lavage, ajoutez 200 microlitres d’eau déminéralisée directement sur le dessus des cellules. Rincez ensuite les cellules de la plaque et transférez-les dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Placez les échantillons dans un support à mousse approprié et agitez-les pendant cinq secondes pour rendre la lyse plus efficace.

Ensuite, alternez les échantillons entre de l’azote liquide pendant 10 secondes et un bain-marie à température ambiante jusqu’à ce que la décongélation soit complète. Après avoir répété la procédure d’homogénéisation cinq fois, faites tourner les échantillons pendant cinq minutes à 10 000 g. Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de réaction.

Pour effectuer le dosage de l’ACB, préparez un nouveau tube pour chaque échantillon contenant 40 microlitres de H20 désionisé et ajoutez 10 microlitres d’échantillon. Mélangez chaque solution en vortex brièvement et transférez 10 microlitres de chaque échantillon en trois exemplaires dans les cavités d’une plaque de 96 puits. Pour préparer une courbe standard, diluez une solution mère de BSA de 2 milligrammes par millilitre et du H2O désionisé conformément au protocole de texte.

Après avoir combiné le réactif A et le réactif B, démarrez la réaction en ajoutant 200 microlitres de la solution de réactif BCA et incubez les échantillons dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 300 tr/min sur un agitateur orbital pendant une heure. Mesurez ensuite l’absorbance à 560 nanomètres dans un lecteur de plaques. Les échantillons contiennent généralement entre un et 1,5 microgramme de protéines par microlitre.

Diluez la quantité calculée de chaque échantillon et pipetez-le dans des tubes de réaction frais de 1,5 millilitre pour obtenir 0,05 microgramme d’alpha-galactosidase A ou 0,5 microgramme d’alpha-glucosidase acide par microlitre de solution. Vortex les échantillons pendant cinq secondes à nouveau et pipetez 10 microlitres de cette dilution en double dans une plaque à 96 puits. Démarrez les réactions en ajoutant 20 microlitres de la solution de substrat respective.

Pour l’alpha-galactosidase A, ajouter deux millimolaires de 4-méthylombelliféryl alpha-D galactopyranoside, ou 4-MU-gal, dans un tampon phosphate-citrate de 0,06 molaire, pH 4,7. Pour l’alpha-glucosidase acide, ajoutez 2 millimolaires de 4-méthylumbellifèreryl alpha-D glucopyranoside, ou 4-MU-glu, dans de l’acétate de sodium 0,025 molaire, pH 4,0. Incuber les réactions enzymatiques pendant une heure dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 300 tr/min sur un agitateur orbital.

Ensuite, terminez la réaction en ajoutant 200 microlitres de tampon glycine sodium-hydroxyde ajusté à 1,0 pH molaire et 10,5. Préparez une courbe standard de 4-MU à partir d’un stock de 0,01 milligramme par millilitre conformément au protocole de texte et pipetez 10 microlitres des solutions en double dans une plaque de 96 puits. Ajoutez 200 microlitres du tampon 1,0 molaire d’hydroxyde de sodium de glycine dans chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH.

Enfin, mesurez l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du jeu de filtres approprié. Et analysez les données à l’aide du logiciel approprié pour le lecteur de fluorescence. Pour évaluer l’efficacité de la mutagenèse du gène GLA, les mutations ont été classées en trois catégories et ont révélé qu’environ 66,5 % avaient été obtenues lors de la première tentative.

25 % supplémentaires ont pu être obtenus après une deuxième PCR légèrement modifiée. Dans la troisième catégorie, il a fallu déployer davantage d’efforts, tels que la refonte de l’amorce, pour obtenir le clone souhaité. Ce tableau fait référence aux résultats de mesure de l’activité enzymatique pour trois mutations de l’alpha-galactosidase A et de trois mutations de l’alpha-glucosidase acide, non traitées ou traitées par DGJ et DNJ.

Les données sont affichées sous forme de valeurs absolues pour le renouvellement du substrat et ont des valeurs relatives normalisées par rapport à l’enzyme de type sauvage. Les données absolues d’activité enzymatique ont été corrigées pour tenir compte de l’activité enzymatique endogène des cellules HEK293H à l’aide de cellules transfectées avec un vecteur 3.1 d’ADNpc vide. Les valeurs d’activité enzymatique ont été normalisées en enzyme de type sauvage à partir d’expériences correspondantes, ce qui explique l’écart des valeurs relatives entre les différents mutants.

Une fois maîtrisée, la fraction post-culture cellulaire de cette expérience, qui représente la majeure partie du temps de manipulation, peut être réalisée en quatre heures. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies de surcharge lysosomale pour explorer les corrélations génotype-phénotype dans les maladies de Fabry et de Pompe. Ce protocole peut aider au développement de nouveaux médicaments dans les maladies de surcharge lysosomale.