Name: Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie simultanée du branchement axonal thalamocortical et de la formation synaptique dans des cocultures organotypiques de thalamus et de cortex cérébral chez le rat. Cette technique permet d'observer en temps réel les changements morphologiques dynamiques des cellules vivantes individuelles.

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Nous remercions également Gabriel Hand lecture critique.

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies par les comités de protection animale de l’Université d’Osaka et de la société de Neuroscience du Japon.
1. organotypique cocultures du thalamus et le cortex cérébral
Remarque : La procédure détaillée, consultez l’original publications7,8,13. Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Rats Sprague-Dawley (SD) sont utilisés pour les cultures de neurones.
<ol><li>
Préparation des réactifs Remarque : Les volumes de réactifs suivants sont pour le cerveau d’un rat.<ol>
<li>
Préparer 10 x mis à jour le supplément N2 13: insuline (50 μg/mL), progestérone (200 nM), hydrocortisone (200 nM), sélénite de sodium (300 nM), la transferrine (1 mg/mL), putrescine (1 mM), glucose (60 mg/mL)</li>
		<li>
Milieu de culture contenant du sérum prepare (10 mL) : 85 % DMEM/F12, majoration de 10 % x 10 modifié N2, 5 % sérum fœtal (SVF)</li>
		<li>
Milieu de culture sans sérum prepare (20 mL) : 90 % DMEM/F12, majoration de 10 % x 10 modifié N2</li>
		<li>Préparer la solution de collagène queue rat (0,5 mL). En bref, prendre des fibres tendres d’une queue de rat dans des conditions stériles et incuber pendant la nuit dans une solution d’acide acétique. Après centrifugation, recueillir le surnageant (quelques mg/mL) et les stocker dans un réfrigérateur13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de plats de la culture
	<ol>
<li>Placer un insert membrane dans une boîte de Pétri de 35 mm.</li>
		<li>Ajouter 40-50 μL de solution de collagène queue rat à la membrane et répandre la solution de collagène autour du centre.</li>
		<li>Sécher à l’air la membrane complètement dans un banc propre.</li>
		<li>Mettre 1,5 à 2 mL de milieu de culture contenant du sérum dans le plat, pour que la membrane est trempée avec le milieu.</li>
		<li>Posez le plat de la culture dans un incubateur (37 ° C, l’air humidifié 95 % et 5 % CO2) avant l’ensemencement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de tranches de cortex
	<ol>
<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec l’éthanol à 70 % pendant 10 min ou plus.</li>
		<li>Disséquer le cerveau entier rapidement d’un jour après la naissance (P) 2 rat sous anesthésie glacee (plongé dans la glace-chips pendant quelques minutes).</li>
		<li>Place le cerveau dans une boîte de Pétri contenant 100 mL de Hanks froide de 100 mm équilibré de solution saline.</li>
		<li>Retirer le corps de pia du cerveau avec une pince fine et couper des tranches de cortex (300-400 μm d’épaisseur) du cortex visuel et somatosensoriel avec des ciseaux microchirurgicales (pour détails, voir Figure 1). Remarque : L’épaisseur des tranches de cortex est grossièrement estimée par l’ampleur des grilles sous un microscope binoculaire. Remarque : Par ailleurs, des tranches de cortex peuvent être faites avec un vibratome dans des conditions stériles.</li>
		<li>Le transfert de quelques tranches de cortex sur l’insertion de la membrane avec une pipette en plastique jetable.</li>
		<li>Ajustez les positions des tranches près du centre de l’insert de culture avec une pipette Pasteur feu poli (pour plus de détails, voir8,13) et retirer les excès du milieu de l’insert. Remarque : Ajuster le niveau du médium légèrement au-dessous de la surface des tranches afin que les tranches peuvent recevoir un nombre suffisant de fois le gaz et le milieu. Cela est essentiel pour la viabilité des cellules.</li>
		<li>Maintenir les tranches dans le milieu de culture à 37 ° C dans un milieu contenant du sérum de humidifié 95 % air et 5 % de CO2et de la culture seul pendant une journée avant un bloc thalamique est pris et placé à côté de lui.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des blocs thalamiques
	<ol>
<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec l’éthanol à 70 % pendant 10 min ou plus.</li>
		<li>Anesthésier une enceinte rat (embryonnaire jour 15) par injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 mg/kg) contenant des anesthésiques.</li>
		<li>Disséquer chaque embryon à partir des cornes utérines et placez les embryons dans une boîte de Pétri contenant 100 mL de solution saline équilibrée de Hanks froide de 100 mm.</li>
		<li>Sous un microscope binoculaire, retirer le cerveau de chaque embryon et couper des blocs thalamiques qui contiennent principalement du noyau géniculé complexe et latérales (environ 0,5 mm x 3) de ventrobasal7 à l’aide de ciseaux microchirurgicales (voir Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Culture et maintenir organotypique cocultures
	<ol>
<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer le bloc thalamique à côté de la surface ventriculaire de la corticale tranche qui a été placé sur le filtre à membrane.</li>
		<li>Maintenir les cocultures dans le milieu de culture contenant du sérum à 37 ° C dans un environnement d’air humidifié de 95 % et 5 % de CO2.</li>
		<li>La moitié du milieu avec le milieu de culture sans sérum échanger après deux jours de culture. Par la suite, échanger le milieu tous les 2-3 jours. Remarque : Le niveau du support doit être vérifié après l’échange moyen, tel qu’il est important pour la survie des cellules.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. électroporation
Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles.
Remarque : Effectuer électroporation un jour après la préparation des blocs thalamiques pour éviter le détachement des blocs.
<ol><li>
Plasmides
	<ol>
<li>Faire un mélange des plasmides comme suit : pCAGGS-DsRed 2 μg/μL ; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL. Remarque : Purifier les deux plasmides utilisant un kit de Maxiprep exempte d’endotoxine et se dissolvent dans la solution saline équilibrée de Hanks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Installation de matériel d’électroporation Les instruments électriques comme un stimulateur et un isolateur doivent être connectés, comme illustré à la Figure 2.<ol>
<li>Connectez le stimulateur à l’isolateur biphasique.</li>
		<li>Connecter l’électrode (un fil d’argent 0,2 mm de diamètre) à la borne négative de l’isolateur.</li>
		<li>Connecter l’électrode (un diamètre de 1 mm de fil d’argent) en série avec une résistance de 100 Ω et la borne positive de l’isolateur.</li>
		<li>Connectez l’amplificateur à l’oscilloscope afin de vérifier que les courants électriques sont transmis à travers la résistance en mesurant la tension avec l’amplificateur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des pipettes en verre Remarque : Deux types de pipettes en verre sont utilisés pour l’application d’impulsions électriques et éjection de la solution de plasmide.<ol>
<li>Faire les pipettes de capillaires en verre avec un extracteur de l’électrode.</li>
		<li>Casser l’embout de la pipette d’éjection (le diamètre de pointe devrait être 20-50 μm).</li>
		<li>Meuler et polir l’embout de la pipette d’électrode avec papier de verre suivie d’incendie-polissage (le diamètre intérieur doit être de 50-200 μm). Remarque : La pointe de l’électrode doit être plane et lisse, car elle touche directement le tissu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procédure d’électroporation
	<ol>
<li>Connecter les pipettes d’éjection et électrode pour les manipulateurs.</li>
		<li>Insérez un fil d’argent (0,2 mm de diamètre) dans la pipette de l’électrode.</li>
		<li>Fixez la pipette de l’éjection d’une seringue de 1 mL avec un tube en plastique.</li>
		<li>Prendre > 5 μL de solution de plasmide dans la pipette d’éjection par succion de la seringue.</li>
		<li>Mettre la co-culture sur la scène de l’électroporation et introduire l’électrode de diamètre 1 mm dans le milieu de culture.</li>
		<li>Placez la pipette d’éjection sur l’explant thalamique.</li>
		<li>Pousser la seringue manuellement après que la pointe touche la surface du bloc thalamique. Remarque : Sur 0,5 μL du plasmide solution est habituellement utilisée par un seul bloc thalamique.</li>
		<li>Placez la pipette de l’électrode sur le bloc thalamique immédiatement après le retrait de la pipette d’éjection.</li>
		<li>Délivrer des impulsions électriques (50-400 μA, 3 à 5 trains de 200 pulsations carrées de 1 ms durée à 200 Hz). Contrôler l’amplitude et le nombre de trains sur l’oscilloscope. Remarque : L’amplitude des courants électriques dépend du diamètre intérieur de l’électrode de pipette13.</li>
		<li>Escamoter la pipette de l’électrode et remettez le plat dans l’incubateur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observation microscopique
	<ol>
<li>Mettre la boîte de Petri sur un stade microscopique d’un microscope confocal vertical équipé de deux jeux de filtres pour EGFP (excitation, 488 nm ; émission, 515 nm) et DsRed (excitation, 514 nm ; émission, 565 nm).</li>
		<li>Prendre des photos des sections optiques 10-25 à tailles µm-étape 1-7 avec un 20 X long-travail distance objectif. Sélectionnez des axones étiquetées individuellement distingués qui expriment la DsRed tant SYP-EGFP. Remarque : La zone observée est d’environ 0,7 x 0,7 mm (correspondant à 1024 x 1024 pixels, c'est-à-dire, 0,68 μm/pixel).</li>
		<li>Capturer des images toutes les 24 h pour l’imagerie quotidienne. Remplissez moins de 10 min à température ambiante et les cultures dans l’incubateur. Pour l’imagerie de péremption court-intervalle de temps, conserver la culture dans une chambre de culture, qui maintient que l’environnement d’humidifie 95 % air et 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole actuel est également un outil puissant pour étudier les aspects liés au développement de la croissance des axones autrement que de la projection de TC11. Par exemple, une combinaison de la culture de la tranche corticale et la technique d’électroporation permet de visualiser chaque morphologie axonale des neurones corticaux et à long terme d’observation9,18.
En utilisant le protocole actuel, les rôl...

La projection de thalamocortical (TC) dans le cerveau des mammifères est un système adéquat d’enquêter sur le guidage axonal et ciblage des mécanismes. Au cours du développement, les axones sensoriels de TC poussent dans la plaque corticale et les branches de la forme et les synapses préférentiellement en couche IV des aires sensorielles primaires dans le cortex cérébral1,2. Même après la mise en place de connexions fondamentales, tonnelles axonales et terminaux synaptiques est remodelés selon les changements environnementaux3,4. Cependant, comment la morphologie axon TC est dynamiquement modifiée est mal comprise. Une des principales raisons est le manque d’une technique adéquate pour observer les changements structurels au niveau unicellulaire. Bien que les développements récents en microscopie, telles que la microscopie biphotonique, ont permis l’observation directe de la vie les neurones corticaux en vivo, il y a des limites encore techniques pour capturer le général TC trajectoires5, 6. par conséquent, méthodes in vitro pour l’imagerie direct des axones TC fournirait des outils puissants pour les analyses structurelles d’axon branching et synapse formation.
Notre groupe pour la première fois mis en place une méthode de culture statique tranche avec membrane perméable7. En utilisant cette méthode, une tranche de cortex de rat a été co-cultivées avec un bloc thalamique sensoriel et connexions TC lamina spécifiques ont été récapitulées dans ce organotypique cocultures7,8. Étiquetage clairsemée avec une protéine fluorescente plus loin nous a permis d’observer la croissance axonale TC et la direction générale de la formation9,10,11. Récemment, nous avons développé une méthode originale pour l’imagerie simultanée de la ramification et la formation des synapses des axones de TC individuels dans l’organotypique cocultures12. Afin de visualiser simultanément les axones de TC et sites présynaptiques, DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par électroporation de la co-culture organotypique. La méthode actuelle facilite l’analyse morphologique des axones de TC et permet l’observation à long terme, qui peut être utilisée pour montrer la relation de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma& nbsp ;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Insert Millicell-CM Boîte de</td> Pétri <td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>Boîte de Pétri Sterrile</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>Pipettes jetables stériles en plastique</td><td>202-IS</td><td>pipettes</td><td></td> de transfert stériles</tr><tr><td>Capillaire en verre : OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp ; G-1.2</td><td>diamètre intérieur, 1.2 mm</td></tr><tr><td>Fil d’argent : 0.2 et 1 mm&nbsp ;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (diamètre, 0,2 mm), AG-401485 (diamètre, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp ;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Isolateur biphasique&nbsp ;</td><td>BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur&nbsp ;</td><td>A-M Systems</td><td>Modèle 1800</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Support universel&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>Système d’éclairage lumineux&nbsp ;</td><td>Extracteur</td><td>d’électrodes Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>Éclipse numérique C1 laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 objectif</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de culture</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rat</td><td>Japon SLC et Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microchirurgie</td><td>Natsume&nbsp ;</td><td>Référence MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de thalamocortical axon branching et synapse formation chez organotypique cocultures

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching et synapse formation sont des processus cruciales pour l’établissement des circuits neuronaux précises. Au cours du développement, axones sensoriels thalamocortical (TC) forment des branches et des synapses dans des calques spécifiques du cortex cérébral. Malgré l’évidente corrélation spatiale entre la formation d’axon branching et synapse, le lien de causalité entre eux est mal compris. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis au point une méthode d’imagerie simultanée de ramification et synapse formation des axones TC individuels organotypique cocultures.
Ce protocole décrit une méthode qui consiste en une combinaison d’une co-culture organotypique et électroporation. Cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral facilitent la manipulation génétique et l’observation des processus axonales, préservant les structures caractéristiques telles que la configuration laminaire. Deux plasmides distincts codant DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par une technique d’électroporation. Cette méthode nous a permis de visualiser individuels morphologies axones des neurones de TC et leurs sites présynaptiques simultanément. La méthode a également permis d’observation à long terme, qui a révélé le lien de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.

L’expérience décrite ici a pour but de révéler la relation entre TC axon branching et synapse formation. Afin de visualiser simultanément les trajectoires axonales et emplacements des sites présynaptiques, unique ou quelques cellules thalamiques organotypique cocultures ont été transfectées avec deux plasmides codant SYP-EGFP et DsRed utilisant l’électroporation. Au cours de la deuxième semaine de la culture, les axones TC distinguables individuellement étaient clairement étiquetés par Ds...

Ce protocole décrit une méthode pour l’imagerie simultanée de thalamocortical axon branching et synapse formation dans cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Les axones thalamocortical individuels et leurs terminaisons présynaptiques sont visualisés par une technique d’électroporation monocellulaires avec DsRed et synaptophysine GFP-étiquetée.

Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

L’objectif général de cette méthode est d’étudier les changements morphologiques dynamiques de la ramification axonale et de la formation des synapses dans la projection thalamocorticale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la formation de nouveaux circuits neuronaux. Le principal avantage de cette technique est l’observation simultanée de la croissance axonale et de la formation des synapses dans les cellules vivantes individuelles.Cette méthode peut donner un aperçu de la relation entre la ramification des axones et la formation des synapses dans les projections thalamocorticales. Il peut également être appliqué à d’autres circuits neuronaux, tels que la connexion intrinsèque dans le cortex cérébral. Pour commencer cette procédure, stérilisez tous les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes ou plus.Ensuite, disséquez rapidement tout le cerveau d’un rat postnatal du deuxième jour sous anesthésie glacée. Ensuite, placez le cerveau dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 40 millilitres de solution saline équilibrée froide de Hank. À l’aide d’un microscope binoculaire, retir

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Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l'embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d'autres neurones ventraux.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique d’imagerie en direct utilisant la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer en temps réel la ramification axonale dans les neurones corticaux. Des vidéos en accéléré capturent les effets du traitement par la...

Imagerie in vitro en temps réel de la ramification axonale dans les neurones corticaux de souris

La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d'invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.

Système de co-culture avec un cerveau organotypique et 3D sphéroïde de cellules de carcinome

L'utilisation de plusieurs angles à couper le cerveau des petits de la souris, nous améliorons sur une tranche de cerveau aiguë décrite précédemment qui capture les liens entre la plupart des grands du mésencéphale et du cerveau antérieur structures auditives.

Modification d&#39;un Colliculo-thalamocortical cerveau de souris Slice, Intégrer l&#39;impression 3-D de la Chambre des composants et multi-échelle imagerie optique

Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Les techniques de microscopie optique couplées à des dosages biochimiques élucident l’implication de l’exocytose médiée par SNARE dans la ramification axonale dépendante de la nétrine. Cette combinaison de techniques permet d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant la ramification des axones et le changement de forme des cellules.

Utilisant Méthodologies combinés pour définir le rôle du Plasma Membrane Livraison Pendant Axon Branching et Neuronal morphogénèse

Cet article décrit une méthodologie détaillée pour obtenir aplaties sections tangentielles des cortex mammifère et visualiser les modules corticales en utilisant histochimiques et méthodes immunohistochimiques.

Visualisation des Modules corticales dans cortex mammifère aplatie

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Les zones sensorielles primaires du néocortex présentent des activités spontanées uniques au cours du développement. Cet article décrit comment visualiser les activités neuronales individuelles et les zones sensorielles primaires pour analyser les activités synchrones spécifiques à une zone chez des souris néonatales in vivo.

Visualisation in vivo de l’activité spontanée dans le cortex sensoriel d’une souris néonatale à une résolution d’un seul neurone

Découvrez une méthode d'imagerie simultanée du branchement axonal thalamocortical et de la formation synaptique dans des cocultures organotypiques de thalamus et de cortex cérébral chez le rat. Cette technique permet d'observer en temps réel les changements morphologiques dynamiques des cellules vivantes individuelles.

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