Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

L’objectif général de cette méthode est d’étudier les changements morphologiques dynamiques de la ramification axonale et de la formation des synapses dans la projection thalamocorticale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la formation de nouveaux circuits neuronaux. Le principal avantage de cette technique est l’observation simultanée de la croissance axonale et de la formation des synapses dans les cellules vivantes individuelles.

Cette méthode peut donner un aperçu de la relation entre la ramification des axones et la formation des synapses dans les projections thalamocorticales. Il peut également être appliqué à d’autres circuits neuronaux, tels que la connexion intrinsèque dans le cortex cérébral. Pour commencer cette procédure, stérilisez tous les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes ou plus.

Ensuite, disséquez rapidement tout le cerveau d’un rat postnatal du deuxième jour sous anesthésie glacée. Ensuite, placez le cerveau dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 40 millilitres de solution saline équilibrée froide de Hank. À l’aide d’un microscope binoculaire, retirez soigneusement la matière de la douleur à l’aide d’une pince fine et coupez le cortex visuel et somatosensoriel primaire en tranches de 300 à 400 microns d’épaisseur à l’aide de ciseaux microchirurgicaux.

Ensuite, transférez les tranches corticales sur le filtre à membrane de l’insert de culture à l’aide d’une pipette en plastique jetable. Ajustez la position des tranches près du centre de l’insert de culture à l’aide de la pipette en plastique jetable et retirez l’excédent de milieu de l’insert. Maintenez les tranches dans le milieu de culture contenant du sérum à 37 degrés Celsius et cultivez-les seules pendant une journée avant de placer un bloc thalamique d’un embryon E15 à côté.

Ajustez le niveau du fluide légèrement en dessous de la surface de la tranche, afin que les tranches puissent recevoir un apport suffisant de gaz et de fluide. Ceci est crucial pour la viabilité des tranches. Dans cette étape, réalisez les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur d’électrodes.

Cassez ensuite les extrémités des capillaires en verre pour l’injection de plasmide. Pour les pipettes d’électrodes, meulez et polissez les pointes des capillaires en verre avec du papier de verre. Ensuite, polissez-les au feu pour obtenir un diamètre intérieur de 50 à 200 microns.

Ensuite, fixez la pipette à électrode et la pipette d’éjection aux manipulateurs. Transférez cinq microlitres de solution plasmidique dans une boîte de Pétri. Ensuite, aspirez la solution dans la pipette à électrode par capillarité.

Insérez l’électrode de 0,2 millimètre de diamètre dans la pipette à électrodes. Après avoir connecté la pipette d’éjection à une seringue d’un millilitre avec un tube en plastique, transférez à nouveau cinq microlitres de solution plasmidique dans une boîte de Pétri. Ensuite, aspirez lentement la solution dans la pipette d’éjection à l’aide de la seringue.

Ensuite, transférez la coculture sur la platine d’électroporation et insérez l’électrode d’un millimètre de diamètre dans le milieu de culture. Par la suite, placez la pipette d’éjection sur le bloc thalamique de culture. Poussez la seringue manuellement une fois que l’embout a touché la surface du bloc thalamique.

Placez la pipette à électrode sur le bloc thalamique immédiatement après la rétraction de la pipette d’éjection. Maintenant, délivrez les impulsions électriques. Surveillez l’amplitude et le nombre de trains sur l’oscilloscope.

Ensuite, rétractez la pipette à électrodes et remettez le plat dans l’incubateur. Pour observer l’échantillon, placez la boîte de culture sur la platine d’un microscope confocal droit équipé de deux jeux de filtres pour EGFP et DsRed. Prenez ensuite des images de 10 à 25 sections optiques, à des pas de un à sept microns, avec un objectif à longue distance de travail de 20x.

Sélectionnez des axones marqués distincts individuellement, qui expriment à la fois DsRed et Syp-EGFP. On voit ici une coculture organotypique de tranches thalamiques et corticales après 12 DIV. Voici une image agrandie de la région encadrée.

Et voici une cellule thalamique marquée DsRed prolongeant un axone dans la tranche corticale et formant des branches dans les couches supérieures. Ces images montrent l’axone thalamocortical marqué DsRed et Syp-EGFP puncta. Une accumulation discrète de Syp-EGFP a été observée le long d’un seul axone thalamocortical.

Les plasmides DsRed et Syp-EGFP ont été introduits dans des cellules thalamiques cultivées à un DIV par électroporation. Cet axone a été imagé quotidiennement pendant quatre jours. La ramification axonale et la formation des synapses étaient dynamiques, avec addition et élimination.

Suite à ces procédures, une électroporation avec des gènes intéressants avec Syp-EGFP et DsRed peut être effectuée afin d’étudier le rôle du gène dans la ramification des axones et la formation des synapses. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer les mécanismes des changements dynamiques des circuits neuronaux.