Name: Application du système de Culture aorte-gonades-mésonéphros Explant dans l’hématopoïèse perfectionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Découvrez la culture d'explants AGM pour étudier le développement des cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et la formation de colonies in vitro.

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Nous remercions Suwei Gao d’aide dans la préparation de la figure. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81530004, 31425016) et le ministère des sciences et technologie de la Chine (2016YFA0100500). J.L. effectué les expériences et rédigé le manuscrit ; F.L. édition le manuscrit. Les deux auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie, Chinese Academy of Sciences, Beijing, Chine.
 1. préparation de matériel <ol><li>stériliser le 0,65 µm filtres avec ultraviolet rayons produits sous l’ultraviolet ray lampe sur le banc propre pendant 4 h et retourner les filtres après la marque de 2 h. 
	Remarque : Lorsque vous travaillez avec la lumière UV, porter une protection appropriée.</li>
	<li>Stériliser les mailles en acier inoxydable avec le stérilisateur autoclave à 121 ° C pendant 30 min. 
	Remarque : Une certaine hauteur de maille d’acier inoxydable est nécessaire pour supporter les filtres à l’interface air-liquide et ceci peut être réalisé avec le fil de la maille d’acier ( Figure 1 A).</li>
	<li>Fluoxetine dilué à une concentration finale de 10 µM dans le 5300 à long terme de la culture moyenne et mélange uniformément. 
	NOTE : Pour une plaque de six puits, milieu de culture à long terme 2 mL Max 5300 est approprié pour chaque puits. Hydrocortisone à 10 -6 M peut être dilué de façon sélective dans le milieu.</li>
	<li>Le milieu enrichi par la fluoxétine à 10 µM dans six puits assiettes ou plats de transfert et de mettre les mailles inox stérilisé dans le milieu.</li>
	<li>Laver les filtres à 0,65 µm avec de l’eau bouillante deux fois pendant 3 minutes chaque fois dans la boîte de Petri de cellule de verre pour la stérilisation. Après que chaque lavage, placez les filtres dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant 2 minutes et place le mouillé des filtres sur l’acier inoxydable maillages se tenant à l’interface air-liquide, comme le montre la Figure 1 A [schématique dans le Centre]. 
	Remarque : L’eau bouillante peut être généré avec le stérilisateur autoclave pour atteindre l’asepsie et l’équipement doit être retiré de stérilisateur autoclave en temps opportun pour éviter une baisse de température.</li>
</ol> 2. Culture d’explants AGA <ol><li>séparer soigneusement les régions AGA des embryons au E10.5 ou E11 avec une pince.
	<ol><li>Bande de l’utérus de souris enceintes avec des ciseaux de dissection et de séparer les embryons de l’utérus.</li>
		<li>Essuyer le sac vitellin, le cordon ombilical et viscères du corps de l’embryon.</li>
		<li>Retirer délicatement les tissus nerf dorsal et les tissus musculaires environnantes.</li>
		<li>Cut off les tissus avec la pince sur le site des membres antérieurs et postérieurs et séparer la région AGM du corps de l’embryon. les figures 1 B-C montrent la représentation schématique et la morphologie des AGM disséqué.</li>
	</ol></li> <li>Explantation l’AGM disséqués séparément sur les filtres à l’interface air-liquide ( Figure 1 A) et de la culture à 5 % de CO 2 à 37 ° C pendant 2-3 jours. 
	Remarque : Ne pas placer l’AGA disséqué sur le fil de la maille en acier et s’assurer que les filtres sont à l’interface air-liquide durant la culture. En plus de l’AGA, sac vitellin et le foie fœtal peuvent également être cultivées avec ce système 7.</li>
</ol> 3. Analyse de l’expression <ol><li>d’ARNm <ol><li>recueillir les assemblées générales annuelles cultivées dans 1 mL de PBS et centrifuger à 4 ° C, 310 x g pendant 6 min.</li>
		<li>Après avoir enlevé le surnageant, l’ARN total est extraite de l’AGM recueillies avec une solution de monophasique de phénol, selon le fabricant &#39; instructions de s.</li>
		<li>ARN total (2 µg) est alors inverse transcrit utilisant transcriptase inverse M-MLV afin d’obtenir des ADNc comme modèle. Les dosages quantitatifs de la PCR en temps réel sont effectuées avec SYBR Green et Gapdh est utilisée comme contrôle interne.</li>
	</ol></li> <li>Niveau de protéine <ol><li>recueillir l’AGA cultivé comme indiqué ci-dessus au point 3.1.1.</li>
		<li>Préparer la protéine de l’AGA cultivée avec le tampon de lyse cellulaire (10 mM Tris-HCl 10 mM NaCl et 0,5 % NP-40) contenant l’inhibiteur de la protéase et l’utilisation de western blot pour détecter le niveau de protéine comme précédemment décrit 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Les unités formant des colonies dans l’épreuve de Culture (CFU-C) <ol><li>après la mise en culture pendant 2-3 jours, recueillir les régions AGA dans une solution saline tamponnée au phosphate de 1 mL (PBS) et centrifuger à 4 ° C, 310 x g pendant 6 minutes et se dissocient avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) à 37 ° C. 
	NOTE : Le temps nécessaire à la collagénase à générer des suspensions de cellules unique est environ 20 minutes. Agitation du tube contenant AGM toutes les 5 min peuvent accélérer le processus de digestion. Collagénase de 0,1 % 200 µL est utilisé pour chaque Assemblée générale annuelle et 200 µL de sérum de 10 % est utilisé pour arrêter la réaction.</li>
	<li>Culture des suspensions de cellules unique dans le milieu de la M3434 en plaques 24 puits ultra faible attachement. 
	Remarque : Pour éviter toute contamination, solution de pénicilline-streptomycine peut être ajoutée sélectivement dans le milieu. Parce que le milieu M3434 est visqueux, une seringue cc 1,0 sans aiguille sert à mélanger les cellules et le milieu.</li>
	<li>Après 7 - 10 jours de culture à 37 ° C à 5 % de CO 2, le nombre pour chaque type de colonies dont l’éclatement formant unité--érythroïdes BFU-E, CFU-granulo-monocyte (CFU-GM) et UFC-granulocyte, érythrocyte, macrophage, mégacaryocyte (CFU-GEMM) sont distingués basés sur la morphologie et a marqué avec un microscope inversé ( Figure 2 C).</li>
</ol> 5. In Vivo Dosage de transplantation <ol><li>formatrices unités-rate (CFU-S) dosage <ol><li>après 2 - 3 jours de culture d’explants, recueillir les assemblées générales annuelles et préparer des suspensions de cellules simples en incubant avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) pour 20 min.</li>
		<li>Exécuter l’irradiation mortelle (9 Gy de rayons x) de 8 à 10 semaine souris C57BL/6 mâles 4-5 h avant l’injection de cellules.</li>
		<li>Mettre la souris irradiée dans une drisse de restreindre son activité.</li>
		<li>Essuyer la queue à l’aide d’un tampon de coton imprégné d’alcool à 75 % pour favoriser la vasodilatation de la veine.</li>
		<li>Injecter 0,5 embryon équivalent (ee) ou 1 ee seule cellule-suspensions AGA par voie intraveineuse dans la veine caudale des souris irradiée avec une seringue cc 1,0. 
		Remarque : Les cellules sont suspendues avec du PBS et 0,5 mL de PBS par bénéficiaire est un volume convenable. Une aiguille de calibre 25 ou 26 calibre est utilisée pour l’injection avec une seringue cc 1,0. Aucun flux d’air ne peut être introduit dans la seringue. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’antiseptique pour arrêter le saignement.</li>
		<li>Onze jours après la transplantation, recueillir et fixer la rate des souris bénéficiaires à Bouin &#39; solution s (solution aqueuse de l’acide picrique 1,22 % saturés 15 mL, 2 mL de méthanol 40 % et 1 mL d’acide acétique) pour 1 à 2 jours et laver avec de l’alcool à 80 % pour un autre 1-2 jours. Compter les colonies visibles dans la rate macroscopiquement et déterminer le nombre de colonies par ee. 
		&#8203; Remarque : Bouin &#39; fixateur s, portez des protections appropriées.</li>
	</ol></li> <li>Essai à long terme de la transplantation <ol><li>après 2-3 jours explantation cultivant, recueillir les assemblées générales annuelles et préparer des suspensions de cellules simples en incubant avec 200 collagénase µL (0,1 % dans du PBS) pendant 20 min.</li>
		<li>Exécuter l’irradiation mortelle (9 Gy de rayons x) de 8 à 10 semaine souris C57BL/6 mâles 4-5 heures avant l’injection de cellules.</li>
		<li>Mettre la souris irradiée dans une drisse de restreindre son activité.</li>
		<li>Essuyer la queue à l’aide d’un tampon de coton imprégné d’alcool à 75 % pour favoriser la vasodilatation de la veine.</li>
		< lJ’ai > injecter 0,5 embryon équivalent (ee) ou 1 ee simples des suspensions cellulaires de l’Assemblée générale annuelle par voie intraveineuse dans la veine de la queue d’une souris irradiée avec une seringue cc 1,0. AGM sont injectés à une dose de 1 ee par destinataire avec 2 × 10 5 cellules de moelle osseuse (fond CD45.1). 
		Remarque : Aucun flux d’air ne peut être introduit dans la seringue. Appuyez sur le site d’injection avec un tampon imbibé d’antiseptique pour arrêter le saignement.</li>
		<li>Quatre mois après transplantation, recueillir la moelle osseuse du receveur et l’utiliser pour l’essai de reconstitution de FACS. Uniquement les destinataires avec &#8805; 10 % dérivé donneur chimérisme sont considérés comme pièce reconstitution réussie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier contradictoires.

Il est bien connu que CSH matures dans la moelle osseuse peut repeupler l’approvisionnement en sang des receveurs irradiés. Contrairement à ces autorenouveler fonctionnelle, le CSH émergentes dans l’Assemblée générale annuelle des embryons de souris est immatures. Transplantation directe est ressorti ce type j’ai (VE-cad+ CD45– CD41+) et type II (VE-cad+ CD45+) pre-CSH posséder aucune reconstitution capacité20. Profitant du système de culture ...

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont spécifiques des tissus de cellules souches adultes qui possèdent des cellules lymphoïdes et multilignée potentiel y compris érythroïdes, myéloïde, ainsi que la capacité à se renouveler. Des études récentes ont montré que les premiers autorenouveler provient d’une population endothéliale spécialisée, appelée endothélium hemogenic (HE), à travers l’endothélium de transition hématopoïétique (ISE) à la paroi ventrale de l’aorte dorsale1,2 ,3,4. Une fois formé dans la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA) d’embryonnaire (E) 10,5 à E12.5 dans l’embryon de souris, GPX va migrer dans le foie fœtal pour l’expansion et finalement coloniser la moelle osseuse afin de maintenir l’hématopoïèse adulte tout au long de la vie d’un individu 5 , 6. bien que cela ait été étudiée pendant de nombreuses années, les mécanismes sous-jacents des HSC émergence et le développement restent incomplètement compris.
Contrairement à la fécondation in vitro et le développement de l’embryon de poisson zèbre, développement intra-utérin d’embryons de souris rend l’étude de l’hématopoïèse définitive au cours de l’embryogenèse beaucoup plus gênant. Bien que des expériences génétiques à l’aide de la souris knockout (KO) sont couramment utilisés, l’absence de certaines souris KO limite aussi leur utilisation dans le domaine de la recherche hématopoïétique. En outre, des expériences in vivo sauvetage ne sont pas facilement effectuées chez la souris KO. Depuis 1996, la culture d’explants d’AGA a été développée pour études hématopoïétiques par les pionniers dans la zone7. Avec l’aide de ce système de culture, tissus ventrales de la région d’AGA ont été identifiés pour promouvoir l’activité de l’HSC, tandis que les tissus dorsales exercent un autre effet8,9. Le système de culture des explants AGM a également été appliqué pour déterminer le rôle de la sérotonine, Mpl, SCF, BMP et HSC développement10,11,12,13, de signalisation Hedgehog 14. ce qui est important, c’est aussi une méthode populaire utilisée pour sauver des défauts hématopoïétiques en embryons mutants13,15.

<table><tbody><tr><td>Durapore 0,65 et micro ; m filters</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM culture d’explants</td></tr><tr><td>M5300 milieu de culture à long terme</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM culture d’explants</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp ;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>M-MLV transcriptase inverse</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>transcription inverse</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>quantitative PCR en temps réel</td></tr><tr><td>inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Extraction de protéines</td></tr><tr><td>collagénase</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>digestion des tissus AGM</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>Essai CFU-C</td></tr><tr><td>Fixation ultra-faible Plaques à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>Essai CFU-C</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 souris</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Essai CFU-S</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 souris</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Transplantation à long terme</td></tr><tr><td>phosphate saline tamponnée</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM Collection</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM culture d’explants</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Transplantation à long terme</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Transplantation à long terme</td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>puissance : 30W</td></tr><tr><td>maille en acier inoxydable</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp ;</td><td>Diamètre de l’ouverture : 2,5 mm</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>diluée sélectivement dans le milieu M5300</td></tr></tbody></table>

application du système de culture aorte-gonades-mésonéphros explant dans l’hématopoïèse perfectionnement

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

La limitation de l’utilisation des embryons de souris pour les études de l’hématopoïèse est l’inconvénient supplémentaire dans les opérations, qui est en grande partie due au développement intra-utérin de l’embryon. Bien que les données génétiques de souris knockout (KO) sont convaincants, il n’est pas réaliste pour produire des souris KO pour tous les gènes selon les besoins. En outre, effectuer en vivo sauvetage expériences afin de consolider les données obtenues des souris KO n’est pas commode. Pour surmonter ces limites, la culture d’explants d’aorte-gonades-mésonéphros (AGM) a été développée comme un système approprié d’étudier le développement de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Surtout pour des expériences de sauvetage, il peut être utilisé pour récupérer l’hématopoïèse altérée chez les souris KO. En ajoutant les produits chimiques appropriés dans le milieu, la signalisation ayant une déficience peut être réactivée ou voies de régulation peuvent être inhibées. Avec l’utilisation de cette méthode, beaucoup d’expériences peuvent être effectuées pour identifier les régulateurs critiques du développement HSC, y compris de HSC liées à l’expression des gènes à des niveaux d’ARNm et de protéines, la capacité de formation de colonie et capacité de reconstitution. Cette série d’expériences serait utile pour définir les mécanismes sous-jacents essentiels pour le développement de l’HSC chez les mammifères.

Une publication récente a rapporté sérotonine de culture cellulaire endothéliale favorise la survie des CSH en inhibant la voie de pro-apoptotic dans l' Assemblée générale annuelle13. Pour confirmer l’effet promoteur de la sérotonine sur le développement de l’HSC, fluoxétine a été inclus. Comme un inhibiteur de recapture de la sérotonine (ISRS), la fluoxétine a été démontrée inhibe la réabsorption de la sérotonine dans les tissus périphériques16</...

Ce protocole décrit l’utilisation d’aorte-gonades-celles cultivées pour les analyses d’expression, unités formant des colonies dans la culture et de la rate et la reconstitution à long terme pour déterminer l’effet des facteurs de régulation et les voies de signalisation sur souches hématopoïétiques développement des cellules. Cela a été démontré comme un système efficace pour l’étude de fonction et la biologie de cellules souches hématopoïétiques.

Application du système de Culture aorte-gonades-mésonéphros Explant dans l’hématopoïèse perfectionnement

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

L’objectif global de cette expérience est d’utiliser une culture d’explants d’aorte-gonade-mésonéphros pour étudier les régulateurs critiques du développement des cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie et dans les domaines fonctionnels des CSH sur la façon d’identifier les facteurs impliqués dans la régulation du développement des CSH chez les mammifères. Le principal avantage de cette technique est que ces régulateurs peuvent être vérifiés par l’analyse de l’expression de l’ADN et la capacité de formation des colonies et la capacité de reconstitution des CSH.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à s’assurer que la séparation précise de l’AGM des tissus environnants dans la région du tronc nécessite de la pratique. Avant de commencer la procédure, placez des mailles en acier inoxydable dans des puits individuels d’une plaque à six puits contenant deux millilitres de milieu fraîchement préparé supplémenté en fluoxétine par puits. Placez un filtre de 0,65 microlitre stérilisé aux UV par puits expérimental dans une boîte de culture cellulaire en verre contenant de l’eau bouillante fraîche pour deux lavages de trois minutes, en immergeant les filtres dans un récipient de PBS à température ambiante pendant deux minutes après chaque lavage.Placez ensuite un filtre sur chaque maille d’acier à l’interface air-liquide de chaque puits. Ensuite, utilisez les ciseaux de dissection pour retirer l’utérus d’une souris embryonnaire enceinte au 11e jour et récolter les embryons de l’utérus. À l’aide de ciseaux de dissection, retirez le sac vitellin, le cordon ombilical et les viscères du corps de l’embryon.Et retirez soigneusement les tissus nerveux dorsaux et les tissus musculaires environnants. À l’aide d’une pince, retirez les tissus des membres antérieurs et postérieurs. Et séparez la région de l’AGM du corps de l’embryon.Placez ensuite chaque AGM sur un seul filtre à l’interface air-liquide de chaque puits. Placez les cultures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après deux à trois jours, transférez les échantillons d’AGM dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de collagénase pour leur dissociation à 37 degrés Celsius pendant environ 20 minutes avec une agitation toutes les cinq minutes.A la fin de la digestion stopper les réactions avec 200 microlitres de sérum par explant. Transférez tout le contenu de chaque tube dans des puits individuels d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits contenant 500 à 600 microlitres de milieu M3434 par puits. Mélangez les cellules dans chaque puits avec une seringue d’un millilitre sans aiguille.Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le nombre d’unités formant des colonies dans chaque puits peut ensuite être noté après sept à 10 jours de culture. Pour la transplantation d’explants d’AGM in vivo après deux à trois jours de culture d’AGM, comme nous venons de le démontrer, éradiquez létalement six souris noires C57 mâles âgées de huit à 10 semaines avec neuf gris de radiation.Quatre à cinq heures plus tard, dissocier les explants récoltés dans 200 microlitres de collagénase par échantillon comme démontré. Charge de 0,5 à un équivalent embryonnaire des suspensions unicellulaires résultantes dans une seringue d’un millilitre par animal receveur. Placez la première souris irradiée dans une contention et essuyez la queue avec un coton-tige imbibé à 75 % d’éthanol pour favoriser la vasodilatation des veines de la queue.Injectez par voie intraveineuse tout le contenu d’une seringue dans une veine de la queue dilatée. Utilisez un écouvillon antiseptique pour arrêter le saignement après le retrait de l’aiguille. Ensuite, remettez l’animal dans sa cage et injectez l’animal suivant.11 jours après le transfert adoptif, les rates peuvent être fixées dans la solution de Bouin pour le dénombrement macroscopique des colonies de rate visibles. Les cultures AGM supplémentées en fluoxétine montrent une expression accrue de Runx1, un gène pivot pour le développement des CSH aux niveaux d’expression de l’ARNm et des protéines. La fluoxétine peut également augmenter considérablement la capacité de formation de colonies de CSH dans l’AGM, y compris les érythroïdes unitaires formant des éclats, les monocytes granulaires unitaires formant des colonies et les granulocytes unitaires formant des colonies, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes.De plus, la transplantation in vivo de CSH traitées à la fluoxétine isolées d’explants de spongieuse asiatique entraîne une augmentation du nombre de colonies dans la rate d’animaux receveurs adultes irradiés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’AGM et d’effectuer une culture d’explant de l’AGM pour l’identification des régulateurs critiques du développement des HSC au sein de l’AGM.

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