Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole
12 mars 2018
Ce protocole décrit une analyse inversée invasion verticale qui pourrait être utilisée pour quantifier les capacités de migration et invasion des cellules dans un décor en trois dimensions tout en préservant le microenvironnement cellulaire. Ce dosage est adapté aux cellules rares et/ou sensibles.
L’objectif global de ce test d’invasion est de quantifier les capacités migratoires et invasives de cellules rares et sensibles dans un cadre 3D sans déloger les cellules de leur micro-environnement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer sur la capacité d’invasion d’événements sensibles et oratoires, tels que le produit de fusion de cellules cancéreuses. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont analysées dans leur micro-environnement d’origine à l’aide d’un réglage 3D.
Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer, car elle peut être utilisée pour dépister des agents pharmacologiques capables d’inhiber l’invasion des cellules cancéreuses et les métastases. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle. L’aspiration de la température et du pH du mélange de collagène affecte sa polymérisation et une manipulation brutale provoque le détachement du gel.
Commencez par bien traiter une boîte de culture de 35 millimètres avec un fond en verre de 10 millimètres avec un millilitre d’acide chlorhydrique molaire pour réduire l’hydrophobie du verre. Après 15 minutes, lavez la plaque deux fois avec un millilitre de PBS par lavage, suivi d’un lavage avec un millilitre d’éthanol à 70 %. Ensuite, rincez la plaque avec un millilitre de milieu de culture spécifique aux cellules d’intérêt à utiliser.
Et ensemencez la plaque avec les cellules d’intérêt. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence, combinez 114,5 microlitres de collagène de queue de rat fraîchement préparé, 16,6 microlitres de milieu 10 X DMEM et 33,1 microlitres de milieu de culture complété par un attractif de chimiothérapie d’intérêt dans un tube de microcentrifugation sur glace.
Neutralisez le mélange de collagène avec 14 microlitres de bicarbonate de sodium et recouvrez les cellules avec 80 microlitres de gel. Laissez le collagène polymériser dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, superposez deux millilitres de milieu de culture cellulaire sérique réduit à deux pour cent sur le gel et retournez soigneusement les cellules dans l’incubateur pendant la période expérimentale appropriée sans déloger le collagène.
À la fin de l’incubation, retirez délicatement le milieu et rincez soigneusement le gel avec un millilitre de PBS. Fixez les cellules avec un millilitre de paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes, suivi de deux lavages dans un millilitre de PBS par lavage. Ensuite, étiquetez les cellules avec une solution de DAPI pendant 20 minutes à température ambiante et imagez l’invasion tridimensionnelle de collagène in vitro par microscopie confocale.
Ici, la quantification de l’invasion du gel de collagène par une lignée cellulaire de cancer du sein et des produits de fusion de cellules de cancer du sein en réponse à un attractif de chimiothérapie sur une période de migration de 48 heures est présentée. Notamment, la migration de produits rares de fusion de cellules cancéreuses du sein dans le gel de collagène en réponse à l’attractif de chimiothérapie a également été observée. Les cellules restent saines tout au long de l’expérience sur gel de collagène, comme en témoigne le maintien d’un nombre de cellules robustes et leur morphologie 48 heures après la polymérisation du gel.
Ce dosage vertical sur gel de collagène permet également d’analyser la cinétique de migration cellulaire lors de l’invasion, en imageant la migration cellulaire en série Z ainsi que la morphologie des cellules migratrices à capturer in situ. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser une boîte de culture compatible avec votre microscope. À la suite de cette procédure, d’autres variables telles que la modification de la force du collagène ou l’utilisation de différents attractifs de chimiothérapie peuvent être introduites pour répondre à des questions supplémentaires sur les effets de l’engagement de la MEC sur l’invasion cellulaire ou de différents attractifs de chimiothérapie sur l’invasion cellulaire, respectivement.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie et du cancer pour dépister les inhibiteurs pharmacologiques des métastases ainsi que pour explorer la cicatrisation des plaies dans toutes les réponses inflammatoires in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la capacité migratoire et invasive des cellules rares et sensibles, dans un cadre 3D, sans déformer les cellules sur la micro-implication. N’oubliez pas que marcher avec des cellules cancéreuses humaines, de l’acide chlorhydrique, du paraformaldéhyde et du DAPI peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation d’une cabine septique biologique numéro deux et d’une retenue de fumée, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Ce protocole décrit un test d'invasion vertical inversé permettant de quantifier les capacités de migration et d'invasion de cellules rares et sensibles dans un environnement tridimensionnel, tout en préservant leur microenvironnement. Cette méthode est particulièrement pertinente dans la recherche sur le cancer.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Migration cellulaire
- Recherche sur le cancer
- Essais d'envahissement
Contexte
- Le test permet l'analyse des cellules dans leur micro-environnement d'origine.
- Il est conçu pour les cellules rares et sensibles.
- La compréhension de l'envahissement cellulaire est cruciale pour le développement de thérapies anticancéreuses.
- La démonstration visuelle de la technique est essentielle pour une exécution correcte.
Objectif de l'étude
- Quantifier les capacités migratoires et invasives des cellules.
- Explorer la capacité invasive des cellules sensibles.
- Évaluer des agents pharmacologiques qui inhibent l'envahissement et la métastase des cellules cancéreuses.
Méthodes utilisées
- Essai d'invasion verticale inversée
- Culture cellulaire tridimensionnelle
- Analyse des cellules dans leur micro-environnement
- Évaluation des effets de la température et du pH sur la polymérisation du collagène
Résultats principaux
- Démontré la capacité d'analyser le comportement cellulaire dans un environnement tridimensionnel.
- Mis en évidence l'importance du maintien du microenvironnement cellulaire.
- Apporté des informations sur les capacités invasives des cellules cancéreuses.
- Montré un potentiel pour le criblage d'agents thérapeutiques.
Conclusions
- Le test constitue un outil précieux pour la recherche sur le cancer.
- Il préserve le microenvironnement des cellules sensibles.
- Peut contribuer au développement de thérapies ciblant l'invasion et la métastase cancéreuses.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai permet aux équipes de R&D biopharmaceutique d'évaluer le potentiel invasif de modèles cellulaires rares et sensibles dans un microenvironnement tridimensionnel physiologiquement pertinent, sans perturber les interactions natives entre cellules et MEC. En préservant le compartiment cellulaire d'origine, cette méthode soutient une dé-risquisation mécanistique des cibles liées à la métastase et améliore la fiabilité prédictive lors de la validation précoce des cibles. Elle comble un manque critique dans le criblage préclinique, où les essais traditionnels compromettent l'intégrité du microenvironnement, renforçant ainsi la continuité translationnelle du stade de découverte à celui d'optimisation du candidat-médicament.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques en évaluant l'invasion dans des modèles cellulaires rares ou issus de fusion, dans des conditions microenvironnementales natives.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité artéfactuelle causée par le déplacement des cellules, améliorant ainsi la reproductibilité des phénotypes d'invasion entre les expériences.
- Valeur prédictive : Facilite la détection des cibles thérapeutiques en reliant des perturbations moléculaires à des résultats fonctionnels d'invasion dans un contexte tridimensionnel.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des métriques d'invasion standardisées et quantitatives, compatibles avec l'imagerie à haut contenu et les flux de travail d'analyse automatisée.
- Reproductibilité : Réduit au minimum la variabilité entre puits en éliminant la perturbation mécanique des couches cellulaires lors de la mise en place du test.
- Extensibilité : Compatible avec différentes concentrations de collagène et chimioattractants, permettant des études de relations structure-activité (SAR) pour les inhibiteurs de métastases.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise l'invasion cancéreuse humaine à l'aide de cellules hybrides fibroblaste-épithéliales reflétant les interactions stroma-tumeur in vivo.
- Continuité translationnelle : Relie les résultats in vitro à la validation préclinique en conservant les signaux du microenvironnement essentiels au comportement invasif.
- Décisions adaptées au risque : Fournit des données fonctionnelles sur l'invasion permettant de prioriser les cibles ou composés ayant une probabilité réduite d'échouer en phase tardive en raison d'une modélisation insuffisante du microenvironnement.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte, de la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés actifs, offrant une alternative préservant le microenvironnement aux systèmes de chambre de Boyden ou aux dispositifs transwell pour les programmes liés à la métastase.
- Biologie de la découverte : Permet des tests fondés sur des hypothèses concernant les voies d'invasion en assurant une imagerie en temps réel avec balayage en z de la migration cellulaire au sein de gels de collagène physiologiques.
- Écrans : Fournit des données sur l'invasion terminale adaptées à l'écrantage de bibliothèques de composés, notamment pour les agents ciblant le remaniement de la matrice extracellulaire ou la signalisation chimiotactique.
- Analytique : Permet la quantification du nombre de cellules ayant envahi et l'analyse morphométrique, offrant des lectures multiparamétriques pour la corrélation structure-fonction.
- Recherche translationnelle : Modélise l'invasion médiée par le stroma à l'aide d'hybrides MSC-cancer, soutenant des études mécanistiques liées à des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Adaptable à divers types de cancers et à des co-cultures stromales, favorisant la réutilisation de la plateforme dans des programmes sur la métastase et la cicatrisation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant les faux positifs dus à la perturbation du microenvironnement.
- Valeur opérationnelle : Améliore la robustesse des tests grâce à des protocoles standardisés de polymérisation du gel et de recouvrement.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller plus loin) en fournissant dès le début du processus des données d'invasion physiologiquement pertinentes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une progression hiérarchisée selon le risque des inhibiteurs de métastase, fondée sur des profils fonctionnels d'invasion en 3D.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire en 3D et en microscopie confocale pour une quantification précise de l'invasion.
- Dépend d'un contrôle précis de la température et du pH lors de la préparation du collagène afin d'assurer une polymérisation homogène du gel.
- Exige un dosage standardisé des chémoattractants et des conditions de milieu à teneur réduite en sérum pour des réponses chimiotactiques reproductibles.
- L'adaptation à d'autres protéines de la matrice extracellulaire (par exemple Matrigel, fibrine) peut nécessiter une optimisation des cinétiques de gélification et de la concentration.
- Limité aux cellules adhérentes ou semi-adhérentes capables d'envahir vers le haut à travers une couche de gel ; les cellules en suspension non adhérentes peuvent nécessiter des modifications.
