Name: Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez le modèle d'épilepsie par kindling chimique au pentylènetétrazole chez la souris 129 SV. Cette méthode permet d'étudier les crises induites et leurs conséquences comportementales et neuronales.

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Ce travail a été partiellement soutenu par un nombre de subventions JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 et 17 K 07086, numéros de bourse MEXT KAKENHI 25110737 et 23110525, AMED Grant nombre JP18ek0109311 et le SENSHIN Medical Research Foundation et le Japon Epilepsy Research Foundation.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’utilisation de la Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science et animalier. Postnatal 8 - 16 semaines souris sont recommandés. Toute souche consanguine est acceptable pour l’expérience. Les souris C57BL/6 sont plus résistants aux PTZ, tandis que BALB/c et suisses des souris albinos sont plus sensibles au PTZ. C57BL/6 ont été utilisées dans cette étude. Vulnérabilité aux PTZ dépend aussi de l’âge de la souris. Par rapport aux plus jeunes souris, souris âgées sont plus réfractaires aux PTZ35. Le nombre d’animaux utilisés pour cette méthode peut varier, mais au moins 6 à 10 animaux sont requis pour chaque condition.
1. préparation du PTZ
<ol><li>Dissoudre 2 mg/mL PTZ stérile 0,9 % (p/v) NaCl. Préparer PTZ sur le jour d’utilisation.</li>
</ol>2. injection de PTZ
<ol><li>Effectuer toutes les expériences entre 09:00 et 12:00 (midi).</li>
	<li>Mesurer le poids corporel de l’animal.</li>
	<li>Placer l’animal dans une chambre d’observation pour l’accoutumance.</li>
	<li>Au cours de la période d’accoutumance (3 min), calculer le volume de solution PTZ pour l’injection basée sur le poids corporel de l’animal et la dose d’injection préalablement déterminée. NOTE : par exemple, lorsque 35 mg/kg PTZ est utilisé, 0,875 mg de PTZ est requise pour une souris pesant 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Par conséquent, 437,5 μL de solution PTZ 2 mg/mL doit être injecté (0,875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dose d’injection du PTZ dépend du génotype de la souris et la souche. Pour les souris C57BL/6 de type sauvage, une dose de 30-35 mg PTZ/kg de poids corporel est recommandée pour le premier essai. Sensibilité au PTZ dépend de la souche utilisée de la souris36,37. La dose d’injection varie en fonction de l’objectif de l’expérience.</li>
	<li>Injecter par voie intrapéritonéale PTZ avec une seringue de 1 mL attachée à une aiguille de calibre 27 dans le quadrant gauche ou à droit de l’abdomen de l’animal. Éviter l’injection à la ligne médiane.<ol>
<li>Éviter des injections répétées au même endroit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observer les comportements animaux pendant 30 min après l’administration de PTZ (Figure 1 a) et classer et marquer le comportement anormal comme indiqué ci-dessous. Si possible, garder les animaux en observation pour 24 heures, ou au moins des 6-10 h après l’injection, surtout une fois que le score de gravité de saisie atteint 3 ou supérieure.<ol>
<li>Notez tout douces saisies ou des changements de comportement chez les animaux au-delà de la période d’observation de 30 min. Cela prolonge observation période peut-être adresser un effet particulièrement important et complète d’une dose sous-convulsive de PTZ dans la génération des chroniques saisies sans provocation contre l’epilepsie.</li>
		<li>En outre, mesure la durée de la saisie de chaque saisie observée comme changements dans durée de saisie se rapportent à la gravité de la crise. En outre, la latence de la première saisie après l’injection de PTZ est une autre importante mesure de percevoir. Surveillance de la fréquence des crises, la durée et le temps de latence est essentiel pour toute saisies après des études moléculaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter le PTZ tous les deux jours (Figure 1 a). Le nombre d’injections dépend de l’objectif de l’expérience. Voici des exemples représentatifs.<ol>
<li>Pour générer des animaux complètement allumé, une fois qu’un animal subit une saisie avec un score de 5 (crise tonico-clonique), finir l’injection au sein des administrations de trois supplémentaires. Dans ce cas, augmenter la dose d’injection si le score de saisie n’augmente pas pour trois administrations consécutives. Chaque animal peut recevoir un numéro différent et la dose d’injections de PTZ.</li>
		<li>Fixer le nombre et la dose d’injection PTZ dans toutes les conditions pour évaluer la vulnérabilité de PTZ, y compris dans les évaluations des antiépileptiques et études du phénotype des souris génétiquement modifiées. Donner à tous les animaux le même nombre d’injections de PTZ ; un total de 8 à 12 injections est recommandé. Si un animal meurt, le score de saisie devrait être désigné en tant que 6.</li>
		<li>Déterminer la dose d’injection nécessaire pour maintenir une saisie haute score (4 ou 5) pour 10 ou plusieurs injections pour étudier les changements histopathologiques qui se produisent des crises d’épilepsie. Dans ce cas, le nombre total d’injection doit varier de 25 à 30. Diminuer la dose d’injection si le score de saisie atteint 5. Si le score de saisie diminue égale ou inférieure à 3, augmenter la dose d’injection.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. saisie Score
<ol><li>Observez les comportements animaux et les scores.<ol>
<li>Classer et marquer les comportements épileptiques comme suit38,39 (Figure 1 b) : 0 : comportement normal, aucune anomalie. 1 : immobilisation, couché sur le ventre. 2 : tête myoclonie hochant la tête, du visage, membre antérieur ou postérieur. 3 : continue confiné myoclonie, myoclonique secousses, queue qui s’est tenue vers le haut avec raideur. 4 : saisie d’élevage, tonique, tombant sur le côté. 5 : crise tonico-clonique, tombant sur son dos, sauvage se précipiter et le saut. 6 : la mort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Changer les critères comportements basés sur la Racine Note40, selon les conditions expérimentales.</li>
</ol>4. la saisie après analyse
<ol><li>Analyse Immunohistopathological<ol>
<li>Fixation de perfusion<ol>
<li>Préparation<ol>
<li>Dissoudre 4 % (p/v) de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). Chauffer la solution à environ 70 ° C avec l’ajout d’une goutte de 1 NaOH M (environ 1 µL de 1 NaOH M pour 50 mL de solution de PFA).</li>
				<li>Préparer 4 glacee % PFA et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
				<li>Mettre en place une pompe péristaltique, avec un tube et l’aiguille. Faire passer environ 20 mL d’eau par le tube pour effacer les résidus. Ensuite, placez l’extrémité ouverte du tube dans PBS glacée.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Perfusion de Transcardial et préparation du cerveau fixe<ol>
<li>Profondément anesthésier la souris avec de l’éthanol de isoflurane/50% de 50 % dans un petit pot.</li>
				<li>Maintenir la souris en position couchée en épinglant les pointes de leurs membres antérieurs et postérieurs.</li>
				<li>Couper la ligne de médiane ventrale de l’abdomen et exposer le diaphragme.</li>
				<li>Découper la membrane le long du rebord costal. Ensuite, couper les deux côtés latérale des côtes et corps. Pincez le processus xiphoïde par la pince de verrouillage et evert la cage thoracique. Maintenir la position du processus xiphoïde par l’épinglage avec une aiguille ou il pincer avec une pince. Exposer le cœur.</li>
				<li>Introduire l’aiguille dans le ventricule gauche et faites une coupe dans l’oreillette droite à l’aide de ciseaux. Sachez ne pas à pousser l’aiguille trop loin dans le cœur, car il peut percer un mur intérieur.</li>
				<li>Commencer un flux constant de PBS glacée par l’aiguille de laver le sang (environ 15 à 20 mL/min).</li>
				<li>Quand le sang a été éliminé de l’organisme, passer le tube à une solution de paraformaldéhyde de 4 % (environ 60 mL) sans ajout de bulles. Puis, arrêter la perfusion.</li>
				<li>Couper le cou arrière et la colonne vertébrale et Décollez la peau de la tête et la partie dorsale du crâne avec ciseaux de dissection.</li>
				<li>Couper l’OS prémaxillaire entre les orbites oculaires et supprimer complètement la partie dorsale du crâne.</li>
				<li>Créer un espace entre le cerveau et les os jugal du côté postérieur et couper les nerfs trijumeau et le chiasma sous le cerveau. Soigneusement retirer le cerveau et le placer dans un flacon contenant 4 % PFA. Fixer le cerveau à 4 ° C pendant 12 à 16 h.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparation de tranches de cerveau<ol>
<li>Transférer le cerveau fixe à 20 % de sucrose/PBS jusqu'à ce que le cerveau s’enfonce dans la solution permettant de cryoprotection.</li>
			<li>Couper le cerveau fixe basé sur l’orientation de la tranche requis et la partie requise du cerveau.</li>
			<li>Définir la cryomicrotome. Placer la lame en position et maintenir la scène microtome à une température inférieure à-20 ° C.</li>
			<li>Placez le cerveau prédécoupé sur la scène et enduire le cerveau avec 20 % de sucrose/PBS. La solution de saccharose/PBS gèlera progressivement, couvrant le cerveau sur la scène, jusqu'à ce que le cerveau est entièrement noyé dans la gelée 20 % saccharose/PBS.</li>
			<li>Tranchez le cerveau (30 µm d’épaisseur) en faisant glisser la lame à travers le tissu. Transférer les tranches dans PBS et les conserver à 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry fluorescent<ol>
<li>Laver les tranches nécessaires à 0,1 % Triton X-100/PBS (PBST) pendant 10 min, 3 fois à température ambiante (RT).</li>
			<li>Bloquer les tranches en les incubant en PBST avec 2 % chèvre 5 % ou sérum albumine sérique bovine (BSA) pendant 1-2 h à température ambiante.</li>
			<li>Incuber les tranches dans une solution d’anticorps avec la concentration appropriée d’anticorps primaire dans le PBST avec 2 % chèvre BSA de sérum ou de 5 % pour 1 à 7 nuitées à 4 ° C.</li>
			<li>Laver les tranches dans du PBST pendant 10 min, 3 fois à température ambiante.</li>
			<li>Incuber les tranches dans une solution d’anticorps secondaire avec la concentration appropriée d’anticorps secondaire dans le PBST pendant 1-2 h à RT, protégés par la lumière.</li>
			<li>Monter les tranches sur lames de verre et recouvrir avec le milieu de montage et de la lamelle couvre-objet.</li>
			<li>Observer les tranches avec la microscopie de fluorescence.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Test de trois chambres<ol>
<li>Préparation<ol>
<li>Préparer au moins 2 2 - souris 129/Sv 6 mois du même sexe que les souris sujet à être la « souris par un étranger ». S’habituer à toutes les souris dans la cage avant l’analyse. Pour chaque session de formation, placez votre souris dans la cage et laisser la souris pendant 15 min.</li>
			<li>Avant chaque phase d’accoutumance avec la souris de sujet, nettoyer l’ensemble de l’appareil et les deux cages en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.</li>
			<li>Placer les cages vides dans les chambres des deux côté de l’appareil de 3 chambres et ouvrir les portes entre les chambres.</li>
			<li>Pour s’habituer à la souris de l’objet, de placer une souris du sujet dans l’hémicycle du centre et de permettre la souris se déplacer librement dans l’ensemble de l’appareil jusqu'à ce que la souris a enquêté sur les deux cages, ainsi qu’un animal sujet supplémentaire de 5 min. qui peut avoir peur de la cage ne sont pas enquêter sur la cage pendant 20 min et ne doit pas être utilisé pour cette analyse. Ces animaux, éviter la cage et viennent rarement à proximité de la cage.</li>
			<li>Après que l’animal se déplace dans la chambre de centre, fermez les portes et laisser la souris se déplacer librement dans la salle du centre pendant 5 min. Pendant cette période, une des souris 129/Sv mis dans une cage à s’habituer à la cage.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse de la socialité<ol>
<li>Procéder à cette analyse immédiatement après la période d’accoutumance de la souris de l’objet.</li>
			<li>Placer la cage contenant une souris 129/Sv, appelé la « cage de Stranger 1 », dans l’une des chambres à côté et la cage vide, appelée la cage « objet », dans l’autre chambre de côté.</li>
			<li>Ouvrez la porte et surveiller le comportement de la souris de l’objet.</li>
			<li>Laissez la souris sujet à se déplacer librement pendant 10 min et on enregistre les paramètres comportements suivants. Si la souris sujet a peur de la souris dans la cage 1 étranger, comme en témoigne la souris en évitant la cage 1 étranger et restant dans le coin de l’une des chambres, l’animal ne doit pas servir à l’analyse. un) temps passé dans chaque chambre, la chambre 1 de l’étranger, la chambre objet et Centre Chambre. b) temps passé à étudier chaque cage, la cage 1 étranger et la cage de l’objet. (La souris est classée étudie la cage si la souris est renifler ou toughing la souris ou la cage) c) le nombre d’entrées dans chaque chambre (optionnel) d) total distance parcourue (en option)</li>
			<li>Après que la souris se déplace dans la chambre de centre, fermer les portes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse sociale nouveauté<ol>
<li>Procéder à cette analyse immédiatement après l’analyse de la socialité.</li>
			<li>Essuyez les deux cages avec l’éthanol à 70 %.</li>
			<li>Placer une autre souris 129/Sv dans une des cages, appelés la « Cage de Stranger 2 » et place l’étranger 2 cage dans une des chambres. Placer la souris 1 inconnu dans l’autre cage, appelée la « cage de Stranger 1 » et la cage 1 inconnu dans l’autre chambre.</li>
			<li>Ouvrez la porte et surveiller le comportement de la souris de l’objet.</li>
			<li>Laissez la souris de l’objet à déplacer librement pendant 10 min et mesurer les mêmes paramètres comportements décrits pour l’analyse de la socialité. Remarque : La souris étranger 1 et 2 de l’étranger doivent être choisie au hasard. L’étranger 1 chambre et chambre objet ainsi que l’étranger 1 chambre et étranger 2 chambre devraient être déterminées au hasard.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Discrimination de peur contextuelle<ol>
<li>Climatisation<ol>
<li>Avant chaque essai de conditionnement, nettoyez l’appareil expérimental en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.</li>
			<li>Placez une souris dans un appareil de climatisation avec des conditions particulières (forme de l’appareil, couleur des murs, matériau du sol, odeurs, éclairage et volume de bruit de fond devraient être prédéterminés). Par exemple, l’appareil de conditionnement utilisé ici est un appareil carré avec plexiglass clair murs, un plancher de grille métallique, une odeur d’éthanol, luminosité 100 lux et 65 dB bruit blanc.</li>
			<li>Conditionner la souris de choc avec un timing Pseudo-aléatoire des chocs électriques 0,1-mA pour 2 s x 3 fois au cours de 5 min.</li>
			<li>Retourner la souris à la cage après conditionnement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Évaluation de la mémoire<ol>
<li>Avant chaque évaluation, nettoyer l’appareil expérimental en frottant la surface avec de l’éthanol à 70 %.</li>
			<li>Le lendemain suivant conditionnement, placez la souris dans le même appareil en état de choc et mesurer le temps de congélation au cours de 5 min.</li>
			<li>Plus tard, le même jour, placez la souris dans un appareil nouveau et mesurer le temps de congélation pendant une évaluation de 5 min. Un engin triangulaire avec plexiglas blanc murs, plancher plat, aucune odeur, luminosité 30 lux et bruit blanc 70-dB a été utilisé ici.</li>
			<li>Comparer le temps de congélation entre la même condition et l’état nouveau. Les souris avec une capacité de mémoire normale vont geler plus dans le même État que dans la nouvelle condition. La congélation est défini l’immobilité de l’animal pendant plus de 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Nous présentons ici un protocole largement accessible pour la mise en place d’un modèle animal pharmacologique de l’épilepsie. Bois d’allumage chimique induite par le PTZ a une longue histoire et est un modèle couramment accepté pour l’étude de la pathologie histopathologie et cellulaires de l’épilepsie,41. Le modèle chimique embrasement de l’épilepsie a été examiné précédemment par Suzdak et Jansen, 1995,42. Induction pharmacologique de saisie, en particulier avec le PTZ, ...

L’épilepsie est une affection neurologique chronique qui se caractérise par des crises récurrentes et touche environ 1 % des personnes. Les mécanismes sous-jacents de génération épileptogenèse et saisies chez les patients épileptiques ne peuvent pas être totalement clarifiés dans les études cliniques. Par conséquent, un modèle animal approprié est requis pour l’étude de l’épilepsie1.
Une variété de modèles animaux d’épilepsie ont été utilisés pour étudier la physiologie de l’épilepsie et d’identifier les médicaments anti-épileptiques2,3. Parmi ces modèles, l’induction pharmacologique de saisie est une méthode couramment utilisée pour générer un modèle animal pour l’étude de la pathologie de l’épilepsie4. Cette méthode est simple et peu coûteux. Induite par l’électrode allumage est également une méthode couramment utilisée, mais les frais de cette procédure sont plus élevés, et la méthode exige des compétences chirurgicales et électriques pour induire des crises répétitives5.
Induction pharmacologique est également avantageuse parce que le calendrier et le nombre de saisies sont facilement contrôlés. Des modèles de souris génétiques qui présentent des crises spontanées sont également utilisés dans l’étude de l’épilepsie. Toutefois, le fait de prédire quand et à quelle fréquence les crises surviennent dans ces modèles génétiques peut être impossible6. Un système de surveillance est nécessaire pour observer le comportement épileptique de souris génétiquement modifiées6.
Acide kaïnique, pilocarpine et pentylènetétrazole (PTZ) sont largement utilisés comme induisant la saisie de drogues7. Acide kaïnique est un agoniste des récepteurs du glutamate, et pilocarpine active les récepteurs cholinergiques. PTZ est un acide gamma aminobutyrique (GABA)-un antagoniste de récepteur8. PTZ supprime la fonction des synapses inhibitrices, conduisant à une augmentation de l’activité neuronale. Le présent règlement provoque des crises généralisées dans animaux9. Une seule injection de l’acide kaïnique et pilocarpine peut provoquer des crises aiguës, surtout état de mal épileptique (SE)10,11 et kaïnique acide ou pilocarpine-médiation SE favorise le chronique convulsions récurrentes et spontané12 , 13. enregistrements électroencéphalographiques (EEG) et l’analyse du comportement ont indiqué que les convulsions récurrentes spontanées sont observées un mois après une seule injection12,13. Une seule injection d’une dose convulsive de PTZ induit également la crise aiguë. Toutefois, des saisies spontanées chroniques après une seule injection de PTZ sont difficiles à promouvoir. L’administration chronique de PTZ est nécessaire pour induire des crises répétitives14. Dans les deux méthodes, la génération de crises répétitives est capable d’induire une pathologie plus semblable à celui de l’épilepsie humaine que la génération des crises aiguës. Dans le cas de PTZ, chaque injection évoque une crise d’épilepsie, et gravité de la saisie devient plus sévère selon des étapes avec chaque injection. Enfin, une seule injection de faibles doses PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Dans cette phase, chaque injection évoque des crises graves. En outre, la latence de la saisie et la durée aussi changent au cours des injections. La latence à la saisie tonique devient souvent plus courte dans la dernière phase d’allumage15. En outre, aggravation de la crise s’accompagne d’une saisie prolongée durée16. Étudie les mécanismes moléculaires régissant la sévérité de la saisie, latence et la durée est utile pour le dépistage des antiépileptiques17,18,19.
Saisies sont souvent induits par une seule administration systémique de PTZ, et la récupération est très rapide, moins de 30 min4,5. Ainsi, le nombre de saisies est plus contrôlable dans le modèle de PTZ-bois d’allumage. Surveillance EEG a cependant indiqué que les pointes généralisées peuvent être vu jusqu'à 12 h après saisie PTZ-mediated20. Donc, les animaux devrait préférence rester sous observation pendant 24 h après la crise myoclonique ou toniques21 pour une analyse plus précise des mécanismes de bois d’allumage.
L’administration de médicaments contre l’épilepsie comme éthosuximide, valproate, phénobarbital, vigabatrine et RÉTIGABINE3, avant ou après l’injection de PTZ atténue l’aggravation de la crise gravité3,22, 23. De même, chez des souris knockout que manque gènes impliqués dans l’exacerbation de saisie, tels que matrix metalloproteinase-924, FGF-2225 et neuritin26, ont démontré à exposer gravité réduite saisie après injections multiples de PTZ. En outre, observer des modifications histopathologiques après des crises d’épilepsie est possible avec cette méthode. Chez les patients atteints d’épilepsie du lobe temporal, il y a des modifications histologiques typiques dans le cerveau, comme les fibres moussues germination anormale granule neuron migration29,27,28, neuronale, astrogliosis30 mort à l’hippocampe31,32et33de la sclérose hippocampique. Des changements similaires sont observées chez les animaux de modèle épileptique. Parmi les méthodes disponibles, bois d’allumage chimique induite par le PTZ est une méthode bien, reproductible et peu coûteuse à produire un modèle animal de l’épilepsie. Dans un modèle SE induite par la pilocarpine, contrôle de saisie est difficile et beaucoup de souris meurent ou ne parviennent pas à développer SE34. En revanche, la mortalité et la gravité de la crise sont plus contrôlables dans le modèle PTZ. En outre, PTZ est moins cher que l’acide kaïnique et compétences en chirurgie de cerveau de souris ne sont pas requis pour l’administration de médicaments.

<table><tbody><tr><td>Pentylènetétrazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>MANAC</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Souris</td><td>CLEA Japon</td><td></td><td>C57Bl/6NJcl, postnatale 8 semaines, seringue mâle</td></tr><tr><td>(1mL)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler</td><td>PE2000</td><td>Cet article n’est plus fabriqué. Presque équivalent au FX-2000i avec le FXi-12-JA d’A& D.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>nacalai tesque</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristatique</td><td>ATTO</td><td>SJ1211</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>nacalai tesque</td><td>30404-45</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Yamato</td><td>REM-700</td><td>Cet article est un produit abandonné. Presque équivalent à REM-710</td></tr><tr><td>Lame de microtome</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-synaptoporine</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>102 002</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-ZnT3</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>197 002</td><td></td></tr><tr><td>anti-doublecortin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8066</td><td>Cet article est un produit qui n’est plus fabriqué. Nous n’avons pas testé le produit équivalent (sc-271390).</td></tr><tr><td>Appareil d’essai de discrimination contextuelle de la peur</td><td>O’hara Appareil d’essai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>à trois chambres</td><td>Muromachi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylènetétrazole (PTZ) est un antagoniste des récepteurs GABA-A. Une injection intrapéritonéale de PTZ dans un animal induit une crise aiguë, sévère à une dose élevée, alors que les injections séquentielles d’une dose de sous-convulsive ont été utilisées pour le développement de produit chimique kindling, un modèle de l’épilepsie. Une seule injection de faibles doses de PTZ induit une crise d’épilepsie bénigne sans convulsion. Toutefois, des injections de faibles doses répétitives de PTZ diminuent le seuil pour évoquer une crise convulsive. Enfin, administration de faible dose continue de PTZ provoque une grave crise tonico-clonique. Cette méthode est simple et largement applicable pour étudier la physiopathologie de l’épilepsie, qui est définie comme une maladie chronique nécessitant des crises répétitives. Ce produit chimique kindling protocole provoque des crises répétitives chez les animaux. Avec cette méthode, on estimait la vulnérabilité aux crises induite par le PTZ ou le degré d’aggravation des crises d’épilepsie. Ces avantages ont conduit à l’utilisation de ce procédé de criblage de médicaments contre l’épilepsie et les gènes liés à l’épilepsie. En outre, cette méthode a servi à enquêter sur les dommages neuronaux après des crises d’épilepsie car les modifications histologiques observées dans le cerveau des patients épileptiques apparaissent également dans le cerveau des animaux chimique-allumé. Ainsi, le présent protocole est utile pour produire facilement des modèles animaux d’épilepsie.

Injection répétitive du PTZ induit une augmentation dans la sévérité de la saisie. Six souris C57BL/6 ont été traités avec le PTZ, et un autre 6 souris ont été traitées avec une solution saline comme un groupe de contrôle. La dose PTZ était de 35 mg/kg et 10 injections ont été réalisées. Le score de saisie a augmenté graduellement avec des injections de PTZ, tandis que pas saisies ou comportements anormaux ont été évoqués par des injections salines (Figure 2)...

Ce protocole décrit une méthode de bois d’allumage chimique avec pentylènetétrazole et fournit un modèle de souris de l’épilepsie. Ce protocole permet également d’enquêter sur la vulnérabilité à l’induction de la saisie et la pathogenèse après les crises d’épilepsie chez les souris.

Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Cette méthode peut aider à l’analyse approfondie de l’épilepsie. La crise induira des changements histologiques dans le cerveau qui peuvent être impliqués dans les troubles neuropsychiatriques du développement. Le principal avantage de cette technique est que la dose auto-conversive de PTZ peut induire des crises contrôlables mieux que les autres méthodes actuelles.Commencez à préparer l’injection en dissolvant 2 milligrammes par millilitre de PTZ dans du chlorure de sodium stérile à 0,9 %. Pesez l’animal, puis placez-le dans une chambre d’observation pour une période d’accoutumance de 3 minutes. Ensuite, injectez du PTZ par voie interpéritonéale avec une seringue de 1 millilitre attachée à une aiguille de calibre 27 dans le quadrant gauche ou droit de l’abdomen de l’animal.Enfin, observez l’animal après l’injection de PTZ pour un comportement anormal. Procurez-vous au moins deux souris 129 SV âgées de deux à six mois du même sexe que les souris sujettes pour être la souris étrangère. Chaque souris inconnue doit être conservée séparément.Pour chaque séance d’entraînement, laissez la souris dans la cage pour l’habituer pendant 15 minutes. Nettoyez l’ensemble de l’appareil dans les deux cages en essuyant la surface avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez les cages vides dans les deux chambres latérales de l’appareil à trois chambres et ouvrez les portes entre les chambres.Pour habituer la souris sujette, placez-la dans la chambre centrale et laissez-la se déplacer librement dans l’appareil jusqu’à ce qu’elle ait exploré les deux cages, plus cinq minutes supplémentaires. Une fois que l’animal s’est déplacé dans la chambre centrale, fermez les portes et laissez la souris se déplacer librement dans la chambre centrale pendant cinq minutes. Pendant cette période, mettez l’une des 129 souris SV dans une cage pour s’habituer à la cage.Immédiatement après la période d’accoutumance de la souris sujette, placez la cage contenant la souris 129 SV, appelée la cage Stranger One, dans l’une des chambres latérales et placez la cage vide, appelée cage Object, dans l’autre chambre latérale. Ouvrez la porte et surveillez le comportement de la souris concernée. Laissez la souris concernée se déplacer librement pendant 10 minutes et enregistrez quatre paramètres comportementaux.Premièrement, le temps passé dans chaque chambre, la chambre de l’Étranger Un, la chambre de l’Objet et la chambre centrale. Deuxièmement, le temps passé à enquêter sur chaque cage, la cage de Stranger One et la cage d’Object. Numéro trois, le nombre d’entrées dans chaque chambre et numéro quatre, la distance totale parcourue.Une fois que la souris s’est déplacée dans la chambre centrale, fermez les portes. Après avoir essuyé les cages, commencez l’analyse de nouveauté sociale en plaçant une autre souris 129 SV dans l’une des cages, appelée la cage Stranger Two, et placez la cage Stranger Two dans l’une des chambres. Placez la souris Stranger One dans l’autre cage, appelée cage Stranger One, et placez la cage Stranger One dans l’autre chambre.Enfin, ouvrez la porte et surveillez le comportement de la souris du sujet. Laissez la souris concernée se déplacer librement pendant 10 minutes et mesurez les mêmes paramètres comportementaux décrits pour l’analyse de la socialité. Commencez par placer une souris dans un appareil de conditionnement avec des conditions spécifiques.Par exemple, un appareil carré avec des parois en plexiglas transparent, un sol en grille métallique, une odeur d’éthanol, une luminosité de 100 lux et un bruit de fond blanc de 65 décibels. Conditionnez la souris par un choc du pied avec un chronométrage pseudo-aléatoire de 0,1 milliampère, des chocs électriques pendant deux secondes, trois fois au cours de cinq minutes. Ensuite, retournez la souris dans la cage d’accueil après le conditionnement.Le lendemain du conditionnement, effectuez une évaluation de la mémoire en plaçant la souris dans le même appareil que la condition de choc et en mesurant le temps de congélation sur une période de cinq minutes. Plus tard dans la journée, placez la souris dans un nouvel appareil et mesurez le temps de congélation au cours d’une évaluation de cinq minutes. Enfin, comparez le temps de congélation entre la même condition et la nouvelle condition.Les résultats ont indiqué que le score des crises augmentait progressivement avec les injections PTZ, alors qu’aucune crise ou comportement anormal n’était évoqué par les injections de solution saline. De plus, les crises répétitives ont favorisé la formation de branches axonales aberrantes ou la germination de fibres moussues et la migration anormale des cellules granulaires dans l’hippocampe. Les souris traitées par PTZ ont montré une socialité normale.Les souris passaient plus de temps dans la chambre de Stranger One que dans la chambre de l’Objet et enquêtaient sur la cage de Stranger One plus qu’elles n’enquêtaient sur la cage de l’Objet. Les souris traitées par PTZ ont montré une nouveauté sociale anormale, indiquant une mémoire sociale altérée. Les souris traitées par PTZ ont également montré une mémoire altérée dans le test de peur contextuelle.Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le labyrinthe d’eau de Morris ou les autres tests de mémoire peuvent être effectuées pour répondre aux questions supplémentaires sur la capacité de mémoire altérée affectée par la crise d’épilepsie. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épilepsie pour explorer en tant que mécanisme des troubles du développement neuropsychiatrique induits par les crises en utilisant des animaux modèles.

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