La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

L’objectif global de cette méthodologie est d’acquérir et d’analyser la dynamique de la grande population de cellules adhérentes surveillées au moyen de la vidéomicroscopie sans lentille. Nous pensons donc que cette technique est intéressante dans de nombreux domaines de la biologie et pour l’étude de la prolifération cellulaire ou de la cystite cellulaire ou du criblage de médicaments, ou encore de la surveillance de différents bioprocédés. Cette technique est donc sans étiquette et c’est très simple.

Mais il est très efficace pour étudier de grandes populations cellulaires. Quelle idée pour cette méthode, quand on est passé du domaine de la détection des bactéries au domaine de l’imagerie des cellules de mammifères. Ensuite, il était utile que le biologiste, ils auront besoin d’acquisition en accéléré du circuit directement dans l’incubateur.

Ensuite, nous avons construit un microscope vidéo sans lentille personnalisé compatible avec l’incubateur et nous avons développé un algorithme de reconstruction holographique pour obtenir l’image de milliers de cellules présentes dans le très grand champ de vision. Commencez cette procédure en enduisant une plaque inférieure en verre de 6 puits de fibronectine à température ambiante pendant 1 heure. Après 1 heure, retirez l’excès de fibronectine et rincez la plaque inférieure en verre à 6 puits avec du PBS.

Des cellules Hela, cultivées dans un milieu DMEM, plus de la glutamine, complétées par 10 % de chaleur dans du sérum de veau fœtal activé, et 1 % de pénicilline et de streptomycine sont utilisées dans cette démonstration. Semez vingt mille cellules par plaque de culture. Il est important d’utiliser un récipient à fond en verre.

Pour la qualité de l’acquisition sans objectif. Placez la plaque de culture dans l’incubateur au-dessus du microscope vidéo sans objectif. Le microscope vidéo sans objectif utilisé pour cette acquisition en accéléré est disponible dans le commerce.

Il dispose d’un capteur d’image à semi-conducteur à oxyde métallique avec une zone d’imagerie de 29,4 millimètres carrés et un pas de pixel de 1,67 micromètre. L’éclairage à plusieurs longueurs d’onde est fourni par un dispositif à diodes électroluminescentes multi-puces situé au-dessus d’un sténopé de 150 micromètres à une distance d’environ 5 centimètres des cellules. Avant de commencer l’acquisition en time-lapse, il est important de vérifier qu’il n’y a pas de condensation sur la plaque de recouvrement.

Parce que la condensation va dégrader la qualité d’image de l’acquisition. S’il s’est produit de la condensation sur le couvercle de la plaque de culture, nettoyez le couvercle. Contrôlez le microscope vidéo sans objectif à l’aide d’un logiciel d’acquisition disponible dans le commerce.

Qui effectue à la fois l’acquisition en time-lapse et la reconstruction holographique. Entrez les paramètres d’entrée requis dans l’interface du logiciel. Réglez la fréquence d’images sur 1 acquisition toutes les 10 minutes, le type de culture cellulaire sur adhérent et la durée de l’expérience sur 3 jours.

Lancez l’acquisition en accéléré. Cette image montre un exemple du champ de vision complet d’une acquisition brute dans le canal bleu sur une zone de 29,4 millimètres carrés dans une image. Le panneau B est le détail du panneau A, et le panneau C est le détail du panneau B.L’algorithme de reconstruction holographique traitera automatiquement l’acquisition sans lentille pour obtenir l’image de phase de la culture cellulaire.

Un exemple d’image de cellules avant le dépliage de phase est présenté, suivi d’une image après le dépliage de phase. Le suivi des cellules est réalisé à l’aide de l’algorithme TrackMate, un plug-in fidjien open source pour le suivi automatisé des particules uniques. Après le chargement, l’acquisition complète du time-lapse dans Fidji et la configuration des algorithmes comme décrit dans le protocole texte, définissez les paramètres d’entrée.

Réglez le diamètre estimé de la goutte sur 15 pixels, le seuil du détecteur sur 0,25, la distance maximale de liaison sur 15 pixels, la distance maximale de fermeture de l’écart sur 15 pixels et le nombre de points dans la piste sur 3,5. La première étape de l’algorithme de suivi des cellules est la détection des cellules dans l’acquisition sans lentille. Les résultats de l’algorithme de suivi des cellules sont affichés, avec toutes les traces de cellules affichées sur cinquante images, soit environ 8 heures.

Avec un code couleur correspondant à la vitesse médiane. Le panneau inférieur est une image détaillée du rectangle jaune du panneau supérieur. Un clip vidéo représentatif du suivi des cellules est présenté ici.

À la fin du processus de suivi des cellules, sélectionnez le bouton d’analyse pour générer les résultats sous la forme de 3 fichiers texte. Sur la base de ces données, effectuer une segmentation cellulaire et détecter les divisions cellulaires à l’aide d’algorithmes dédiés, comme détaillé dans le protocole texte et les fichiers de code supplémentaires. La compilation de toutes les mesures d’une seule cellule sur l’acquisition complète en accéléré produit des diagrammes de dispersion de plusieurs mesures en fonction du temps.

Le nombre total de cellules dans le champ de vision complet passe de deux mille à quinze mille en 2,7 jours. Multiplié par le nombre de points temporels, cela conduit à un grand ensemble de données de cellules détectées. Chacun se caractérise par ses coordonnées et ses caractéristiques morphologiques, telles que la masse sèche, la surface, l’épaisseur moyenne, la longueur d’accès principale et le rapport d’aspect.

La combinaison d’algorithmes de suivi et de segmentation cellulaires permet des mesures cinétiques au niveau d’une seule cellule. Cet exemple montre l’analyse de la trajectoire cellulaire d’une durée d’environ soixante-six heures, et présentant 4 divisions cellulaires aux points temporels entourés en jaune. Plusieurs paramètres ont été calculés en fonction du temps : surface cellulaire, masse sèche, épaisseur moyenne et motilité cellulaire.

La distribution de la durée du cycle cellulaire pour une observation de 2,7 jours était proche de celle de l’agouzian. Avec une moyenne de 16,5 heures. Les durées des cycles cellulaires, mesurées automatiquement, sont bien corrélées à celles mesurées manuellement.

D’autres paramètres ont également été examinés, tels que la masse sèche initiale de la cellule, la masse sèche finale et le taux de croissance moyen au cours du cycle cellulaire. Une fois maîtrisée, l’analyse complète des données de l’acquisition en time-lapse, peut être réalisée en quelques heures, en fonction de la configuration du CPU et des performances matérielles. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de soigneusement la concentration cellulaire initiale.

Si la concentration initiale de cellules est trop importante, l’algorithme de suivi cellulaire ne parviendra pas à définir correctement les trajectoires cellulaires. Mais, si la concentration cellulaire est trop faible, les statistiques de l’analyse complète seront également trop faibles. Suite à cette procédure, des analyses automatisées de type suivi cellulaire peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions dans les domaines de la biologie, de la biologie fondamentale ou de la chimiotaxie.

Cette nouvelle technique ouvre également la voie au suivi de la lignée cellulaire qui, espérons-le, apportera des informations intéressantes pour étudier le cycle cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’acquisition en accéléré au moyen de la microscopie vidéo sans lentille et d’analyser une grande population de cellules.