Name: À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez une méthode in vitro pour générer des sous-clones résistants aux médicaments et restaurer la sensibilité par précipitation génique. Cette approche standardisée permet d'étudier les mécanismes de résistance acquise aux thérapies ciblées en cancérologie.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Veronica Zanoni pour l’édition du manuscrit.

Remarque : Ce protocole a été ajusté spécialement pour l’analyse des mécanismes qui sous-tendent la résistance acquise au trastuzumab de lignées de cellules de cancer gastrique HER-positive. Tous les instruments de laboratoire nécessaires figurent dans la Table des matières.
1. génération des sous-clones résistant à la thérapie ciblées
NOTE : Ceci est la plus critique et difficile à normaliser pas dans le protocole dû au fait que différentes lignées cellulaires peuvent présenter des sensibilités différentes à l’inhibiteur de thérapeutique ciblée indépendamment de leur concentration de tumeur histotype ou drogue utilisé.
<ol><li>Cellule NCI-N87 culture line en milieu RPMI additionné de sérum de veau foetal (10 %) et de la glutamine (2 mM, 1 %), comme une monocouche à 37 ° C et il des graines sur les flacons de culture 25 cm2 .</li>
	<li>Ajouter au milieu de culture dans chaque fiole 10 µg/mL de trastuzumab comme la dose de départ. Exposer les cellules à la dose de départ jusqu'à ce qu’ils reprennent de plus en plus. Remarque : La dose initiale de l’inhibiteur de la thérapie ciblée doit être 10 fois plus faible que son pic de concentration plasmatique. La concentration plasmatique maximale est le plus haut niveau de concentration du médicament détectée dans le sang de patients habituellement après des doses multiples d’un traitement standard. Cette valeur peut être récupérée à partir d’études sur la pharmacocinétique.</li>
	<li>Surveiller la croissance des cellules avec la méthode d’exclusion du bleu trypan ; est reprise de la croissance des cellules (généralement après une période de deux à trois semaines), exposer les cellules à une concentration 10 fois de dose plus élevée de trastuzumab.</li>
	<li>Exposer les cellules à une dose progressivement croissante du trastuzumab (à partir de 100 µg/mL à 400 µg/mL) jusqu'à garder les cellules en croissance (après environ 2 semaines), malgré la présence d’une concentration élevée de médicaments (au moins 2,5 - 4 fois plus élevé que le pic plasmatique).</li>
	<li>
Effectuer un dosage clonogéniques pour évaluer le niveau de résistance à la thérapie ciblée à chaque variation de la concentration de l’inhibiteur de la cible thérapeutique dans le milieu de culture et de définir la résistance relative IC50 index (RR IC50) comme suit.
	<ol>
<li>Graines de 500 cellules dans 24 plaques multipuits culture. NOTE : 5 puits doivent être établis pour chaque ensemble de conditions.</li>
		<li>Exposez les cellules à des concentrations croissantes cible thérapeutique inhibiteur (trastuzumab) 100 µg/mL jusqu'à 400 µg/mL.</li>
		<li>Incuber les cellules dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pendant 15 jours.</li>
		<li>Après incubation, difficulté et tacher les échantillons comme suit.<ol>
<li>Supprimer des cellules moyennes et rincer avec du PBS 1 x 10 mL. Retirer 1 x PBS et ajouter 2 à 3 mL de solution de fixation (1:7, (vol/vol), l’acide acétique : méthanol). Enlever la solution de fixation et ajouter 0,5 % solution de violet de gentiane. Incuber à température ambiante pendant 2 h</li>
			<li>Enlever la solution de violet de gentiane soigneusement par aspiration avec une pipette et immerger les plaques dans l’eau du robinet pour rincer les résidus de solution de violet de gentiane. Sécher à l’air à température ambiante pendant 2 jours.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dénombrer les colonies de plus de 50 cases à l’aide d’un microscope inversé (grossissement de X 4). Remarque : Deux observateurs indépendants sont requis pour cela.</li>
		<li>Calculer RR IC50 comme le rapport entre la valeur50 de cellules sous-clone cible-thérapie-résistant et la valeur des cellules original/naïve.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. validation protocole pour le candidat ciblé thérapie résistance gène (R)
Remarque : Après la caractérisation de l’expression génique, signatures associées à l’acquisition de la résistance à la thérapie de la cible et n’importe quel gène candidat comme conducteur de résistance sera étudié à travers : a) RT-PCR et b) Western blot analyse.
<ol><li>
RT-PCR en temps réel
	<ol>
<li>Extraire l’ARN total de lignées cellulaires utilisant acide guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme mélange (voir Table des matières).</li>
		<li>Effectuer des réactions de transcription inverse (RT) en utilisant des amorces hexamère aléatoire et définissez le thermocycleur comme suit : amorçage à 25 ° C pendant 5 min, RT à 46 ° C pendant 20 min et l’inactivation de la RT à 95 ° C pendant 1 min.</li>
		<li>Utilisation 400 ng d’ARN total pour une réaction de 20 µL. Préparer le mélange réactionnel pour échantillon comme suit : 7 µL RNase libre H2O, 2 µL cADN (10 ng/µL), 1 µL 20 x sonde spécifique à la cible marquée par fluorescence et 10 µL 2 x Mix contenant tampon dNTPs et ADN polymérase (voir Table des matières).</li>
		<li>Ajouter 20 µL du mélange réactionnel pour chaque plaque de puits et exécuter le programme suivant : tenue de scène à 50 ° C pendant 2 min, à 95 ° C pendant 10 min (1 cycle) ; puis 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et à 60 ° C pendant 1 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tache occidentale
	<ol>
<li>Récupérer des suspensions cellulaires en ajoutant 2 mL de solution de trypsine/EDTA 0,05 % et permettant à 2-3 min pour la trypsine travailler.</li>
		<li>Ajouter les 2 volumes de moyenne contenant 10 % sérum de veau fœtal pour neutraliser la trypsine (p. ex., 2 mL de milieu pour chaque 1 mL de trypsine) et centrifuger à 1 200 g pendant 5 min. jeter surnageants et laver les cellules avec du PBS 1 x contre le rhume.</li>
		<li>Centrifuger à 1 200 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire avec tampon de lyse et incuber sur un balancier à 4 ° C pendant 30 min.<ol>
<li>Le montant de tampon de lyse dépend du nombre de cellules (par exemple, 100 µL pour 1 x 106 cellules) ; Veillez à préparer de tampon de lyse frais chaque fois. 1 ml de la préparation de tampon de lyse (congé sur la glace) : utiliser µL 975 M-par tampon lysat mammifères, inhibiteurs de protéase et phosphatase 15 µL et 10 µL 100 µM PMSF inhibiteurs.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Récupérer la surnageante protéine par centrifugation lysat cellulaire à 13 000 x g à 4 ° C pendant 15 min.</li>
		<li>Déterminer les concentrations de protéine à l’aide d’un dosage protéique BCA.</li>
		<li>Ajouter 4 x LaemmLi solution tampon à échantillons de protéines (au moins 20 à 30 µg de protéines) et de la chaleur à 100 ° C pendant 3 min.</li>
		<li>Utiliser des gels de préfabriqué de 4 à 20 % et charger 20-30 µg de LaemmLi solution de protéine et de 5 à 10 µL de protéine étalon par échantillon.</li>
		<li>Remplissez l’anneau de Western blot avec tampon 1 x TRIS/GLICYNE /SDS et exécutez le gel à 110 V pendant 30-60 min (quand le temps s’arrête Vérifier que la teinture a atteint la fin du gel, sinon tourner pendant quelques minutes supplémentaires)</li>
		<li>Electroblot à la protéine de transfert dans une membrane PVDF (voir Table des matières) en utilisant un système semi sèche.</li>
		<li>Bloquer la membrane en trempant dans la solution appropriée de protéines (lait/BSA 5 %) sur l’agitateur à température ambiante pendant 1 h.</li>
		<li>Préparer une solution de 1 : 400 avec anti-IQGAP1 anticorps primaire dans une solution de lait 5 % (voir la Table des matières).</li>
		<li>Placer la membrane dans une solution d’anticorps primaire sur un agitateur dans une chambre froide pendant la nuit.</li>
		<li>Le lendemain, jeter la solution d’anticorps et tremper dans la solution 1 x T-TBS (1 x T-TBS : 1 x tampon Saline Tris ajouté par Tween20 0,1 %) sur un agitateur à température ambiante pendant 7 min.</li>
		<li>Jeter T-SCT 1 x solution et remplacer. Répéter 3 fois.</li>
		<li>Préparer une solution de souris-anticorps secondaire de 1/10 000 en ajoutant des anticorps pour Western standard détection tache (voir Table des matières) et placer la membrane sur un agitateur ; laisser à température ambiante pendant 2 h.</li>
		<li>Jeter la solution d’anticorps et tremper dans la solution 1 x T-TBS sur un agitateur à température ambiante pendant 7 min.</li>
		<li>Jeter T-SCT 1 x solution et remplacer. Répéter 3 fois.</li>
		<li>Tremper la membrane pendant 5 min dans une solution par chimiluminescence et l’image de la membrane sur un imageur de chimiluminescence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. restauration cible-traitement inhibiteur de la sensibilité par précipitation R-gène candidat
<ol><li>
Préparation de cellules
	<ol>
<li>Préparation suspension monocellulaire par trypsinisation. Effectuer la transfection le jour où les cellules sont plaqués.<ol>
<li>NCI-N87 laver les cellules avec du PBS et incuber à 37 ° C avec une solution de trypsine/EDTA 0,05 % pour 5-10 min. Ajouter 2 volume de RPMI moyen contenant 10 % sérum de veau fœtal pour neutraliser la trypsine (p. ex., 2 mL de milieu pour chaque 1 mL de la trypsine).</li>
			<li>Compter les cellules avec un hémocytomètre utilisant une coloration bleu trypan. Cellules de5 graines 2,5 x 10 (confluence de 60 %) dans une fiole de2 cm de T25 pour chaque condition. Remarque : Le nombre de cellules pour l’amorçage approprié est déterminé par le temps de doublement de la ligne de la cellule et la durée de l’expérience. Le but est de réaliser le gène cible précipitation pendant toute la durée de l’expérience. Neuf T25 flacons de2 cm sont idéales pour les conditions de la transfection et l’essai clonogéniques (3 flacons pour les contrôles, 3 flacons pour les contrôles négatifs de transfection, 3 flacons pour la transfection du gène-cible).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inverser la transfection
	<ol>
<li>Préparer le gène-cible et négatifs mix de transfection de contrôle pour chaque fiole T25 de2 cm comme suit.<ol>
<li>Diluer 12,5 µL de chaque oligonucléotides de siARN ciblant les gènes ou les oligonucléotides siARN contrôle négatif dans un milieu minimal essentiel transfection (ratio 01:55 ; voir Table des matières).</li>
			<li>Ajouter un réactif de transfection de liposomes cationiques (ratio 1:1 avec ciblage de gène siARN oligonucléotides ; voir Table des matières). Incuber à température ambiante pendant 20 min. Remarque : Le volume total du mélange transfection est 700 µL.</li>
			<li>Ajouter 700 µL du mélange transfection dans chaque fiole T25 de2 cm. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 à 3 jours.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vérifiez le gène précipitation par RT-PCR et analyse par Western blot. Vérifiez à nouveau l’impact de la présumée des gènes R précipitation sur la restauration de la sensibilité à l’agent thérapeutique ciblée grâce à des expériences de formation de colonie (répéter l’étape 1.5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapies%3A+a+new+generation+of+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li>
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<li>Bang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+in+combination+with+chemotherapy+versus+chemotherapy+alone+for+treatment+of+HER2-positive+advanced+gastric+or+gastro-oesophageal+junction+cancer+%28ToGA%29%3A+a+phase+3%2C+open-label%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from:
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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773">http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029">http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390">http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390</a> (2017).</li>
<li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer%3A+Future+steps+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li>
<li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477(2014).</li>
<li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li>
<li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+%28R%29-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que personnalisé et ciblé des thérapies ont suscité l’enthousiasme croissant, ces thérapies dites « intelligentes » face à l’obstacle majeur même comme les médicaments de chimiothérapie traditionnelle, c'est-à-dire, l’acquisition rapide et imprévisible de la pharmacorésistance. Pour améliorer les résultats de la thérapie ciblée, des problèmes de résistance aux médicaments doivent être résolus par une meilleure compréhension des mécanismes qui les causent. Ici, nous avons présenté une méthode largement acce...

Suite aux découvertes cruciales en biologie moléculaire et cellulaire, un certain nombre de nouvelles molécules anticancéreuses synthétisées ont été développé pour cibler sélectivement les voies de signalisation oncogènes dans un large éventail de types de tumeurs. En particulier, deux catégories d’agents thérapeutiques ciblés aux propriétés uniques en oncologie, des composés chimiques synthétiques à savoir et on sait que les anticorps monoclonaux recombinants, ont obtenu des succès cliniques et considérablement altérée du cancer dans ces dernières décennies1,2,3.
Néanmoins, malgré leur impressionnante réponse initiale au traitement, la majorité des patients atteints de cancer ont développé la résistance à tous les agents thérapeutiques ciblées, les anticorps monoclonaux et inhibiteurs de la kinase. En conséquence, la résistance aux médicaments, l’obstacle majeur pour des médicaments anticancéreux classique4, est toujours un grand défi pour les nouvelles thérapies ciblées5,6.
Résistance à la thérapie ciblée peut être intrinsèque (c'est-à-direprimaire) ou acquis (p. ex., secondaire). Résistance intrinsèque décrit un manque de novo de la réponse au traitement, tandis que la résistance secondaire survient après une période de réponse aux médicaments traitement7. Ce dernier est causé par des flambées de petites cohortes des cellules tumorales dans la majeure partie de la tumeur primitive ou niché dans des créneaux anatomiques cryptiques distales, présentant jusqu'à 90 % résistance à un ou plusieurs ciblées agents thérapeutiques. Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent un développement de la résistance à la thérapie ciblée principalement résultent de mutations du gène cible et redondante activation d’autres voies de signalisation apoptotiques, dont la compréhension est encore loin d’être complet8.
Dans ce travail, nous avons proposé une approche temps - et rapport coût - entrée pour étudier in vitro des mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de réduire au silence procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur, un outil crucial pour tester et valider les hypothèses de travail. En particulier, notre approche a été utilisée pour étudier, dans le cancer gastrique, les mécanismes de résistance au trastuzumab (p. ex., Herceptine), un anticorps monoclonal humanisé ciblant le domaine extracellulaire de protéine HER29. Trastuzumab + chimiothérapie est largement reconnue comme le traitement standard de première ligne du cancer du sein métastatique HER2-positif. Grâce à des études précliniques récentes montrant qu’anti-HER2 thérapies ont une activité significative dans les deux in vitro et in vivo de cancer gastrique HER2 positive modèles10,11, médicaments moléculaires ciblant HER2 ont été largement étudié dans les essais cliniques, dont certains sont toujours en cours, sur des patients avec gastro cancer12,13,14,15.
Ces études ont souligné le nombre croissant de patients souffrant de résistance au trastuzumab16, similaire à ce qui est observé d’autres inhibiteurs de thérapeutiques ciblées. En particulier, le taux de réponse de trastuzumab a été de 47 % et la médiane de survie globale pour les patients sous trastuzumab + chimiothérapie a été plus longues que pour les patients sous chimiothérapie seule172,7 mois seulement. Ceci suggère que, tandis que la résistance primaire de trastuzumab est répandue, résistance secondaire trastuzumab est inévitable. Pour cette raison, il est urgent de clarifier les mécanismes causant la résistance de la thérapie ciblée HER2 dans le cancer gastrique, qui est encore plus problématique compte tenu de l’hétérogénéité génétique intra-tumorale de cette néoplasie18.
En outre, les mécanismes de résistance au trastuzumab dans le cancer gastrique ont prouvé difficiles à expliquer, partiellement en raison de la difficulté à obtenir des représentant des modèles précliniques fiable de cette condition. Oshima et coll. ont signalé une méthode de sélection in vivo de lignées cellulaires de cancer de l’estomac résistant au trastuzumab, consistant en une culture répétée d’une petite métastase péritonéale résiduelle après traitement par trastuzumab19. Toutefois, la nécessité d’un meuble, de l’expertise de gestion animale spécifique et de l’approbation du Comité d’éthique de l’Animal ont contribué à ce qui en fait une méthode de beaucoup de temps et de coût. L’approche que nous décrivons dans ce travail est simple et largement applicable et pourrait être facilement étendu pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments dans différentes tumeurs histotypes20.

<table><tbody><tr><td>Le</td> réactif <td>Invitrogen 15596026</td><td></td><td>TRIzol est un réactif permettant d’isoler l’ARN total de haute qualité ou d’isoler simultanément l’ARN, l’ADN et les protéines d’une variété d’échantillons biologiques KIT DE</td></tr><tr><td>SYNTHÈSE D’ADNC ISCRIPT</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>Le kit de synthèse d’ADNc iScript est un kit de synthèse d’ADNc premier brin sensible et facile à utiliser pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel.</td></tr><tr><td>4331182</td><td>Les</td><td>tests d’expression génique TaqMan consistent en une paire d’amorces PCR non marquées et une sonde TaqMan avec un marqueur de colorant FAM ou VIC d’Applied Biosystems à l’extrémité 5' et un liant à rainure mineure (MGB) et un quencher non fluorescent (NFQ) à l’extrémité 3'.</td><td></td></tr><tr><td>Réactif d’extraction de protéines de mammifères M-PER</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Le réactif d’extraction de protéines de mammifères Thermo Scientific M-PER est conçu pour fournir une extraction très efficace des protéines solubles totales à partir de cellules de mammifères en culture.</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Halt (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase Thermo Scientific (100X) offre la commodité d’une solution unique avec une protection complète de l’échantillon de protéines pour les lysats cellulaires et tissulaires.</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Le kit de dosage des protéines Thermo Scientific Pierce BCA est un ensemble de réactifs de dosage à deux composants, de haute précision et compatible avec les détergents, permettant de mesurer la concentration totale en protéines (A562 nm) par rapport à un étalon protéique.</td></tr><tr><td>4x tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>Utilisez 4x tampon d’échantillon Laemmli pour la préparation des échantillons pour SDS PAGE. Pour réduire les échantillons, ajoutez un agent réducteur tel que le 2-mercaptoéthanol au tampon avant de mélanger avec l’échantillon.</td></tr><tr><td>4&ndash ; 20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels ont une nouvelle formulation et peuvent être utilisés à la fois pour les séparations de protéines dénaturantes standard ainsi que pour l’électrophorèse native.</td></tr><tr><td>Les étalons de transfert Precision Plus Protein WesternC</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained Standards sont disponibles en formats Dual Color, All Blue, Kaleidoscope et Dual Xtra. Tous les quatre ont les mêmes schémas de migration du gel, avec 3 bandes de référence de haute intensité (25, 50 et 75 kD).</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glycine/SDS est un tampon de coulée prémélangé pour la séparation d’échantillons de protéines par SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Packs de transfert en PVDF Trans-Blot Turbo Mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Packs de transfert en PVDF Trans-Blot Turbo Mini pour un transfert rapide et efficace des protéines à partir de mini-gels à l’aide du système de transfert Trans-Blot Turbo. Chaque pack de transfert sous vide et prêt à l’emploi contient deux piles de réservoirs d’ions saturés de tampon et une membrane PVDF pré-humidifiée.</td></tr><tr><td>Conjugué StrepTactin-HRP</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>conjugué StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) pour la détection chimiluminescente ou colorimétrique des étalons de protéines non colorées Precision Plus Protein ou des étalons de protéines WesternC Precision Plus Protein sur les transferts occidentaux.</td></tr><tr><td>La solution Immun-Star WesternC</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>La solution Immun-Star WesternC, une méthode de détection des protéines, détecte les quantités de protéines au milieu du femtogramme.</td></tr><tr><td></td><td>L’Invitrogen</td> 12935300 le<td></td> <td>siRNA à contrôle négatif universel n’a pas de similitude significative avec les séquences génétiques de souris, de rat ou d’homme. Le contrôle a également été testé dans des cribles cellulaires et il a été prouvé qu’il n’avait aucun effet significatif sur la prolifération, la viabilité ou la morphologie des cellules.</td></tr><tr><td>opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium est un milieu essentiel minimal (MEM) amélioré qui permet une réduction de la supplémentation en sérum de bovin fœtal d’au moins 50 % sans modification du taux de croissance ou de la morphologie.</td></tr><tr><td>Silencieux Select pré-conçu & L’interférence</td><td></td> ARN <td>4390824</td> (<td>ARNi) validée est le meilleur moyen de réduire efficacement l’expression génique pour étudier la fonction des protéines dans un large éventail de types de cellules.</td></tr><tr><td>Réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX offre une solution avancée et efficace pour l’administration de siRNA. Aucun autre réactif de transfection spécifique aux siARN ne permet une administration aussi facile et efficace des siRNA dans une grande variété de lignées cellulaires, y compris les types de cellules courants, les cellules souches et les cellules primaires, ainsi que les types de cellules traditionnellement difficiles à transfecter.</td></tr><tr><td>Souris anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>concentration de travail : 1:400 dans une solution de lait à 5 %</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG-HRP : sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Concentration de travail : 1:10000 dans une solution de lait à 5 %</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td><td>il s’agit d’un inhibiteur des protéases à sérine et de l’acétylcholinestérase</td></tr><tr><td>Thermocycleur pour RT-PCR</td><td>MJ Research</td><td>MJ Research Thermocycleur PTC-200</td><td>il permet une homogénéité de la température et une vitesse de montée en puissance allant jusqu’à 3&deg ; C/sec. Le protocole peut également être réalisé avec d’autres thermocycleurs</td></tr><tr><td>Instrument RT-PCR en temps réel</td> Système <td>RT-PCR 7500</td><td>d’Applied Biosystems</td><td>Il s’agit d’une plate-forme à cinq couleurs qui utilise des réactifs de réaction en chaîne par polymérase (PCR) basés sur la fluorescence pour fournir une quantification relative à l’aide d’un type de test comparatif CT. Le protocole peut également être réalisé avec d’autres thermocycleurs</td></tr><tr><td>Spectrophotomètres à microvolume</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>Il fournit une mesure précise et rapide des nucléides acides en utilisant un petit volume d’échantillon</td></tr><tr><td>Système de transfert</td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Il effectue un transfert sémy à sec en quelques minutes</td></tr><tr><td>Système d’acquisition d’images et documentation sur gel</td><td>Image Bio-Rad</td><td>Chemidoc Il</td><td>est facile à utiliser pour la détection par chimiluminescence</td></tr></tbody></table>

À la recherche de pilote pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Les deux dernières décennies ont vu un changement de médicaments cytotoxiques à une thérapie ciblée en oncologie médicale. Bien que les agents thérapeutiques ciblés ont montré une efficacité clinique plus impressionnante et réduit au minimum les effets négatifs que les traitements traditionnels, la résistance aux médicaments est devenu la principale limite à leurs prestations. Plusieurs modèles précliniques/in vitro/in vivo de la résistance acquise aux agents ciblés dans la pratique clinique ont été développés principalement à l’aide de deux stratégies : manipulation i) génétique pour la modélisation des génotypes de résistance acquise et ii) in vitro / in vivo sélection de modèles résistants. Dans le présent travail, nous proposons un cadre fédérateur, pour étudier les mécanismes sous-jacents responsables de la résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblés, à partir de la génération des sous-clones cellulaires résistantes aux médicaments, à la description de faire taire les procédures utilisées pour la restauration de la sensibilité à l’inhibiteur. Cette approche simple de temps - et rapport coût - entrée est largement applicable et pourrait être facilement étendue pour étudier les mécanismes de résistance aux autres médicaments ciblés dans différentes tumeurs histotypes.

La figure 1 donne un aperçu du cadre de la procédure expérimentale. Trois cancers gastriques lignées cellulaires exprimant un niveau élevé de HER2 et sensible au trastuzumab (IC50 &lt; concentration plasmatique maximale du graphe de gauche de médicament, Figure 2 a,) ont été cultivées dans un milieu de culture contenant l’agent thérapeutique ciblée. Une dose a 10 fois inférieure à la concentration plasmatique maximale ...

Il s’agit d’un protocole de temps - et rapport coût - entrée en vitro étudie les mécanismes de résistance acquise aux agents thérapeutiques ciblées, qui est un très besoin médical dans le traitement du cancer.

À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

L’objectif global de cette plateforme préclinique est de fournir une procédure standard pour identifier et caractériser les mécanismes à l’origine de la résistance acquise aux thérapies ciblées. Cette méthode peut aider à mettre en œuvre le guidage du génome en oncologie, en particulier, à répondre à des questions clés sur l’hétérogénéité tumorale et les multiples mécanismes responsables de la résistance acquise aux thérapies ciblées. Le principal avantage de cette technique est son approche rapide et rentable qui permet d’étudier in vitro les mécanismes de résistance à la thérapie ciblée.Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer, car la résistance pulmonaire reste un défi pour les thérapies ciblées émergentes. Cette méthode peut donner un aperçu du mécanisme impliqué dans la résistance aux thérapies ciblées, mais elle peut également être utilisée pour étudier l’efficacité des agents chimiothérapeutiques conventionnels. Généralement, les opérateurs qui utilisent cette méthode échelonnent avec une génération de sous-clones résistants aux médicaments, l’étape la plus difficile à normaliser.Nous avons d’abord conçu l’idée de cette méthode lorsque nous avons caractérisé le mécanisme de résistance acquise au trastuzumab dans les lignées cellulaires de cancer gastrique HER-positives. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car plusieurs techniques sont nécessaires pour la génération et la validation de modèles de résistance aux médicaments in vitro, y compris la restauration de la sensibilité par inhibition de gènes. Pour commencer cette procédure, ensemencez les cellules NCI N87 dans des flacons de culture de 25 centimètres carrés.Ajouter 10 microgrammes par millilitre de trastuzumab dans le milieu de culture dans chaque flacon. Exposez les cellules à cette dose de départ jusqu’à ce qu’elles reprennent leur croissance. Après la reprise de la croissance cellulaire dans environ deux semaines, exposez les cellules à une dose de 100 microgrammes par millilitre de trastuzumab.Continuez à augmenter progressivement la concentration de trastuzumab en attendant que les cellules reprennent leur croissance avant chaque exposition, jusqu’à ce qu’une concentration de 400 microgrammes par millilitre soit atteinte. Une lignée cellulaire peut présenter une sensibilité différente à différents médicaments. Une solution à ce problème consiste à exposer les cellules à des doses de médicament progressivement croissantes, à partir d’une dose environ dix fois supérieure à l’heure de la concentration plasmatique maximale jusqu’à ce que les cellules continuent de croître.Ensuite, ensemencez les cellules dans 24 plaques de culture multi-puits. Exposer les cellules ensemencées à des concentrations croissantes d’inhibiteurs du traitement cible de 100 microgrammes par millilitre à 400 microgrammes par millilitre. Incuber dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 15 jours.Après cela, retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 millilitres de PBS-1X. Retirez le PBS-1X et ajoutez-y entre deux et trois millilitres de solution de fixation. Après 20 minutes, retirez la solution de fixation et ajoutez deux millilitres de solution cristalline violette à 0,5 % dans chaque puits.Incuber à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la solution de cristal violet. Plongez les plaques dans l’eau du robinet pour rincer les résidus restants.Sécher à l’air libre à température ambiante jusqu’à deux jours. Ensuite, utilisez un microscope inversé à un grossissement de 4X pour compter les colonies contenant plus de 50 cellules. Calculez le rapport de résistance relative IC50 comme indiqué dans le protocole de texte.Pour commencer, préparez une suspension unicellulaire par trypsinisation comme indiqué dans le protocole texte. À l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan, comptez les cellules. Ensuite, ensemencez 2,5 fois 10 cellules contre cinq dans un flacon T-25 pour chaque condition.Ensuite, diluez 12,5 microlitres de chaque oligonucléotide siRNA ciblant le gène ou oligonucléotide siRNA de contrôle négatif dans un milieu de transfection essentiel minimal. Ajouter un réactif de transfection de liposomes cationiques dans un rapport de 1:1 avec les oligonucléotides. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.Après cela, ajoutez 700 microlitres du mélange de transfection dans chaque fiole T-25. Incuber à 37 degrés Celsius pendant un à trois jours. Utilisez la RT-PCR et l’analyse par Western Blot pour vérifier l’inactivation du gène.Ensuite, ensemencez les cellules dans 24 plaques de culture multi-puits. Exposer les cellules à des concentrations croissantes d’inhibiteur du traitement cible de 100 microgrammes par millilitre à 400 microgrammes par millilitre. Pour l’efficacité de l’inactivation génique, les oligonucléotides de siRNA doivent être spécifiques pour réduire l’expression cible.Les outils conçus et la mesure de l’ARNi était le même gène cible sont utiles à cette fin. Incuber dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 15 jours. Retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 millilitres de PBS-1X.Après avoir retiré le PBS, ajoutez deux à trois millilitres de solution de fixation. Ensuite, retirez la solution de fixation et ajoutez 0,5 % de solution de violet cristallin. Incuber à température ambiante pendant deux heures.À l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la solution de cristal violet. Ensuite, plongez les plaques dans l’eau du robinet. Sécher à l’air libre à température ambiante jusqu’à deux jours.Après cela, utilisez un microscope inversé à un grossissement de 4X pour compter les colonies contenant plus de 50 cellules. Dans cette étude, trois lignées cellulaires de cancer gastrique qui expriment un niveau élevé de HER2 et qui sont sensibles au trastuzumab sont cultivées dans un milieu de culture contenant les agents thérapeutiques ciblés. À partir de là, trois sous-clones caractérisés par un phénotype résistant stable sont obtenus.Parmi les sous-clones, HR NCI N87 est considéré comme le plus résistant, atteignant une résistance relative IC50 de 28,57. L’analyse de l’expression des protéines et des gènes soutient l’hypothèse selon laquelle le gène IQGAP1 joue un rôle central dans le phénotype de résistance de la sous-lignée HR NCI N87. Comme le montre ici, le niveau de protéine IQGAP1 est cinq fois plus élevé dans le sous-clone résistant que dans les cellules parentales.Et l’expression du gène IQGAP1 est 2,5 fois plus élevée dans la sous-lignée HR NCI N87 que dans le sous-clone d’origine. Le silençage du gène IQGAP1 est ensuite effectué pour évaluer son rôle dans le développement du phénotype de résistance au trastuzumab. Un test clonogénique confirme l’hypothèse de l’importance d’IQGAP.Comme on le voit ici, le silençage génique restaure la sensibilité de la cellule au trastuzumab, abaissant la valeur IC50 à sept microgrammes par millilitre. Ce que je pense de cette procédure est important de garder à l’esprit qu’il n’est généralement pas facile d’obtenir des sous-clones de cellules résistantes aux médicaments. Et que cette méthode comporte un risque potentiel d’échec.Grâce à cette procédure, il est possible d’obtenir plusieurs cellules de clones caractérisées par différents mécanismes à l’origine de la résistance acquise aux thérapies ciblées. L’élaboration d’une procédure standard pour la modélisation in vitro de la résistance aux traitements cibles devrait permettre à un chercheur en oncologie d’étudier une nouvelle cible médicamenteuse pour surmonter la résistance aux médicaments, ce qui constitue la plus grande critique des thérapies de dernière génération.

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À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

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