À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

L’objectif global de cette plateforme préclinique est de fournir une procédure standard pour identifier et caractériser les mécanismes à l’origine de la résistance acquise aux thérapies ciblées. Cette méthode peut aider à mettre en œuvre le guidage du génome en oncologie, en particulier, à répondre à des questions clés sur l’hétérogénéité tumorale et les multiples mécanismes responsables de la résistance acquise aux thérapies ciblées. Le principal avantage de cette technique est son approche rapide et rentable qui permet d’étudier in vitro les mécanismes de résistance à la thérapie ciblée.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer, car la résistance pulmonaire reste un défi pour les thérapies ciblées émergentes. Cette méthode peut donner un aperçu du mécanisme impliqué dans la résistance aux thérapies ciblées, mais elle peut également être utilisée pour étudier l’efficacité des agents chimiothérapeutiques conventionnels. Généralement, les opérateurs qui utilisent cette méthode échelonnent avec une génération de sous-clones résistants aux médicaments, l’étape la plus difficile à normaliser.

Nous avons d’abord conçu l’idée de cette méthode lorsque nous avons caractérisé le mécanisme de résistance acquise au trastuzumab dans les lignées cellulaires de cancer gastrique HER-positives. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car plusieurs techniques sont nécessaires pour la génération et la validation de modèles de résistance aux médicaments in vitro, y compris la restauration de la sensibilité par inhibition de gènes. Pour commencer cette procédure, ensemencez les cellules NCI N87 dans des flacons de culture de 25 centimètres carrés.

Ajouter 10 microgrammes par millilitre de trastuzumab dans le milieu de culture dans chaque flacon. Exposez les cellules à cette dose de départ jusqu’à ce qu’elles reprennent leur croissance. Après la reprise de la croissance cellulaire dans environ deux semaines, exposez les cellules à une dose de 100 microgrammes par millilitre de trastuzumab.

Continuez à augmenter progressivement la concentration de trastuzumab en attendant que les cellules reprennent leur croissance avant chaque exposition, jusqu’à ce qu’une concentration de 400 microgrammes par millilitre soit atteinte. Une lignée cellulaire peut présenter une sensibilité différente à différents médicaments. Une solution à ce problème consiste à exposer les cellules à des doses de médicament progressivement croissantes, à partir d’une dose environ dix fois supérieure à l’heure de la concentration plasmatique maximale jusqu’à ce que les cellules continuent de croître.

Ensuite, ensemencez les cellules dans 24 plaques de culture multi-puits. Exposer les cellules ensemencées à des concentrations croissantes d’inhibiteurs du traitement cible de 100 microgrammes par millilitre à 400 microgrammes par millilitre. Incuber dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 15 jours.

Après cela, retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 millilitres de PBS-1X. Retirez le PBS-1X et ajoutez-y entre deux et trois millilitres de solution de fixation. Après 20 minutes, retirez la solution de fixation et ajoutez deux millilitres de solution cristalline violette à 0,5 % dans chaque puits.

Incuber à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la solution de cristal violet. Plongez les plaques dans l’eau du robinet pour rincer les résidus restants.

Sécher à l’air libre à température ambiante jusqu’à deux jours. Ensuite, utilisez un microscope inversé à un grossissement de 4X pour compter les colonies contenant plus de 50 cellules. Calculez le rapport de résistance relative IC50 comme indiqué dans le protocole de texte.

Pour commencer, préparez une suspension unicellulaire par trypsinisation comme indiqué dans le protocole texte. À l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan, comptez les cellules. Ensuite, ensemencez 2,5 fois 10 cellules contre cinq dans un flacon T-25 pour chaque condition.

Ensuite, diluez 12,5 microlitres de chaque oligonucléotide siRNA ciblant le gène ou oligonucléotide siRNA de contrôle négatif dans un milieu de transfection essentiel minimal. Ajouter un réactif de transfection de liposomes cationiques dans un rapport de 1:1 avec les oligonucléotides. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.

Après cela, ajoutez 700 microlitres du mélange de transfection dans chaque fiole T-25. Incuber à 37 degrés Celsius pendant un à trois jours. Utilisez la RT-PCR et l’analyse par Western Blot pour vérifier l’inactivation du gène.

Ensuite, ensemencez les cellules dans 24 plaques de culture multi-puits. Exposer les cellules à des concentrations croissantes d’inhibiteur du traitement cible de 100 microgrammes par millilitre à 400 microgrammes par millilitre. Pour l’efficacité de l’inactivation génique, les oligonucléotides de siRNA doivent être spécifiques pour réduire l’expression cible.

Les outils conçus et la mesure de l’ARNi était le même gène cible sont utiles à cette fin. Incuber dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 15 jours. Retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 millilitres de PBS-1X.

Après avoir retiré le PBS, ajoutez deux à trois millilitres de solution de fixation. Ensuite, retirez la solution de fixation et ajoutez 0,5 % de solution de violet cristallin. Incuber à température ambiante pendant deux heures.

À l’aide d’une pipette, aspirez soigneusement la solution de cristal violet. Ensuite, plongez les plaques dans l’eau du robinet. Sécher à l’air libre à température ambiante jusqu’à deux jours.

Après cela, utilisez un microscope inversé à un grossissement de 4X pour compter les colonies contenant plus de 50 cellules. Dans cette étude, trois lignées cellulaires de cancer gastrique qui expriment un niveau élevé de HER2 et qui sont sensibles au trastuzumab sont cultivées dans un milieu de culture contenant les agents thérapeutiques ciblés. À partir de là, trois sous-clones caractérisés par un phénotype résistant stable sont obtenus.

Parmi les sous-clones, HR NCI N87 est considéré comme le plus résistant, atteignant une résistance relative IC50 de 28,57. L’analyse de l’expression des protéines et des gènes soutient l’hypothèse selon laquelle le gène IQGAP1 joue un rôle central dans le phénotype de résistance de la sous-lignée HR NCI N87. Comme le montre ici, le niveau de protéine IQGAP1 est cinq fois plus élevé dans le sous-clone résistant que dans les cellules parentales.

Et l’expression du gène IQGAP1 est 2,5 fois plus élevée dans la sous-lignée HR NCI N87 que dans le sous-clone d’origine. Le silençage du gène IQGAP1 est ensuite effectué pour évaluer son rôle dans le développement du phénotype de résistance au trastuzumab. Un test clonogénique confirme l’hypothèse de l’importance d’IQGAP.

Comme on le voit ici, le silençage génique restaure la sensibilité de la cellule au trastuzumab, abaissant la valeur IC50 à sept microgrammes par millilitre. Ce que je pense de cette procédure est important de garder à l’esprit qu’il n’est généralement pas facile d’obtenir des sous-clones de cellules résistantes aux médicaments. Et que cette méthode comporte un risque potentiel d’échec.

Grâce à cette procédure, il est possible d’obtenir plusieurs cellules de clones caractérisées par différents mécanismes à l’origine de la résistance acquise aux thérapies ciblées. L’élaboration d’une procédure standard pour la modélisation in vitro de la résistance aux traitements cibles devrait permettre à un chercheur en oncologie d’étudier une nouvelle cible médicamenteuse pour surmonter la résistance aux médicaments, ce qui constitue la plus grande critique des thérapies de dernière génération.