Name: Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Découvrez le développement d'un biocapteur ADN électrochimique pour détecter Vibrio parahaemolyticus en utilisant des nanoparticules d'or stabilisées par acide polylactique. Cette méthode améliore la sensibilité et la rapidité de détection des pathogènes alimentaires.

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Les auteurs tiennent à souligner l’appui de l’Universiti Putra Malaysia.

Remarque : Tous les réactifs chimiques et biochimiques à utiliser doivent être de qualité analytique et utilisés sans davantage de purification. Préparer toutes les solutions à l’aide de l’eau désionisée stérile. Autoclave toute la verrerie avant la stérilisation.
ATTENTION : S’il vous plaît utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des activités de laboratoire, y compris l’utilisation de contrôles (hotte aspirante, boîte à gants) d’ingénierie et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse, pantalons pleine longueur, fermé-orteil chaussures).
1. fabrication et caractérisation d’électrode modifiée à l’aide de PLA-AuNPs
<ol><li>
Préparation et caractérisation des PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Rapidement, ajouter 10 mL de solution de citrate de sodium (38,8 mM) à 100 mL de solution d’acide chloraurique aqueuse (1 mM) de bouillante et refroidir jusqu'à température ambiante. Observer les changements dans la couleur de la solution préparée de AuNPs qui commence comme jaune, changements à noirâtre et enfin se termine comme rouge rubis foncé.</li>
		<li>Placer les boulettes PLA dans un moule en acier inoxydable pour le processus de fusion et les réchauffer à une température de 190 ° C pendant 10 min. Suivez la procédure de pressage : mettez-les sous une pression de 2,2 MPa pendant 1 min dans le cadre de la préparation de feuille PLA. La feuille PLA sera prête à l’emploi après refroidissement pendant environ 3 h.</li>
		<li>En remuant vigoureusement, dissoudre 0,68 mg des feuilles PLA dans 5 mL de chloroforme à température ambiante. Mélanger le PLA dissous avec 10 mL de la solution de AuNPs préalablement préparée et remuez de façon homogène à la température ambiante. Les mélanges homogènes peuvent alors être notés comme PLA-AuNPs et caractérisent par UV-Vis, XRD, TEM et FESEM avec EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation et caractérisation des électrodes de carbone sérigraphié mis à jour le Remarque : La SPCE utilisée dans cette étude comprend un système de trois électrodes : une électrode de référence Ag/AgCl, une électrode de travail carbone et une contre-électrode.<ol>
<li>Prélever 25 µL de la solution homogène de PLA-AuNPs sur la SPCE et puis l’air de sécher rapidement il pendant 24 h avant son utilisation.</li>
		<li>Électrochimiquement caractérisent les électrodes modifiées, SPCE/PLA-AuNPs, dans le cyanure de potassium ferro (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) pour mesurer la superficie active, spectroscopie d’impédance électrochimique, répétabilité, reproductibilité et30de la stabilité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mise au point des biocapteurs électrochimiques ADN
<ol><li>
Préparation de la sonde Remarque : Les séquences de l’ADN simple brin sonde et ADN complémentaire ont été choisis selon les renseignements fournis par le National Center for database Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Acheter des oligonucléotides synthétiques (sonde ADN simple brin 20-mer, 20-mer ADN complémentaire, 20-mer mismatched ADN et ADN non-complémentaire 21-mer) sous forme de poudre lyophilisée de laboratoires commerciaux, basée sur les séquences suivantes : sonde d’ADN simple brin THIOLÉS : 5′ - / D/5ThioMC6-CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′ l’ADN complémentaire : 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′ une base ADN ne correspondent pas : 5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′ trois-base ADN ne correspondent pas : 5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′ ADN non-complémentaire : 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′</li>
		<li>Préparer les solutions de tous les oligonucléotides (100 µM) en utilisant une solution stérile de TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), divisée en sections analytiques. Gardez cela à-4 ° C et puis faire des dilutions appropriées juste avant leur utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimisation de l’immobilisation et l’hybridation Remarque : Un SPCE modifié avec PLA-AuNPs, dénoté comme SPCE/PLA-AuNPs, a été utilisé pour cette étude et un procédé de coulage de chute a été utilisée pour l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation.<ol>
<li>Tout d’abord, immobiliser 25 µL de sonde ADN simple brin THIOLÉS sur la SPCE/PLA-AuNPs et air sécher pendant 24 h à température ambiante, après quoi il sera finalement établie comme SPCE/PLA-AuNPs/ADN simple brin. Déterminer l’optimisation de la condition de l’immobilisation à l’aide de trois facteurs : la concentration d’ADN simple brin (allant de 0,2 à 1,4 µM), temps (allant de 30 à 210 min) et la température (variant de 25 à 75 ° C).</li>
		<li>Pipetter 25 µL de l’ADN complémentaire sur la surface de SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA pour réaliser l’événement de l’hybridation, après quoi il peut être finalement désigné comme SPCE/PLA-AuNPs/ADN double brin. Déterminer l’optimisation de la condition de l’hybridation via les deux facteurs de température (variant de 25 à 75 ° C) et la durée (allant de 5 à 30 min).</li>
		<li>Immerger l’immobilisée et électrodes hybrides à 20 µM MB pendant 30 min. enlever l’ADN non spécifiquement adsorbée et excès MB en lavant avec 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), puis rincer avec l’eau désionisée. Mesure du courant de crête de taux de réduction à l’aide de la technique de la DPV. Exécuter la mesure de DPV aide PBS à 0,1 M (pH 7) ne contenant aucun indicateur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caractérisation du biocapteur ADN préfabriqué
	<ol>
<li>Immerger la SPCE/PLA-AuNPs à 20 µM MB pendant 30 min, laver avec 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) et ensuite rincer à l’eau désionisée avant de mesurer. Suivre une procédure similaire pour toutes les interactions, y compris la sonde ADN, ADN complémentaire, ADN ne correspondent pas et des échantillons d’ADN non complémentaires.</li>
		<li>Mesurer la réduction électrochimique. NOTE : Nous avons mesuré la DPV utilisant un Autolab fabriqué commercialement avec le logiciel d’interface. Les mesures de DPV la réduction électrochimique MB effectué à un potentiel allant de -0,5 V à 0,25 V, avec une étape potentielle de 0,005 V, modulation d’amplitude de 0,05 V et une vitesse de balayage de 7,73 mVs-1 dans du PBS 0,1 M (pH 7), ne contenant aucun indicateur. La sélectivité, la sensibilité, reproductibilité et thermostabilité du biocapteur ADN fabriqué ont été ré-examinées. Résultats rapportés ont été présentés comme moyenne des mesures de valeur en trois répétitions.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. valider le biocapteur ADN fabriquée à l’aide des échantillons réels
<ol><li>Préparation des souches bactériennes
	<ol>
<li>Prélever des échantillons bactériens basés sur leur contamination importante de fruits de mer31,32 . NOTE : V. parahaemolyticus comme des souches de référence et 8 autres souches bactériennes (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, entérite à Salmonella, pneumonie à Klebsiella de Escherichia coli O157 : H7, Bacillus cereuset Vibrio alginolyticus) de la commune d’origine alimentaire pathogène ont été employés pour la validation de biocapteurs électrochimique ADN dans cette étude.</li>
		<li>Mener une sous-culture systématique des souches bactériennes sur leur agar respectif toutes les deux semaines à maintenir leur viabilité, veuillez consulter le tableau 1 pour les conditions de culture.</li>
		<li>Maintenir la préservation à long terme des souches bactériennes dans leurs respectifs bouillons croissants contenant 20 % (v/v) de glycérol à-80 ° C comme le glycérol protège des bactéries en empêchant la formation de cristaux de glace qui peut les abîmer pendant le processus de congélation. Ensuite, une boucle de la culture de cellule bactérienne préservé dans les stocks de glycérol ensemencer les bouillons respectifs. Incuber les bouillons selon leur croissance respective le temps et la température lorsque nécessitant de faire revivre les bactéries.</li>
		<li>Déterminer la quantité de V. parahaemolyticus les cellules à l’aide d’une propagation plaque technique33, une norme et une méthode bien connue pour la numération des microorganismes dérivés d’une série de dilutions.<ol>
<li>La culture V. parahaemolyticus dans un bouillon Trypticase soja (TSB + 3 % NaCl) à 37 ° C dans un état d’agitation 140 tr/min. Ensuite, transférer 1 mL de la culture cellulaire de bactéries dans 9 mL de TSB + 3 % NaCl pour obtenir un facteur de dilution 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Répétez cette étape neuf fois pour obtenir une série complète de facteur de dilution de 10-10 . Répandre ensuite, 0,1 mL de chaque facteur de dilution (à partir de 10-1 à 10-10) sur gélose sélective d’un Vibrio pour colonie comptant, respectivement. Incuber les plaques incubés à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Utiliser un compteur de colonies pour dénombrer les colonies individuelles et dos-Calculez (comte le montant CFU/éjectant x facteur de dilution) pour obtenir une unité formant colonie par millilitre densité (CFU mL-1). Calculer la concentration de la colonie formant des unités (UFC) dans les suspensions cellulaires de bactéries de la parcelle de calibrage de CFU mL-1 contre l’absorbance.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la PCR
	<ol>
<li>Extraire l’ADN génomique suite a mis à jour le bouilli lyse procédure34. Tout d’abord, strie un bactériennes individuelles souche sur milieux gélosés et il inoculer en bouillons, suivie de l’incubation à sa condition de croissance relative, un 140 tr/mn, secouant la condition.</li>
		<li>Pipeter une culture 1 mL de bouillon dans un tube à centrifuger micro. Cela centrifuger à 4830 x g et 4 ° C pendant 1 min obtenir des boulettes. Utiliser environ 500 µL de tampon TE stérile pour la remise en suspension avec le culot. Tenir la suspension qui en résulte pendant 10 min à 98 ± 2 ° C dans un bloc chauffant et le refroidir immédiatement à-18 ° C pendant 10 min lyser les cellules et de libérer l’ADN.</li>
		<li>Centrifuger l’ADN génomique à 4830 x g et 4 ° C pendant 3 min obtenir une suspension claire et garder le liquide surnageant à-20 ° C pour une utilisation ultérieure. Utiliser une mesure de biophotometer avec l’absorption UV à une longueur d’onde de 260 nm (comme les acides nucléiques absorption de longueur d’onde de la lumière) et aussi à une longueur d’onde de 280 nm (comme les protéines, absorption de longueur d’onde de la lumière) pour déterminer la concentration et la pureté de l’extrait l’ADN génomique puis identifiez toutes les souches à l’aide des épreuves biochimiques standard35 et leur vérification par 16 s rRNA gene séquençage36. Enfin, dénaturer l’ADN génomique à 92 ° C pendant 2 minutes et refroidir rapidement dans l’eau glacée avant l’application sur le biocapteur.</li>
		<li>Confirmer la présence de V. parahaemolyticus par PCR pour cibler le gène toxR. Exécutez cette procédure dans un thermocycleur à l’aide d’une paire d’amorces (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' et 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimiser l’amplification par PCR dans un volume de réaction totale de 25 µL consistant en eau stérile (15,5 µL), tampon (5 µL), primer (1 µL, 10 µM), Mélange dNTP (1 µL), matrice d’ADN (2 µL) et l’ADN polymérase Taq (0.2 µL, 10 x).</li>
		<li>Bien mélanger les composants et organiser l’amplification par PCR de la séquence cible dans un thermocycleur programmé pour 30 cycles d’amplification. Dans notre étude, chaque cycle consistant en trois étapes des réactions, c’est à dire., dénaturation initiale (94 ° C, 3 min) suivie de 30 cycles de dénaturation (94 ° C, 1 min), recuit (63 ° C, 1,5 min) et extension (72 ° C, 1,5 min), suivi d’une extension finale (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Déterminer les produits amplifiés et leurs tailles par électrophorèse sur gel d’agarose de 1,5 %. Capturer les images de gel avec un système de gel-documentation disponible dans le commerce.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des échantillons de cockle
	<ol>
<li>Obtenir des échantillons frais. NOTE : Nos coques fraîches (Anadara granosa) ont été obtenus à partir du marché humide dans Serdang, Selangor et apportés rapidement au laboratoire dans une boîte de refroidisseur de glace pour analyse. Diviser les échantillons en 2 groupes, à savoir le groupe traité et non-traités, en supposant que les coques ont été récoltés uniformément dès le début de la récolte jusqu'à ce que vous les placez dans l’entreposage au froid.</li>
		<li>Traiter les coques dans le groupe traité en les stockant à-20 ° C pendant 24 h, suivie d’une exposition aux rayons ultraviolets à 20 ° C pendant 4 h avant l’extraction de l’ADN. Remarque : La température de congélation et l’exposition aux ultraviolets utilisés pour les contrôlés groupe tue ou au moins limite l’accumulation naturellement V. parahaemolyticus dans les coques. Ne pas appliquer un régime supérieur de pasteurisation de 70 ° C car la condition contrôlée dans la présente étude vise à imiter la réalité des coques fraîches. Pendant ce temps, analyser des échantillons prélevés directement dans le groupe non traité sans aucun traitement préalable dès qu’ils arrivent au laboratoire.</li>
		<li>Repiquer une souche de V. parahaemolyticus ATCC 17802 au BST (3 % NaCl). Déterminer le niveau de cellules viables dans l’inoculum par électrodéposition des dilutions appropriées du BST (3 % NaCl) sur autorité de certification afin d’obtenir un inoculum de 10 mL UFC4 -1 de V. parahaemolyticus. Lavez chaque coque dans l’eau distillée et frottez-le pas d’impuretés avant d’utiliser une pince stérile dans une enceinte à flux laminaire pour enlever les tissus de la coquille.</li>
		<li>Homogénéiser les environ 10 g d’échantillons de tissus de cockle avec un homogénéisateur 90 ml de TSB stérile (3 % NaCl) pendant 60 s. Ajouter une quantité connue de V. parahaemolyticus dans 9 mL de bouillon échantillon homogénéisé pour les échantillons enrichis. Utilisez les échantillons enrichit comme témoin négatif. Estimer le nombre de cellules de V. parahaemolyticus dopés sur les échantillons de cockle par l’ensemencement de 0,1 mL des échantillons sur CA, et par la suite, pipette 1 mL d’échantillons dans un tube de microcentrifuge ADN goûter l’extraction, à utiliser dans le biocapteur et test de PCR.</li>
		<li>Extraire l’ADN génomique de la V. parahaemolyticus dans les échantillons enrichis et enrichit suite à une modification de bouillie lyse procédure36. Enfin, déterminer la concentration d’ADN et de la pureté à l’aide d’une mesure de photomètre bio avec absorption UV à une longueur d’onde de 260 nm (comme les acides nucléiques absorption de longueur d’onde de la lumière) et aussi à une longueur d’onde de 280 nm (comme les protéines, absorption de longueur d’onde de la lumière).</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes essentielles dans un cadre de mise au point de ce type de biocapteurs électrochimiques sont le choix des éléments de reconnaissance biologique approprié pour le transducteur (acide nucléique ou ADN ici) ; approche chimique pour la construction de la couche sensible du capteur ; matériel de transduction ; optimisation de l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation ; et la validation de la biocapteur développé en utilisant des échantillons réels.
De base de la réussite d’un biocapteur ...

Un important sujet de débat public et scientifique au cours des dernières années, l’intoxication alimentaire est principalement associée à 3 principes : microorganismes1, produits chimiques2et parasites3. Des aliments contaminés peuvent provoquer des conséquences graves pour la santé chez les humains, en particulier dans le groupe à risque plus élevé de ceux qui ont un système immunitaire faible, les personnes âgées, les femmes enceintes, bébés et jeunes enfants4. Avec plus de 1 million de cas de diarrhée aiguë survenant chaque année chez les enfants âgés de moins de 5 ans en Afrique, Asie et Amérique latine, l’intoxication alimentaire est une maladie mondiale majeure5,6 , et l’Organisation mondiale de la santé a mis en place microorganismes comme le plus important contributeur7. Vibrio parahaemolyticus se distingue parmi les souches virulentes les plus largement reconnues. Trouve généralement dans des environnements côtiers, estuariens et marins8, c’est une bactérie Gram-négative, qui devenue actif dans des environnements de sels élevées et provoque sérieuse gastro-entérite humaine lorsqu’ils sont consommés dans les marines mal cuit, mal ou cru produits9. En outre, les conditions médicales préexistantes chez certaines personnes rendent sujette à une infection, septicémie ou oreille infection résultant de V. parahaemolyticus10des plaies. Les facteurs de virulence de V. parahaemolyticus hémolysines sont divisés en deux types qui contribuent à la pathogenèse de la maladie : hémolysine directe thermostable (TDH) codées par des gènes de tdh et hémolysine TDH liées codées par des gènes de trh11. Les marqueurs de virulence (gènes tdh et trh) de V. parahaemolyticus sont surtout présents dans les échantillons cliniques plutôt que dans des échantillons environnementaux.
V. parahaemolyticus possède la capacité de survivre dans un large éventail de conditions, répondre rapidement aux changements environnementaux12. Son mécanisme de prolifération s’intensifie son potentiel de danger que sa toxicité augmente en parallèle avec la cellule masse13. Pire encore, le changement climatique offre ces bactéries avec des conditions suffisamment pour accélérer leur de croissance de population de cellule14. En raison de sa haute fréquence, V. parahaemolyticus doit être surveillée le long de la chaîne d’approvisionnement alimentaire, en particulier dans le commerce et la production de fruits de mer étant donné que ces produits sont où ils se trouvent en quantités énormes15,16 dans le monde entier. Actuellement, les bactéries sont identifiés et isolés à l’aide d’un éventail de méthodes, y compris les tests biochimiques, enrichissement et milieux sélectifs17, immunomagnetic-enzymatique sorbant assay (ELISA)18, électrophorèse en champ pulse (PFGE) 19, tests d’agglutination au latex et polymerase chain reaction (PCR) essais20. Ces méthodes exigent habituellement un personnel qualifié, des instruments sophistiqués et techniques laborieuses qui ne fournissent pas d’informations sur la contamination immédiatement. Cela limite fortement la probabilité de détecter promptement contamination nocive et applications sur place. Outils de détection rapide demeurent un défi exceptionnel.
Biodétection s’impose comme une solution prometteuse pour la détection des pathogènes d’origine alimentaire car il offre un gain de temps, économique, pratique et en temps réel analyse méthode21,22,23,24 . Cependant, bien qu’il y a eu de nombreux résultats positifs de l’analyte détection dans des échantillons enrichis et solution standard à l’aide de biocapteurs, il subsiste un manque de recherche appliquée à des échantillons réels dans des mélanges aqueux ou extraits organiques25. Récemment, des biocapteurs électrochimiques utilisant une détection directe et/ou indirecte l’acide désoxyribonucléique (ADN) ont reçu une attention accrue parmi les scientifiques, en raison de leur détection spécifique de la cible complémentaire via une hybridation événement26 , 27 , 28 , 29. ces approches uniques sont plus stables en comparaison de biocapteurs à base d’enzymes, offrant ainsi une technologie prometteuse pour la miniaturisation et de la commercialisation. L’objectif de l’étude ont signalé ici est de construire un outil rapide pouvant détecter V. parahaemolyticus avec haute sélectivité, la sensibilité et praticité, basée sur la spécificité de séquence d’ADN au cours de l’hybridation. Les stratégies d’identification impliquent la combinaison de polylactique acide-stabilisé nanoparticules d’or (PLA-AuNPs)30 et électrodes en carbone sérigraphié (SPCEs) en présence de l’indicateur de l’hybridation, le bleu de méthylène (MB). Le potentiel de la construction de détection avancés est approfondi en utilisant des échantillons de bactéries ADN cockle lysat et fraîche.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane acide tétraacétique</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’or (III) trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>monohydraté Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Résine poly(acide lactique), qualité commerciale 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate de potassium III</td><td>R& M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium sel anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Citrate trisodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl) aminométhane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix avec Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Gel d’agarose</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Éosine bleu de méthylène agar&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement 100 pb Échelle d’ADN</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement 1kb Échelle d’ADN</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol jaune d’oeuf gélose polymyxine</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td> Bouillon nutritif Merck 105443 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Bouillon de soja</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

développement d’un biocapteur électrochimique adn pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) est un pathogène d’origine alimentaire commune qui contribue à une grande partie des problèmes de santé publique dans le monde, affectant de manière notable le taux de morbidité et de mortalité humaine. Les méthodes conventionnelles pour la détection de V. parahaemolyticus tels que les méthodes axées sur la culture, tests immunologiques et moléculaires des méthodes nécessitent la manipulation des échantillons complexes et sont long, fastidieux et coûteux. Récemment, les biocapteurs ont prouvé être une méthode de détection prometteurs et complet avec les avantages d’une détection rapide, coût-efficacité et praticité. Cette recherche porte sur l’élaboration d’une méthode rapide de détection V. parahaemolyticus avec une sélectivité élevée et une sensibilité en utilisant les principes de l’hybridation de l’ADN. Dans le travail, caractérisation des nanoparticules or des stabilisés acide polylactique synthétisés (PLA-AuNPs) a été réalisée à l’aide de la Diffraction des rayons x (DRX), spectroscopie Ultraviolet-visible (UV-Vis), microscopie électronique à Transmission (TEM), émission de champ Microscopie électronique à balayage (FESEM) et la voltampérométrie cyclique (CV). Nous avons effectué également nouveaux essais de stabilité, la sensibilité et la reproductibilité de la PLA-AuNPs. Nous avons trouvé que le PLA-AuNPs forment une structure solide de nanoparticules stabilisées en solution aqueuse. Nous avons également observé que la sensibilité améliorée grâce à la plus petite valeur de la résistance (Rct) transfert de charge et une augmentation de la surface active (0,41 cm2). Le développement de notre biocapteur ADN reposait sur la modification d’une électrode de carbone sérigraphié (SPCE) avec PLA-AuNPs et à l’aide de bleu de méthylène (MB) comme indicateur rédox. Nous avons évalué les événements de l’immobilisation et l’hybridation par voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV). Nous avons constaté que complémentaires, non complémentaires et oligonucléotides dépareillées étaient particulièrement distingués par le biocapteur fabriqué. Elle a également montré fiable de sensibilité de détection dans les études de réactivité croisée contre divers pathogènes d’origine alimentaire et dans l’identification de V. parahaemolyticus dans les coques fraîches.

Formation de AuNPs a été révélée par le changement de couleur de la solution aqueuse avec du citrate de sodium présent. Cela a provoqué la couleur changer du jaune clair au rouge rubis profond. La génération de PLA-AuNPs a été confirmée dans les spectres UV-vis (Figure 1) où la croissance du pic surface plasmon resonance (SPR) a été trouvée à environ 540 nm. La formation et l’existence de PLA-AuNPs a été indiqué aux gammes de longueur d’onde 500-600 nm, selon...

Un protocole pour le développement d’un Biocapteur électrochimique d’ADN comportant une électrode de carbone acide-stabilisé, or de nanoparticules modifiés, sérigraphié de polylactique pour détecter les Vibrio parahaemolyticus est présenté.

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Les agents pathogènes d’origine alimentaire contribuent à une grande partie des problèmes de santé publique à l’échelle mondiale, ce qui affecte considérablement le taux de mortalité et de morbidité humaines. Les méthodes conventionnelles de détection des agents pathogènes d’origine alimentaire nécessitent une manipulation compliquée des échantillons et prennent du temps. Récemment, les biocapteurs se sont avérés être une méthode de détection prometteuse et complète avec les avantages d’une détection rapide et pratique.Le développement de biocapteurs est basé sur une électrode modifiée avec des nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. L’électrode de carbone sérigraphiée a été modifiée pour augmenter la surface active de l’électrode de travail. Le bleu de méthylène utilisé comme complexe redox a une liaison forte avec l’ADN simple brin de l’ADN de sonde immobilisé.Cette relation de haute valeur représentée par un courant de crête élevé. L’hybridation de l’ADN simple brin avec sa séquence complémentaire remplace les molécules de bleu de méthylène liées, ce qui réduit le courant de la voltampérométrie différentielle d’impulsion. Cela peut être dû à une plus petite quantité de bleu de méthylène accumulée à la surface d’une électrode modifiée avec de l’ADN double brin complémentaire, qui a été causée par une interaction inaccessible entre les bases de guanine.La couleur des solutions préparées change en passant du jaune au noirâtre et enfin au rouge rubis foncé. Cela indique que le sel d’or a été réduit par les ions citrate. L’acide polylactique dissous a été mélangé à la solution de nanoparticules d’or préalablement préparée, puis agité de manière homogène à température ambiante, ce qui a ensuite été désigné comme des nanoparticules d’or stabilisées par de l’acide polylactique.La spectroscopie visible ultraviolette, la diffraction des rayons X, la microscopie électronique à transmission et la microscopie électronique à balayage à émission de champ avec spectrométrie à rayons X à dispersion d’énergie ont été utilisées pour caractériser les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. Environ 25 microlitres de la solution homogène de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été rapidement pipetés sur l’électrode de carbone sérigraphiée et séchés à l’air pendant 24 heures avant d’être utilisés. Les électrodes modifiées ont ensuite été caractérisées électrochimiquement dans du ferrocyanure de potassium pour mesurer la surface active, la spectroscopie d’impédance électrochimique, la répétabilité, la reproductibilité et la stabilité.L’optimisation de la condition d’immobilisation a été déterminée à l’aide de trois facteurs, la concentration d’ADN simple brin allant de 0,2 à 1,4 micromolaire, le temps allant de 30 à 220 minutes et la température allant de 25 à 75 degrés Celsius. D’autre part, l’optimisation des conditions d’hybridation a été déterminée par deux facteurs, à savoir le temps allant de cinq à 35 minutes et la température allant de 25 à 75 degrés Celsius. Les électrodes modifiées traitées ont ensuite été immergées dans 20 micromolaires de bleu de méthylène pendant 30 minutes.L’ADN non spécifiquement absorbé et l’excès de bleu de méthylène ont été éliminés par lavage avec un tampon d’acétate salin pH 4,5, puis rincés à l’eau désionisée. Le courant de crête de réduction du bleu de méthylène a été mesuré à l’aide de la technique de voltampérométrie à impulsions différentielles. La mesure de la voltampérométrie différentielle par impulsions a été effectuée à l’aide d’un tampon phosphate salin pH 7,0 qui ne contenait aucun indicateur.Une procédure similaire a été suivie pour toutes les interactions. Vibrio parahaemolyticus comme souches de référence et huit autres souches bactériennes, à savoir Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157 :H7, Bacillus cereus et Vibrio alginolyticus de l’agent pathogène d’origine alimentaire commun, ont été utilisées pour la validation du biocapteur électrochimique de l’ADN dans cette étude. Une sous-culture de routine de souches bactériennes sur leur gélose respective a été effectuée toutes les deux semaines pour maintenir leur viabilité.La quantité de cellules de Vibrio parahaemolyticus a été déterminée à l’aide d’une technique de plaque étalée. Un millimètre de la culture cellulaire bactérienne a été transféré dans neuf millimètres de bouillon de soja trypticase contenant 3 % de chlorure de sodium pour obtenir un facteur de dilution de 10. Ensuite, 0,1 millilitre de chaque facteur de dilution à partir d’un facteur de dilution de 10 à 10 fois le facteur de dilution de 10 a été étalé sur une plaque de CHROMagar Vibrio pour le comptage des colonies, respectivement.Les coques ont été obtenues sur le marché humide, puis rapidement amenées au laboratoire dans une glacière pour analyse. Les coques ont été divisées en deux groupes, à savoir le groupe traité et le groupe non traité, en supposant que les coques étaient récoltées uniformément depuis le début de la récolte jusqu’à leur placement dans un entrepôt frigorifique au marché. Les coques du groupe traité ont été prétraitées en les stockant à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures, puis en les exposant à la lumière ultraviolette à 20 degrés Celsius pendant quatre heures avant l’extraction de l’ADN.La température de congélation et l’exposition aux ultraviolets utilisées pour le groupe témoin devaient le tuer ou du moins limiter les agents pathogènes d’origine alimentaire qui s’accumulent naturellement dans les coques. Un régime de pasteurisation plus élevé de 70 degrés Celsius n’a pas été appliqué, car le but de la condition contrôlée dans cette étude était d’imiter la situation réelle des coques fraîches. Pendant ce temps, les échantillons du groupe non traité ont été analysés directement sans aucun prétraitement dès leur arrivée en laboratoire.Les coques ont été lavées à l’eau distillée et nettoyées de la saleté avant d’être retirées des tissus des coquilles à l’aide de pinces stériles et d’une armoire à flux laminaire. Environ 10 grammes d’échantillons de tissu de coque ont été homogénéisés avec l’homogénéisateur dans 19 millilitres de bouillon de soja stérile à base de trypticase contenant 3 % de chlorure de sodium pendant 60 secondes. Une quantité connue d’agents pathogènes d’origine alimentaire a ensuite été ajoutée à neuf millimètres de bouillon d’échantillon homogénéisé pour les échantillons enrichis.Les échantillons non enrichis ont été utilisés comme témoin négatif. Environ un millilitre d’échantillons a été pipeté dans un tube Eppendorf pour l’extraction d’échantillons d’ADN qui seraient utilisés pour le biocapteur et le test de réaction en chaîne par polymérase. L’ADN génomique de l’agent pathogène d’origine alimentaire a ensuite été extrait des échantillons enrichis et non enrichis.L’ADN génomique a été extrait à la suite d’une procédure de lyse bouillie modifiée. L’ADN génomique a été centrifugé à 12 000 rotations par minute pendant trois minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une suspension claire et le surnageant maintenu à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Un biophotomètre a été utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l’ADN génomique extrait.L’identité de toutes les souches a ensuite été déterminée à l’aide d’essais biochimiques standard et vérifiée par le séquençage de 16 gènes de l’ARN SR. Enfin, l’ADN génomique a été dénaturé à 92 degrés Celsius pendant deux minutes et rapidement refroidi dans de l’eau glacée avant l’application du biocapteur. Une confirmation supplémentaire des agents pathogènes d’origine alimentaire a été effectuée à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase ciblant le gène respectif.Le produit amplifié et leurs tailles ont été déterminés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 %. Les images du gel ont été capturées à l’aide d’un système de documentation du gel. La génération de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été confirmée à partir des spectres visibles ultraviolets, dont la croissance du plasma de surface et le pic de résonance ont été fondés autour de 540 nanomètres.La formation et l’existence de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été indiquées à des plages de longueurs d’onde de 500 à 600 nanomètres, en fonction de la taille des particules. Tous les pics de cristallite de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été observés sur les deux théâtres à 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 et 77,7 degrés. L’intensité des pics de cristallite a également augmenté lorsque des pics de diffraction plus larges sont entrés à 31,7 degrés, ce qui implique que les nanoparticules froides étaient intégrées dans l’acide polylactique et suggère la formation de nanostructures d’or polyphasiques.À partir de la courbe de distribution des particules de microscopie électronique à transmission et des images de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique, on a pu voir que les nanoparticules d’or sont de forme presque sphérique. La taille des nanoparticules était de l’ordre d’environ 37 nanomètres, ce qui est légèrement plus grand que celui obtenu à partir de la formule de Scherrer, suggérant une nature polycristalline des nanoparticules synthétisées. La taille principale des nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été calculée à l’aide de l’équation de Sherrer en déterminant la largeur de la réflexion de Bragg de 100.À partir de la table, la taille des cristallites de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été calculée à 27 nanomètres. D’après les images de microscopie électronique à balayage à émission de champ et avec des spectres de rayons X à dispersion d’énergie, l’électrode de carbone sérigraphiée modifiée avait le pourcentage de poids d’or le plus élevé, la plus grande densité et la plus grande structure de couverture de nanoparticules. Le spectre des rayons X à dispersion d’énergie a confirmé que les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique telles que produites étaient composées d’or uniquement et ne présentaient aucun autre élément que le pic correspondant au carbone et à l’oxygène.Les potentiels de crête anodique et cathodique étaient constants à différentes vitesses de balayage, ce qui suggère que la réaction électrochimique était réversible sur la base de la séparation des pics. L’aire active des électrodes modifiées a été calculée comme suit : 0,26 centimètre carré et 0,41 centimètre carré pour l’électrode nue et l’électrode modifiée, respectivement. Ce résultat a confirmé que l’amélioration apportée par les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique sur la surface active était relativement plus élevée par rapport à l’électrode nue.La valeur de la résistance au transfert de charge pour l’électrode nue était de 1 932 ohms, tandis que l’électrode modifiée diminuait à 1 444 ohms. La diminution de la valeur de la résistance au transfert de charge dans l’électrode modifiée peut avoir résulté d’une diminution de la constante diélectrique locale et/ou d’une augmentation de l’épaisseur de la double couche électrique, suggérant que le ferrocyanure de potassium fonctionnait par absorption à l’interface métal ou solution. Les courants de crête ont augmenté progressivement avec la modification de l’électrode nue à l’aide de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique, ce qui a montré qu’une sensibilité plus élevée était l’inverse d’une résistance de transfert de charge plus faible.L’écart-type relatif de l’électrode modifiée a été dérivé comme suit : 4,26 % L’électrode avec modification de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a donné un meilleur écart-type relatif après plusieurs mesures. Valeurs d’écart-type relatif de 4,05 % pour l’électrode modifiée, indiquant une meilleure reproductibilité de la fabrication de l’électrode pour les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. La concentration optimisée de l’ADN était de 1,2 micromolaire d’ADN simple brin.Le temps optimal d’immobilisation de l’ADN simple brin a été sélectionné à 180 minutes. La température d’immobilisation optimale de l’ADN simple brin a été sélectionnée à 55 degrés Celsius. Le temps optimal d’hybridation de l’ADN double brin a été sélectionné à 10 minutes.La température optimale d’hybridation de l’ADN double brin a été sélectionnée à 35 degrés Celsius. L’ADN complémentaire présentait le courant de crête le plus bas de 0,73 microampère parmi l’ADN sondé, l’ADN non complémentaire, l’ADN non apparié à trois bases et l’ADN inapparié à une base. Il est évident que le courant élevé de l’ADN ciblé est plus petit que le courant des autres séquences d’oligonucléotides.Ce résultat a indiqué que le biocapteur pouvait être utilisé pour discriminer avec une sensibilité et une spécificité élevées. Le biocapteur d’ADN construit avait une sélectivité de détection d’hybridation via l’ADN de sonde immobilisé à la surface de l’électrode modifiée. Une diminution continue du courant de crête de voltampérométrie d’impulsion différentielle du bleu de méthylène sur l’électrode modifiée a été déclenchée à la suite d’une augmentation de la concentration d’ADN complémentaire.Une corrélation linéaire entre le log de diverses concentrations d’ADN cible de 0,2 picomolaire à 0,02 millimolaire et le log du courant de crête de réduction du bleu de méthylène est représentée par un coefficient de régression linéaire de 0,96. Le pourcentage de récupération du biocapteur d’ADN fabriqué a lentement diminué à pas moins de 80 % de son signal initial après six mois de stockage, ce qui indique que la sonde d’ADN simple brin à la surface de l’électrode modifiée est très stable. Une bonne stabilité à long terme à une température inférieure à 45 degrés Celsius pourrait être la raison de la forte réaction entre les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique et l’ADN simple brin.Les produits d’amplification de l’amplification en chaîne par polymérase de neuf espèces différentes de bactéries, à savoir Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae et Vibrio parahaemolyticus, ont été examinés. Le courant de crête de voltampérométrie différentielle obtenu après une évaluation de la réactivité croisée montre une détection très claire de Vibrio parahaemolyticus par rapport à d’autres espèces de bactéries. On peut le voir en diminuant le nombre de paires de bases, le signal de voltampérométrie d’impulsion différentielle observé augmente.Cela est lié à la plus grande quantité de molécules de bleu de méthylène jusqu’aux sondes. D’après l’analyse de l’amplification en chaîne par polymérase, Vibrio parahaemolyticus a été trouvé dans les échantillons enrichis traités et non traités, comme le montrent les couloirs sept, huit, neuf, 10, 11 et 12. Alors que les échantillons traités et non traités non enrichis aux couloirs un, deux, trois, quatre, cinq et six étaient dépourvus de Vibrio parahaemolyticus.Les résultats de la détection ont été obtenus à l’aide du biocapteur d’ADN mis au point, qui a permis de déterminer la présence de Vibrio parahaemolyticus dans le groupe traité, composé d’échantillons enrichis et non enrichis. Ces résultats sont en corrélation positive avec les résultats de l’amplification en chaîne par polymérase précédemment discutés. L’application de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a un grand potentiel d’application en tant que modification pour un sens supplémentaire de la fabrication.Une sélectivité élevée pourrait être obtenue lorsque le complexe redox se lie plus fortement à la molécule de bioreconnaissance non hybridée, ce qui pourrait être une innovation qui mérite d’être suivie.

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