Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Les agents pathogènes d’origine alimentaire contribuent à une grande partie des problèmes de santé publique à l’échelle mondiale, ce qui affecte considérablement le taux de mortalité et de morbidité humaines. Les méthodes conventionnelles de détection des agents pathogènes d’origine alimentaire nécessitent une manipulation compliquée des échantillons et prennent du temps. Récemment, les biocapteurs se sont avérés être une méthode de détection prometteuse et complète avec les avantages d’une détection rapide et pratique.

Le développement de biocapteurs est basé sur une électrode modifiée avec des nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. L’électrode de carbone sérigraphiée a été modifiée pour augmenter la surface active de l’électrode de travail. Le bleu de méthylène utilisé comme complexe redox a une liaison forte avec l’ADN simple brin de l’ADN de sonde immobilisé.

Cette relation de haute valeur représentée par un courant de crête élevé. L’hybridation de l’ADN simple brin avec sa séquence complémentaire remplace les molécules de bleu de méthylène liées, ce qui réduit le courant de la voltampérométrie différentielle d’impulsion. Cela peut être dû à une plus petite quantité de bleu de méthylène accumulée à la surface d’une électrode modifiée avec de l’ADN double brin complémentaire, qui a été causée par une interaction inaccessible entre les bases de guanine.

La couleur des solutions préparées change en passant du jaune au noirâtre et enfin au rouge rubis foncé. Cela indique que le sel d’or a été réduit par les ions citrate. L’acide polylactique dissous a été mélangé à la solution de nanoparticules d’or préalablement préparée, puis agité de manière homogène à température ambiante, ce qui a ensuite été désigné comme des nanoparticules d’or stabilisées par de l’acide polylactique

La spectroscopie visible ultraviolette, la diffraction des rayons X, la microscopie électronique à transmission et la microscopie électronique à balayage à émission de champ avec spectrométrie à rayons X à dispersion d’énergie ont été utilisées pour caractériser les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. Environ 25 microlitres de la solution homogène de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été rapidement pipetés sur l’électrode de carbone sérigraphiée et séchés à l’air pendant 24 heures avant d’être utilisés. Les électrodes modifiées ont ensuite été caractérisées électrochimiquement dans du ferrocyanure de potassium pour mesurer la surface active, la spectroscopie d’impédance électrochimique, la répétabilité, la reproductibilité et la stabilité.

L’optimisation de la condition d’immobilisation a été déterminée à l’aide de trois facteurs, la concentration d’ADN simple brin allant de 0,2 à 1,4 micromolaire, le temps allant de 30 à 220 minutes et la température allant de 25 à 75 degrés Celsius. D’autre part, l’optimisation des conditions d’hybridation a été déterminée par deux facteurs, à savoir le temps allant de cinq à 35 minutes et la température allant de 25 à 75 degrés Celsius. Les électrodes modifiées traitées ont ensuite été immergées dans 20 micromolaires de bleu de méthylène pendant 30 minutes.

L’ADN non spécifiquement absorbé et l’excès de bleu de méthylène ont été éliminés par lavage avec un tampon d’acétate salin pH 4,5, puis rincés à l’eau désionisée. Le courant de crête de réduction du bleu de méthylène a été mesuré à l’aide de la technique de voltampérométrie à impulsions différentielles. La mesure de la voltampérométrie différentielle par impulsions a été effectuée à l’aide d’un tampon phosphate salin pH 7,0 qui ne contenait aucun indicateur.

Une procédure similaire a été suivie pour toutes les interactions. Vibrio parahaemolyticus comme souches de référence et huit autres souches bactériennes, à savoir Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157 :H7, Bacillus cereus et Vibrio alginolyticus de l’agent pathogène d’origine alimentaire commun, ont été utilisées pour la validation du biocapteur électrochimique de l’ADN dans cette étude. Une sous-culture de routine de souches bactériennes sur leur gélose respective a été effectuée toutes les deux semaines pour maintenir leur viabilité.

La quantité de cellules de Vibrio parahaemolyticus a été déterminée à l’aide d’une technique de plaque étalée. Un millimètre de la culture cellulaire bactérienne a été transféré dans neuf millimètres de bouillon de soja trypticase contenant 3 % de chlorure de sodium pour obtenir un facteur de dilution de 10. Ensuite, 0,1 millilitre de chaque facteur de dilution à partir d’un facteur de dilution de 10 à 10 fois le facteur de dilution de 10 a été étalé sur une plaque de CHROMagar Vibrio pour le comptage des colonies, respectivement.

Les coques ont été obtenues sur le marché humide, puis rapidement amenées au laboratoire dans une glacière pour analyse. Les coques ont été divisées en deux groupes, à savoir le groupe traité et le groupe non traité, en supposant que les coques étaient récoltées uniformément depuis le début de la récolte jusqu’à leur placement dans un entrepôt frigorifique au marché. Les coques du groupe traité ont été prétraitées en les stockant à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures, puis en les exposant à la lumière ultraviolette à 20 degrés Celsius pendant quatre heures avant l’extraction de l’ADN.

La température de congélation et l’exposition aux ultraviolets utilisées pour le groupe témoin devaient le tuer ou du moins limiter les agents pathogènes d’origine alimentaire qui s’accumulent naturellement dans les coques. Un régime de pasteurisation plus élevé de 70 degrés Celsius n’a pas été appliqué, car le but de la condition contrôlée dans cette étude était d’imiter la situation réelle des coques fraîches. Pendant ce temps, les échantillons du groupe non traité ont été analysés directement sans aucun prétraitement dès leur arrivée en laboratoire.

Les coques ont été lavées à l’eau distillée et nettoyées de la saleté avant d’être retirées des tissus des coquilles à l’aide de pinces stériles et d’une armoire à flux laminaire. Environ 10 grammes d’échantillons de tissu de coque ont été homogénéisés avec l’homogénéisateur dans 19 millilitres de bouillon de soja stérile à base de trypticase contenant 3 % de chlorure de sodium pendant 60 secondes. Une quantité connue d’agents pathogènes d’origine alimentaire a ensuite été ajoutée à neuf millimètres de bouillon d’échantillon homogénéisé pour les échantillons enrichis.

Les échantillons non enrichis ont été utilisés comme témoin négatif. Environ un millilitre d’échantillons a été pipeté dans un tube Eppendorf pour l’extraction d’échantillons d’ADN qui seraient utilisés pour le biocapteur et le test de réaction en chaîne par polymérase. L’ADN génomique de l’agent pathogène d’origine alimentaire a ensuite été extrait des échantillons enrichis et non enrichis.

L’ADN génomique a été extrait à la suite d’une procédure de lyse bouillie modifiée. L’ADN génomique a été centrifugé à 12 000 rotations par minute pendant trois minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une suspension claire et le surnageant maintenu à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Un biophotomètre a été utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l’ADN génomique extrait.

L’identité de toutes les souches a ensuite été déterminée à l’aide d’essais biochimiques standard et vérifiée par le séquençage de 16 gènes de l’ARN SR. Enfin, l’ADN génomique a été dénaturé à 92 degrés Celsius pendant deux minutes et rapidement refroidi dans de l’eau glacée avant l’application du biocapteur. Une confirmation supplémentaire des agents pathogènes d’origine alimentaire a été effectuée à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase ciblant le gène respectif.

Le produit amplifié et leurs tailles ont été déterminés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 %. Les images du gel ont été capturées à l’aide d’un système de documentation du gel. La génération de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été confirmée à partir des spectres visibles ultraviolets, dont la croissance du plasma de surface et le pic de résonance ont été fondés autour de 540 nanomètres.

La formation et l’existence de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été indiquées à des plages de longueurs d’onde de 500 à 600 nanomètres, en fonction de la taille des particules. Tous les pics de cristallite de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique ont été observés sur les deux théâtres à 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 et 77,7 degrés. L’intensité des pics de cristallite a également augmenté lorsque des pics de diffraction plus larges sont entrés à 31,7 degrés, ce qui implique que les nanoparticules froides étaient intégrées dans l’acide polylactique et suggère la formation de nanostructures d’or polyphasiques.

À partir de la courbe de distribution des particules de microscopie électronique à transmission et des images de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique, on a pu voir que les nanoparticules d’or sont de forme presque sphérique. La taille des nanoparticules était de l’ordre d’environ 37 nanomètres, ce qui est légèrement plus grand que celui obtenu à partir de la formule de Scherrer, suggérant une nature polycristalline des nanoparticules synthétisées. La taille principale des nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été calculée à l’aide de l’équation de Sherrer en déterminant la largeur de la réflexion de Bragg de 100

À partir de la table, la taille des cristallites de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a été calculée à 27 nanomètres. D’après les images de microscopie électronique à balayage à émission de champ et avec des spectres de rayons X à dispersion d’énergie, l’électrode de carbone sérigraphiée modifiée avait le pourcentage de poids d’or le plus élevé, la plus grande densité et la plus grande structure de couverture de nanoparticules. Le spectre des rayons X à dispersion d’énergie a confirmé que les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique telles que produites étaient composées d’or uniquement et ne présentaient aucun autre élément que le pic correspondant au carbone et à l’oxygène.

Les potentiels de crête anodique et cathodique étaient constants à différentes vitesses de balayage, ce qui suggère que la réaction électrochimique était réversible sur la base de la séparation des pics. L’aire active des électrodes modifiées a été calculée comme suit : 0,26 centimètre carré et 0,41 centimètre carré pour l’électrode nue et l’électrode modifiée, respectivement. Ce résultat a confirmé que l’amélioration apportée par les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique sur la surface active était relativement plus élevée par rapport à l’électrode nue.

La valeur de la résistance au transfert de charge pour l’électrode nue était de 1 932 ohms, tandis que l’électrode modifiée diminuait à 1 444 ohms. La diminution de la valeur de la résistance au transfert de charge dans l’électrode modifiée peut avoir résulté d’une diminution de la constante diélectrique locale et/ou d’une augmentation de l’épaisseur de la double couche électrique, suggérant que le ferrocyanure de potassium fonctionnait par absorption à l’interface métal ou solution. Les courants de crête ont augmenté progressivement avec la modification de l’électrode nue à l’aide de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique, ce qui a montré qu’une sensibilité plus élevée était l’inverse d’une résistance de transfert de charge plus faible.

L’écart-type relatif de l’électrode modifiée a été dérivé comme suit : 4,26 % L’électrode avec modification de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a donné un meilleur écart-type relatif après plusieurs mesures. Valeurs d’écart-type relatif de 4,05 % pour l’électrode modifiée, indiquant une meilleure reproductibilité de la fabrication de l’électrode pour les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique. La concentration optimisée de l’ADN était de 1,2 micromolaire d’ADN simple brin.

Le temps optimal d’immobilisation de l’ADN simple brin a été sélectionné à 180 minutes. La température d’immobilisation optimale de l’ADN simple brin a été sélectionnée à 55 degrés Celsius. Le temps optimal d’hybridation de l’ADN double brin a été sélectionné à 10 minutes.

La température optimale d’hybridation de l’ADN double brin a été sélectionnée à 35 degrés Celsius. L’ADN complémentaire présentait le courant de crête le plus bas de 0,73 microampère parmi l’ADN sondé, l’ADN non complémentaire, l’ADN non apparié à trois bases et l’ADN inapparié à une base. Il est évident que le courant élevé de l’ADN ciblé est plus petit que le courant des autres séquences d’oligonucléotides.

Ce résultat a indiqué que le biocapteur pouvait être utilisé pour discriminer avec une sensibilité et une spécificité élevées. Le biocapteur d’ADN construit avait une sélectivité de détection d’hybridation via l’ADN de sonde immobilisé à la surface de l’électrode modifiée. Une diminution continue du courant de crête de voltampérométrie d’impulsion différentielle du bleu de méthylène sur l’électrode modifiée a été déclenchée à la suite d’une augmentation de la concentration d’ADN complémentaire.

Une corrélation linéaire entre le log de diverses concentrations d’ADN cible de 0,2 picomolaire à 0,02 millimolaire et le log du courant de crête de réduction du bleu de méthylène est représentée par un coefficient de régression linéaire de 0,96. Le pourcentage de récupération du biocapteur d’ADN fabriqué a lentement diminué à pas moins de 80 % de son signal initial après six mois de stockage, ce qui indique que la sonde d’ADN simple brin à la surface de l’électrode modifiée est très stable. Une bonne stabilité à long terme à une température inférieure à 45 degrés Celsius pourrait être la raison de la forte réaction entre les nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique et l’ADN simple brin.

Les produits d’amplification de l’amplification en chaîne par polymérase de neuf espèces différentes de bactéries, à savoir Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae et Vibrio parahaemolyticus, ont été examinés. Le courant de crête de voltampérométrie différentielle obtenu après une évaluation de la réactivité croisée montre une détection très claire de Vibrio parahaemolyticus par rapport à d’autres espèces de bactéries. On peut le voir en diminuant le nombre de paires de bases, le signal de voltampérométrie d’impulsion différentielle observé augmente.

Cela est lié à la plus grande quantité de molécules de bleu de méthylène jusqu’aux sondes. D’après l’analyse de l’amplification en chaîne par polymérase, Vibrio parahaemolyticus a été trouvé dans les échantillons enrichis traités et non traités, comme le montrent les couloirs sept, huit, neuf, 10, 11 et 12. Alors que les échantillons traités et non traités non enrichis aux couloirs un, deux, trois, quatre, cinq et six étaient dépourvus de Vibrio parahaemolyticus.

Les résultats de la détection ont été obtenus à l’aide du biocapteur d’ADN mis au point, qui a permis de déterminer la présence de Vibrio parahaemolyticus dans le groupe traité, composé d’échantillons enrichis et non enrichis. Ces résultats sont en corrélation positive avec les résultats de l’amplification en chaîne par polymérase précédemment discutés. L’application de nanoparticules d’or stabilisées à l’acide polylactique a un grand potentiel d’application en tant que modification pour un sens supplémentaire de la fabrication.

Une sélectivité élevée pourrait être obtenue lorsque le complexe redox se lie plus fortement à la molécule de bioreconnaissance non hybridée, ce qui pourrait être une innovation qui mérite d’être suivie.