Un dosage Simple journaliste Fluorescence pour identifier les composants cellulaires nécessaires à la ricine toxine une chaîne (RTA) traite des levures

L’objectif global de ce simple test rapporteur basé sur la fluorescence est de dépister les composants cellulaires nécessaires au bon trafic de la toxine de la ricine A ou de la chaîne RTA dans l’organisme modèle de levure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le transport intercellulaire des ribosomes dans l’activation d’une toxine B. Dans notre cas, la sous-unité cytotoxique de la toxine simple ricine de la membrane plasmique dans le cytosome.

Le principal avantage de ce test est la possibilité d’analyser l’effet d’un gène de levure individuel sur le transport de l’ATR de manière rapide et peu coûteuse. Commencez ce protocole par la transformation cellulaire comme indiqué dans le protocole texte. Inoculez cinq millilitres de milieu LB kanamycine avec des cellules contenant le plasmide d’expression RTA ou le vecteur vide.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 220 tr/min pendant 24 heures. Complétez un litre de milieu de kanamycine LB avec cinq millilitres de préculture. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 220 tr/min jusqu’à ce que les cellules aient atteint une densité optique à 600 nanomètres de 0,8 à 1,0.

Par la suite, réduisez la température de culture à 28 degrés Celsius. Induire l’expression de l’E.Coli par RTA en ajoutant IPTG à une concentration finale d’un millimolaire. Après 3,5 heures à 28 degrés Celsius et 220 tr/min, récoltez les cellules par centrifugation à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, lavez le granulé avec cinq millilitres de tampon de liaison et le granulé à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir répété le lavage une fois, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de liaison. Soniquez les cellules sur de la glace à l’aide de cinq cycles d’une impulsion de 15 secondes et d’une pause de 30 secondes.

Après avoir centrifuge le cellulé à 21 000 g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, filtrer le surnageant à l’aide d’un système de filtre à seringue stérile. Utilisez un système de purification automatisé, équipé d’une colonne d’affinité à base de nickel de cinq millilitres pour purifier la fraction RTA marquée HIS-du surnageant E.Coli filtré stérile. En général, utilisez une vitesse d’allusion d’un millilitre par minute et refroidissez l’ensemble du système de purification pour éviter la liaison inefficace des toxines et la perte d’activité des toxines.

Équilibrez brièvement la colonne d’affinité avec 20 millilitres de tampon de liaison pour supprimer le tampon de stockage. Appliquez ensuite le surnageant stérile et filtré sur la colonne d’affinité à l’aide d’une seringue. Lavez la colonne avec 25 à 35 millilitres de tampon de liaison pour éliminer les protéines non liées de la colonne.

Effectuez l’étape de lavage jusqu’à ce que les absorbants UV à 280 nanomètres soient proches de la valeur UV initiale. Ensuite, éluez la fraction RTA liée avec 20 à 35 millilitres de tampon d’élution et conservez l’échantillon sur de la glace. Il est important de commencer l’échantillonnage de la fraction RTA peu de temps après l’augmentation de la valeur UV, 280 et d’arrêter l’échantillonnage de la fraction RTA lorsqu’il atteint à nouveau la ligne de base d’origine.

Pour dessaler la fraction RTA éludée, remplacez la colonne d’affinité du système de purification par la colonne de dessalage et équilibrez la colonne avec 20 millilitres de sorbitol 0,8 molaire. Appliquez la fraction RTA éludée sur la colonne à l’aide d’une seringue. Lavez la colonne avec 100 millilitres de sorbitol 0,8 molaire et diluez la fraction RTA dessalée dans un tube de 15 millilitres dès que l’absorption des UV commence à augmenter.

Pour éviter la contamination par le sel, arrêtez-vous à l’échantillonnage de fraction directement lorsque la conductance augmente. Conservez la fraction RTA éludée à quatre degrés Celsius. Après avoir transformé la levure comme décrit dans le protocole de texte, choisissez trois clones de levure différents dans chaque plaque.

Inoculer les clones dans 100 millilitres de lucine dropout raffinose medium à 220 RPM et 30 degrés Celsius à une densité optique à 600 nanomètres de 1,0 à 2,0. Centrifugez les cellules à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes à 10 000 g. Après avoir lavé les cellules deux fois avec cinq millilitres d’eau stérile, remettez les cellules en suspension dans 50 millilitres de tampon de sphhérodynamitage.

Incuber la culture de 50 millilitres à 100 tr/min et 30 degrés Celsius pendant 90 minutes. Après une centrifugation à 400 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de milieu raffinose stabilisé à base de lucine. Ensuite, mettez à nouveau les cellules en suspension dans cinq millilitres du même milieu pour les utiliser directement pour les mesures du dosage du rapporteur GFP.

Ensemencez les sphéroplastes des cellules de levure dans des plaques de 96 puits. Dans chaque puits, ajoutez 70 microlitres de milieu raffinose stabilisé de lucine drop, contenant le contrôle négatif, exprimant le vecteur vide ou le RTA purifié dans une concentration finale de RTA de cinq micromolaires. Ajoutez 70 microlitres de milieu de chute de lucine stabilisé dans chacun des puits restants pour porter leur volume total à 270 microlitres.

Pour un contrôle positif de l’inhibition des protéines, ajoutez 70 microlitres de solution de G418 stabilisée au sorbitol 0,8 molaire, car G418 empêche l’expression de la GFP dans la levure. Ajouter immédiatement 30 microlitres de solution de galactose stabilisée pour induire l’expression de la GFP. Préparez un contrôle négatif supplémentaire en ajoutant 30 microlitres de milieu raffinose stabilisé au lieu de 30 % de galactose.

Une fois la préparation de l’échantillon terminée, placez la plaque à 96 puits dans un lecteur de fluorescence et préparez-vous à la mesure à l’aide du jeu de filtres de 475 et 509 nanomètres requis pour la détection de fluorescence GFP. Effectuez des mesures à 30 degrés Celsius, 120 tr/min et un diamètre d’agitation d’un millimètre sur une fenêtre de temps de 20 heures avec des intervalles de mesure de 10 minutes. Voici un graphique de purification représentatif de la chromatographie d’affinité de la RTA et du contrôle vectoriel vide.

Le pic bleu dans la boîte noire représente la fraction RTA liée. Comme le montre la boîte noire, aucune protéine n’est échappée de la colonne dans le contrôle négatif. Voici un diagramme de dessalage d’une fraction RTA purifiée d’affinité.

Le schéma montre la séparation de la fraction protéique RTA et de la fraction saline. Les résultats de la coloration de Coomassie après une purification et un dessalage réussis montrent des échantillons de lysat cellulaire ou purifiés de différentes variantes de RTA. L’ATR non modifié a été utilisé dans cette étude.

Pour valider le test de rapporteur espacé en fluorescence, la fluorescence relative de la GFP des sphéroplastes de levure de type sauvage a été mesurée dans des conditions induites et non induites après 20 heures d’induction de la GFP. La fluorescence relative de la GFP a également été analysée en présence de RTA, de G418 ou du témoin négatif. La fluorescence relative de la GFP a également été mesurée pour des mutants sélectionnés dans lesquels on sait que les protéines correspondantes sont impliquées et non impliquées dans le trafic de RTA dans la levure.

La ligne pointillée représentait un seuil de signification. Une fois l’expression et la purification de l’ATR maîtrisées, les résultats du test de rapport de fluorescence peuvent être reçus en une journée. De plus, cette méthode ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’inactivation des ribosomes des toxines B pour étudier leurs racines d’intoxication dans un modèle d’organisme eucaryote levure