Analyser la Communication entre les Monocytes et les cellules cancéreuses du sein primitif dans une matrice extracellulaire extrait (ECME)-système tridimensionnel

L’objectif général de ce protocole est d’étudier la communication directe et indirecte entre les cellules cancéreuses primaires du sein et les monocytes dans un système de co-culture tridimensionnel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement inflammatoire du cancer du sein, telles que la façon dont les cellules immunitaires sont reclassées et activées, comment ces cellules aident à maintenir le microenvironnement inflammatoire tumoral et comment ces microenvironnements facilitent l’invasion des cellules tumorales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une alternative abordable pour étudier la communication intra-tumorale et illustre le potentiel des systèmes cellulaires 3D in vitro pour interroger des caractéristiques spécifiques de la biologie tumorale.

En particulier ceux liés à l’agression tumorale. Pour commencer, cultivez deux fois 10 à six monocytes U937 et THP1 dans 10 millilitres de milieu RPMI1640, complété par 10 pour cent de FBS et un pour cent d’antimycosique antibiotique. Cultivez également des PM frais dans un milieu de DMEMF12 supplémenté.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à cinq pour cent de dioxyde de carbone. Plaquez quatre fois 10 à cinquième monocytes dans un millilitre par puits de leur milieu correspondant. Placez un insert dans chaque puits et ajoutez 900 microlitres des quatre fois 10 à la cinquième suspension de cellule BrC dans le milieu correspondant.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant cinq jours et récupérer les surnageants. Récupérer les cellules par trypsinisation si une analyse ultérieure est effectuée. Inclure des contrôles de cultures cellulaires individuelles avec les milieux respectifs.

Pour marquer les cellules et les monocytes BrC avec de la cumérine et de la rhodamine disponibles dans le commerce avant la culture cellulaire, préparez une monocouche de deux fois 10 à la sixième cellules BrC d’intérêt et remplacez le milieu standard par une solution de travail suffisante et préchauffée du colorant fluorescent. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ensuite, aspirez la solution de colorant et utilisez suffisamment de XPBS pour rincer doucement les cellules.

Aspirez le PBS et ajoutez le support standard. Pour trypsiniser les cellules, ajoutez deux millilitres de trypsine à 05 % et d’EDTA à 0,48 millimolaire dans le ballon et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Ajoutez 200 microlitres de FBS pour arrêter la trypsinisation et sept millilitres du milieu correspondant sans suppléments.

Remettez les cellules en suspension par pipetage, puis transférez 10 microlitres de cellules dans une chambre Nuebauer et comptez-les. Ensuite, granulez les cellules à 430 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant et utilisez trois millilitres de solution de travail de colorant fluorescent préchauffée pour remettre les cellules en suspension. Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.

Après avoir à nouveau granulé les cellules, jetez la solution de travail du colorant et utilisez cinq à sept millilitres d’un XPBS pour remettre doucement les cellules en suspension. Ensuite, après avoir granulé les cellules une fois de plus et jeté le PBS, remettez les cellules en suspension dans cinq à sept millilitres de milieu standard. Comptez 10 microlitres de suspension cellulaire.

Mettez en place une co-culture en répandant suffisamment d’ECME au fond du puits pour former une couche uniforme dans chaque puits d’un système de lames à quatre puits. Plaque de 20 microlitres d’une suspension unicellulaire contenant cinq fois 10 à la cinquième cellules BrC marquées par puits. Après 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez une suspension de 2,5 fois 10 au cinquième monocytes marqués dans 80 microlitres de milieu de dosage complété par 60 pour cent d’ECME.

Laissez l’ECME se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Ajoutez maintenant un millilitre d’un mélange un à un des cellules BrC et du milieu de culture de monocytes. Incuber les co-cultures à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 24 heures, 48 heures ou cinq jours pour suivre les changements à différents moments.

Pour dégrader les protéines ECM et récupérer les cellules des cultures, aspirez et jetez le milieu, puis ajoutez 0,5 millilitre d’un XPBS avec 0,1 % de trypsine et 0,25 % d’EDTA à la culture. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, ajoutez 0,5 millilitre d’un XPBS avec 10 % de FBS pour neutraliser la trypsine et remettre les cellules en suspension en pipetant vigoureusement pour obtenir une suspension unicellulaire.

Après avoir granulé les cellules, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres d’un XPBS avec 10 pour cent de FBS. Répétez cette étape une fois. Envoyez la suspension de cellule à la télécopie avec l’instrument approprié.

Assurez-vous que les populations finales sont pures à au moins 95 %. Dans chaque puits d’un système de lames à huit puits, étalez une base de 40 microlitres d’ECME et laissez-la se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Grainez 800 cellules MCF10 A par puits dans 400 microlitres de milieu de culture supplémenté en DMEM F12 selon le protocole de texte.

Ajoutez ensuite 400 microlitres de milieu conditionné ou de milieu de culture DMEM F12 complété avec 20 nanogrammes par millilitre d’IL1 bêta recombinant humain. Placez la lame de la chambre dans une boîte de Pétri en verre contenant une boîte de Pétri de 35 millilitres remplie de deux millilitres de PBS. Les cellules MCF 10A doivent être ensemencées dans chaque puits très lentement pour éviter d’endommager la base de l’ECME et d’empêcher les cellules de se stabiliser et de former une monoly.

À l’aide d’un microscope optique, enregistrez la formation d’acini glandulaires toutes les 24 heures pendant 14 jours. Après 14 jours de culture, ajoutez 100 microlitres de 100 dapy nanomolaires dans un XPBS et incubez les échantillons à température ambiante en remuant constamment pendant 25 minutes. Rincez les échantillons avec un XPBS à température ambiante, trois fois pendant cinq minutes chacune en remuant constamment.

Utilisez un support de montage spécifique pour la coloration fluorescente pour monter les préparations. Ensuite, scellez les échantillons montés avec un vernis transparent et maintenez les lames, à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius. Vadim Perez, chercheur au National Laboratory of Advanced Microscoping, fera la démonstration de la procédure au microscope confocal.

Analysez les acini avec un microscope confocal en prenant des images des empilements transversaux à différentes profondeurs des acini. Visualisez différentes protéines cellulaires dans les acini avec des protocoles de coloration appropriés. Par exemple, le caheren a été coloré ici pour évaluer l’adhésion de cellule à cellule, la polarité cellulaire et la formation d’oralim.

La morphologie des cellules primaires BrC se développant dans des cultures 3D à des densités faibles et élevées a été étudiée pendant cinq jours. Au cours des 48 premières heures, les cellules adhèrent à l’ECME avec une forme de fuseau allongé et forment des structures tricotées au bout de cinq jours. Après cinq jours de co-cultures 3D, les cellules commerciales BrC MCF7 et MDA-MB-231 ont formé des agrégats désorganisés.

Cependant, les cellules MDA-MB-231 agressives pour les agrégats de formes allongées, tandis que les cellules MCF7 non agressives pour les agrégats de formes arrondies et plus densément compactées que les cellules MDA-MB-231. Les surnageants issus de cultures primaires 3D de BrC à interaction indirecte et de leurs co-cultures de cinq jours avec des monocytes primaires ont été récoltés. Des niveaux significativement accrus d’IL1 bêta et d’IL8 ont été observés dans les co-cultures primaires de monocytes de cellules BrC.

Cytokines cruciales et inflammatoires qui ont déjà été associées à la progression maligne. Les cellules MCF10A ont été cultivées avec deux surnageants différents provenant de deux lignées cellulaires primaires BrC pour observer la formation de lumière comme mesure de la résistance à l’anoykis. Contrairement aux cellules MCF10A cultivées dans des conditions standard, la microscopie bi-confocale au jour 14, les coupes transversales des sphéroïdes montrent que les cellules MCF10A ont échappé à l’anoykis, comme mesuré en comptant le nombre de cellules centrales dans les acini.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse médicale peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires. Testez les voies de signalisation dans la migration des deux cancers. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des micro-environnements tumoraux pour explorer les communications des cellules cancéreuses du sein avec les cellules de masse, les fibroblastes, les neutrofils, ou même différents clones de cellules tumorales dans des systèmes de co-culture 3D.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un système de culture 3D pour modéliser le microenvironnement tumoral.