Adhérence des bactéries à planter des Surfaces mesurées en laboratoire

L’objectif global de cette procédure est d’observer et de mesurer la liaison des bactéries aux surfaces des plantes. Cette méthode peut répondre à des questions importantes à la fois en phytopathologie et en sécurité alimentaire. En particulier, il peut répondre à des questions sur la façon dont les bactéries se lient aux surfaces végétales et comment elles peuvent être éliminées.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile, rapide et peu coûteuse. Pour préparer les semis cultivés dans l’eau, placez un petit nombre de graines dans un bécher en verre de 30, 50, 100 ou 150 millilitres. Ici, les graines de tomates sont utilisées.

Couvrez les graines avec de l’éthanol à 80 % et remuez brièvement. Laissez ensuite tremper les graines pendant une minute. Videz l’éthanol et plongez les graines dans une solution composée à 50 % d’eau de Javel du commerce et à 0,1 % de Triton X-100 et d’eau du robinet.

Laissez les graines tremper pendant 20 minutes ou plus si les graines sont grosses, comme les graines de haricots. Videz le mélange d’eau de Javel et lavez les graines trois fois avec de l’eau stérile, en laissant les graines tremper dans l’eau pendant une minute à chaque lavage. Versez les graines et une petite quantité d’eau dans une boîte de Pétri stérile et incubez les graines dans l’obscurité jusqu’à ce que les plants atteignent la taille souhaitée, entre un centimètre et 10 centimètres.

Pour préparer des graines ou des plants cultivés dans du sable, après avoir stérilisé les graines et le matériel de plantation, inoculez les graines ou les plants avec des bactéries conformément au protocole de texte. À l’aide d’une tige de verre stérile, faites un trou peu profond dans le sable juste assez profond pour placer la graine sous la surface. Placez la graine dans le trou et couvrez-la d’une fine couche de sable.

Utilisez ensuite un film d’étanchéité pour sceller le haut du récipient afin d’éviter la perte d’eau et l’entrée de microbes supplémentaires. Cultivez les plantes en laboratoire sous une lumière ou dans la serre à une température et une durée de jour appropriées pour l’espèce et la variété de plante. Plantez les semis dans le sable.

Utilisez une tige de verre stérile pour faire un trou. Ensuite, à l’aide d’un crochet stérile en acier inoxydable, guidez soigneusement la racine dans le trou et utilisez du sable pour remplir les côtés du trou. Après avoir incubé des plantes avec des bactéries selon le protocole textuel, préparez un échantillon pour la microscopie en le plaçant dans une goutte d’eau ou un milieu d’incubation sur une lame de microscope et observez-le directement.

S’il n’y a pas de bactéries libres visibles, il se peut qu’il y ait eu mort bactérienne ou liaison bactérienne au récipient dans lequel l’incubation a été effectuée. Lavez l’échantillon dans de l’eau ou un milieu d’incubation en le plaçant dans un flacon de liquide et en inversant doucement le flacon. Placez ensuite l’échantillon sur la lame du microscope dans un liquide frais pour l’observation.

Pour monter l’échantillon, utilisez une lamelle ordinaire. Si l’échantillon est épais et fait un renflement, ajoutez le liquide et l’échantillon dans le puits d’une presse, appliquez une lamelle de recouvrement avec un anneau de caoutchouc ou de plastique autour du bord. Placez la diapositive sur le dessus et appuyez doucement pour sceller la lamelle sur la diapositive.

Inversez la lame pour examiner l’échantillon. Alternativement, utilisez une lame de comptage d’algues et une lamelle de couverture de la même manière et regardez à un grossissement ne dépassant pas 20 fois. Pour déterminer le nombre de bactéries viables trouvées dans les plantes cultivées dans le sable, commencez par retirer le matériau d’étanchéité du haut et du bas du récipient.

Placez le récipient sur un morceau de papier stérile et frappez doucement le récipient contre la surface pour détacher le sable avant de soulever doucement le sable avec la plante du récipient. Lorsque le cylindre de sable et la plante sont libres sur le papier, fendez le sable au milieu pour révéler la racine de la plante. Si vous le souhaitez, prélevez des échantillons de sable près du bord du récipient ainsi que près de la racine.

Cela peut être utile pour déterminer la propagation, l’accumulation et la croissance des bactéries. Ramassez la racine et enlevez le sable et les bactéries qui adhèrent lâchement en trempant la racine dans un volume mesuré d’eau ou de tampon et en secouant doucement. Déterminez le nombre de cellules viables de la bactérie dans la suspension résultante en la plaquant sur des milieux appropriés tels que la gélose luria.

Cela représente le nombre de bactéries vaguement associées à la racine. Enfin, retirez les bactéries étroitement liées par sonication et déterminez leur nombre. Ce graphique montre l’effet de deux mutations différentes de la cellulose moins sur la capacité des bactéries à coloniser les racines de tomates.

Bien que les écarts-types de certaines mesures aient été aussi élevés que 0,9 log base de 10, la réduction de la liaison des mutants moins la cellulose est clairement évidente. Dans cette expérience, la liaison aux pousses de luzerne de type sauvage E.Coli 0157 :H7 chez des mutants incapables de fabriquer divers exopolysaccharides a été mesurée. Dans les deux souches, la production d’acide poly-bêta-1-6-glucuronique, ou PGA, semblait apporter la plus grande contribution à la liaison d’E. coli pathogène à la surface des plantes.

L’acide colanique a également joué un rôle important dans la liaison. Ici, deux souches de bactéries qui sont incapables de se lier aux surfaces des plantes ont été modifiées pour produire de l’AGP afin de déterminer si elle est suffisante pour provoquer une liaison bactérienne aux racines de tomates. Dans le cas d’A. tumefaciens A1045, le PGA a provoqué la liaison individuelle de la bactérie à la surface de la racine.

D’autre part, S. meliloti s’est lié en grands groupes, dans lesquels seules quelques-unes des bactéries étaient directement attachées à la racine, et la majorité des bactéries étaient attachées à d’autres bactéries. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure pour la configuration initiale, plus le temps d’incubation, et entre 10 minutes et une heure de score, selon l’échantillon. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les bactéries peuvent coller à presque toutes les surfaces.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’observer la liaison des bactéries aux surfaces végétales. Déterminez où les bactéries se lient sur la plante et déterminez le nombre de bactéries liées. N’oubliez pas que si vous effectuez ces procédures avec des agents pathogènes humains, la procédure peut être extrêmement dangereuse et des précautions telles que travailler avec une cagoule de confinement et porter des gants doivent toujours être prises.