Name: Adhérence des bactéries à planter des Surfaces mesurées en laboratoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez une méthode simple pour mesurer l'adhérence bactérienne aux surfaces végétales, notamment les racines et les pousses. Cette technique rapide et économique facilite les recherches en phytopathologie et en sécurité alimentaire.

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L’auteur remercie Susan Whitfield pour la préparation des figures et Camille Martin et Hillary Samagaio pour assistance avec quelques-unes des expériences.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
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<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
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<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
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<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
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<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
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</ol>

L’auteur déclare qu’elle n’a aucun intérêts financiers concurrents.

Il est important d’être conscient de toutes les surfaces à laquelle les bactéries peuvent adhérer pendant l’expérience. Ainsi les bactéries qui sont capables de se lier au verre peuvent être sous-estimée si le nombre de cellules viables est effectué à l’aide de pipettes et tubes de verre. Si les plantes sont cultivées dans la gélose ou sol et certains de la gélose ou de saleté sur les plantes, puis les bactéries peuvent lier à la matière adhérente, plutôt qu’aux plantes. D’autre part, laver la surface de la plante, en particulier dans le cas des racines, peut enlever les revêtements de surface naturelles tels que muqueux et altèrent ainsi les résultats des tests d’adhérence.
Il est important de s’assurer que les bactéries ajoutées au mélange d’incubation restent en vie pendant l’expérience. Ainsi du nombre de cellules viables de bactéries libres ainsi que joints devrait systématiquement effectué. Certains traitements ou mutations bactériennes peuvent réduire le taux de croissance bactérienne ou effectivement causer la mort d’une fraction de la population bactérienne. Bactéries vivantes et mortes ne soient pas reconnaissables au microscope, à moins que les colorations spéciales sont utilisées. Il y a un kit de tache utile pour vivre/morts bactéries qui dépend de l’exclusion des colorants des bactéries vivantes. Toutefois, si une population mixte d’espèces bactériennes est présente du nombre de cellules viables des espèces d’intérêt est susceptible d’être la méthode la plus simple pour déterminer si l’incubation a entraîné la mort bactérienne.
Composition du milieu influeront sur la croissance et la survie bactérienne. Exsudat racinaire et matériaux libérés de la plaie et couper les sites fourniront substrat pour soutenir la croissance bactérienne modeste. Phosphates, azote et le fer ont tendance à se limiter dans ces conditions. Des cations divalents comme le calcium et le magnésium peuvent influencer l’adhérence. Dans certains cas, source de carbone peut influencer adhérence. pH est également important. En général, le pH de la rhizosphère est entre 5,5 et 6,5.
Il est nécessaire d’être prudent en utilisant marquées avec la résistance aux antibiotique des bactéries. Antibiotiques les plus souvent utilisées sont la rifampicine et à l’acide nalidixique. La résistance à ces antibiotiques est généralement due à des mutations dans des gènes chromosomiques (ARN polymérase et gyrase, respectivement) et donc ne peut facilement être transférée à une autre souche durant l’incubation. Ce type de résistance aussi n’entraîne pas la dégradation ou la modification de l’antibiotique. Marquage des bactéries avec un plasmide gène marqueur n’est pas recommandée à moins que le plasmide peut s’appliquer à toutes les autres bactéries. La résistance aux antibiotique ne doit pas être dû à une modification chimique ou de dégradation de l’antibiotique, comme des bactéries sensibles aux antibiotiques sera alors capables de croître sur plaques d’antibiotiques si elles sont situées à proximité de la bactérie résistante.
Les méthodes décrites dans cet article sont utiles pour la petite taille des échantillons et/ou des expériences où les échantillons doivent être contenus (par exemple, dans les expériences impliquant des agents pathogènes humains). Pour les grands échantillons (au-dessus de 100 g de matériau ou de plus de 50 plants) autres méthodes ou modification drastique de ces méthodes seraient nécessaires10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la présence d’un grand nombre de micro-organismes autres que les espèces étudiées peut également poser des problèmes importants. Les solutions possibles comprennent l’utilisation de bactéries marquée d’une protéine fluorescente ou la résistance aux antibiotique comme décrit aux étapes 6.1.2 et 7.3. Toutefois, lorsque les bactéries d’intérêt sont rares individus dans une population importante d’autres micro-organismes ces marqueurs ne peut-être pas suffisantes pour permettre une évaluation claire du nombre de bactéries étudiées.
Toutes les méthodes décrites ici sont des méthodes de laboratoire. Des modifications seraient nécessaires pour les études à effet de serre. Des modifications plus importantes sont susceptibles d’être requis pour les études sur le terrain où les protozoaires, insectes et autre animale variation de la prédation et le climat compliquent la fourniture de conditions définies pour les expériences. À l’avenir ces méthodes peuvent être prolongés pour inclure les interactions entre deux ou plusieurs microorganismes sur la surface de la plante.

La mesure de fixation bactérienne de planter des surfaces est devenu importante dans trois situations disparates. La première situation est l’examen de la transmission d’agents pathogènes humains sur plante surfaces1,2,3. Le but ici est d’empêcher les bactéries ou d’enlever ou tuer les bactéries liées et donc de réduire la transmission de la maladie de matériel végétal. La deuxième situation est l’examen de la fixation des agents phytopathogènes pour planter des surfaces4. Une fois de plus, le but ici est d’empêcher la liaison ou pour enlever ou tuer les bactéries liées et donc de réduire la maladie. La troisième situation est l’examen de la fixation des bactéries symbiotiques ou favorisant la croissance des plantes5,6. Le but ici est de promouvoir les bactéries contraignant et donc à l’augmentation de la santé des plantes et des cultures donne.
Les techniques pour mesurer la liaison bactérienne de planter des surfaces décrites dans cet article sont relativement faciles à réaliser et peu coûteux. Les seules exigences sont un microscope et des matériaux trouvés généralement dans un laboratoire de bactériologie. Pour certaines techniques un sonicateur bain est utile. Les techniques décrites sont conçus pour la liaison d’expériences réalisées à l’aide de relativement petite taille des échantillons. Mesures de liaison sont effectuées en laboratoire, bien qu’il peut être possible de modifier certaines de ces techniques pour utilisation en serre ou dans le domaine.
Ces techniques ont été utilisées pour mesurer la fixation bactérienne aux racines, pousses, feuilles coupées, fruits coupés et des tomates cerises intacts dans le laboratoire7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Ils ont également été utilisés pour mesurer la colonisation des racines des plantes qui poussent dans le sol ou le sable dans le laboratoire16. Les techniques ont été utilisées avec de nombreuses espèces bactériennes, y compris les Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica et Pseudomonas fluorescens. Une description utile des méthodes d’évaluation de l’interaction d’a. tumefaciens avec surfaces se trouvent à Morton et Antoine Fuqua (2012)17. Dans tous les cas la taille de l’échantillon impliquée était petite, généralement moins que 25 à 50 plantes. Les techniques décrites sont adaptés pour une utilisation avec des agents pathogènes humains qui doivent rester confinée au cours des expériences.

<table><tbody><tr><td>un microscope optique</td>, <td>un</td> contraste <td>de phase N/A</td><td>ou une optique Nomarski sont utiles, pour les études utilisant des marqueurs fluorescents, un microscope à fluorescence est nécessaire.</td></tr><tr><td>graines</td><td>n’importe laquelle&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>, notez le numéro de lot de la graine et le cultivar d’eau</td></tr><tr><td>de Javel</td>, <td>tout</td> sonicateur de bain <td>N/A</td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>toute entreprise de fournitures scientifiques</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>gélose nutritive&nbsp ;</td><td>Difco&nbsp ;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soja</td><td>Difco&nbsp ;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sable</td><td>de mer Sable Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sable</td><td>&nbsp ; Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe & Fils, Inc.</td><td>Cônes Ray-Leach,</td><td>de nombreuses tailles différentes sont disponibles pour s’adapter au type de plante que vous souhaitez cultiver</td></tr><tr><td>, parafilm</td><td>, n’importe quelle entreprise de fournitures scientifiques</td><td>, N/A</td><td></td></tr><tr><td>, MS sels,</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>M5524</td><td></td></tr>, <tr><td>parrafine</td><td>, N</td><td>/A</td><td></td></tr>, <tr><td>centrigfuge,</td><td>n’importe quelle entreprise scientifique</td>, <td>N/A</td><td>pour granuler la plupart des bactéries, seulement une petite centrifugeuse avec une force maximale de 10 000 XG est nécessaire</td></tr><tr><td>mélangeur vortex</td><td>n’importe quelle entreprise</td><td></td><td></td>scientifique</tr><tr><td>micromètre</td><td>ACCU-SCOPE Accessoires</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter cellule de comptage</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal chambre incubatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>acide naladixique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Coloration vivante/morte</td><td>dans les biosondes moléculaires Vitrogen</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adhérence des bactéries à planter des surfaces mesurées en laboratoire

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Cet article décrit une méthode pour mesurer la liaison bactérienne aux surfaces de plantes axéniques au microscope et grâce à l’utilisation du nombre de cellules viables. Matières végétales utilisées comprennent des racines, des pousses, des feuilles et coupez les fruits. Les méthodes décrites sont peu coûteux, facile et adapté pour la petite taille des échantillons. Liaison est mesuré en laboratoire et une variété de conditions et du milieu d’incubation peut être utilisée. Les effets des inhibiteurs peuvent être déterminées. Des situations qui favorisent et inhibent la liaison peuvent également être évaluées. Dans certains cas, il est possible de distinguer si diverses conditions modifient liaison principalement en raison de leurs effets sur la plante ou sur les bactéries.

A. tumefaciens colonise la surface des racines. Afin de déterminer si la production bactérienne de la cellulose joue un rôle dans la colonisation des racines, les effets de mutations bactériennes qui empêchent la synthèse de la cellulose ont été examiné16. Les techniques décrites aux étapes 1.3 et 7.1 ont été utilisés. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau stérile. Lorsque les racines étaient environ 2 cm de long, ils étaient trempés dans une suspension de 105 bactéries / mL et plantés dans le sol pasteurisé dans des conteneurs. Les plantes ont été cultivées pendant 14 jours à 25 ° C sur un cycle foncé h de lumière/12 12 h. Après indiqué temps les plantes ont été récoltées dans les conteneurs. Les racines ont été lavés et sonication dans un sonicateur bain pour éliminer les bactéries liés. Nombre de bactéries ont été déterminées à l’aide du nombre de cellules viables. La figure 2 montre l’effet de deux mutations différentes de cellulose-moins sur la capacité des bactéries à coloniser les racines de la tomate. Bien que les écarts de quelques mesures ont été aussi hauts que 0,9 log10 (un problème courant avec ce type de mesure) la réduction obligatoire des mutants cellulose-minus est évidente et nous pouvons conclure que la production bactérienne de cellulose favorise les bactéries la colonisation des racines de la tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figure 2 : Racine de colonisation de type sauvage et des mutants de cellulose-moins d’a. tumefaciens. Log10 nombre total de bactéries par cm de longueur racine extraite des racines de tomates inoculés avec la souche de type sauvage a. tumefaciens C58 et mutants de cellulose-moins C58:1 et C58:A60. Les chiffres indiqués sont les moyens d’un minimum de quatre expériences distinctes. Les barres indiquent des écarts-types des moyens. Racines ont été inoculés par leur immersion dans une suspension de 105 bactéries / mL pour un min. Les plantes ont été cultivées dans des récipients et la bactérie faiblement adhérente est enlevée par lavage des racines dans le tampon non contrôlé dans un flacon en verre de lavage. Bactéries étroitement adhérentes ont été supprimés en utilisant un sonicateur de bain et de la suspension qui en résulte plaqué pour déterminer la numération de cellules viables16. De Matthysse et McMahan, ce chiffre a été modifié. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
A examiné le rôle des exopolysaccharides dans la liaison d’e. coli et autres bactéries aux germes de luzerne. Certains foyers de maladie diarrhéique due à e. coli O157 : H7 ont été attribuées aux germes de luzerne contaminés. Liaison des bactéries de type sauvage et des mutants incapables de faire diverses exopolysaccharides a été mesurée en utilisant les méthodes décrites dans les étapes 1.1, 5.1 et 7.2. Germes de luzerne ont été surface stérilisé et mises à germer pendant une journée dans l’eau stérile à 25 ° C dans l’obscurité. Quatre choux avec des téguments ci-joint ont été placés dans des plats en plastique stériles contenant 5 mL d’eau. Bactéries cultivées dans un bouillon Luria ont été ajoutés à une concentration finale d’environ 5 x 103 / mL. Les germes inoculés ont été incubées à 25 ° C dans l’obscurité pendant 3 jours. Les pousses ont été lavés deux fois dans 5 mL d’eau dans un flacon stérile par inversion vigoureuse et homogénéisés dans le tampon à l’aide d’un homogénéisateur de verre téflon moteur de lavage. Des expériences antérieures à l’aide de bactéries marquées avec un plasmide porteur du gène de la GFP ont montré aucune bactérie intériorisée, même si les bactéries de surface ont été observées facilement. Les résultats figurent dans le tableau 1. Deux souches d’e. coli O157 : H7 ont été examinés. Dans les deux souches de la production de poly-β-1, 6-glucuronique acid(PGA) semblait contribuent le plus à la liaison du pathogène e. coli de planter des surfaces. L’acide colique a également joué un rôle significatif dans la liaison. Alors que la réduction obligatoire chez les mutants de cellulose-minus était significative, il n’était pas aussi importante que celle pour les deux autres polysaccharides.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effets des Mutations dans les gènes de la Production d’exopolysaccharides sur reliure d’e. coli O157 : H7 aux choux et ouvert des téguments</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Souche bactérienne</td>
			<td rowspan="2">Mutation ou génotype (phénotype pertinente)</td>
			<td colspan="2">Numéro10 journal de bactéries lié par sprout ou tégument</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luzerneb
</td>
			<td>Téguments ouverts</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Aucun (type sauvage)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>de 2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C 8624</td>
			<td>
wcaD (colique acide-minus)</td>
			<td>1.8 ± 0,7c
</td>
			<td>2,4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
ACGP (PGA-minus)</td>
			<td>&lt; 1,0c
</td>
			<td>1,0 ± 1,0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Aucun (type sauvage)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4,1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (colique acide-minus)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
ACGP (PGA-minus)</td>
			<td>&lt; 1,0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">un moyenne ± écart-type d’un minimum de trois mesures du nombre de bactéries (log10) lié après 3 jours.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Choux de b ont été lavés avant la mesure.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativement différente de la souche sauvage : P &lt; 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativement différente de la souche sauvage : P &lt; 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : effets des mutations dans les gènes de la production d’exopolysaccharides sur fixation de E. coli O157 : H7 pour les choux. Afin de déterminer le rôle des divers exopolysaccharides et lipopolysaccharide dans la liaison du pathogène souches d’e. coli O157 : H7 aux germes de luzerne, la liaison d’une série de mutants pour les choux et les téguments ouverts a été étudiée en utilisant les méthodes décrit à l’étape 6. Les résultats ont montré que poly-ß-1, 6 -N-acétyl-D-glucosamine (PGA) semble être essentiel pour la liaison aux germes et que la cellulose et colanique l’acide sont nécessaires pour la liaison maximale d’e. coli O157. Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.
Afin de déterminer si la production de PGA est suffisante pour provoquer la liaison bactérienne de planter des surfaces, un plasmide (pMM11) portant l’opéron cloné codant les gènes nécessaires à la PGA, la production a été introduite dans deux bactéries différentes qui ne seraient pas normalement être capable de se lier à la tomate racines10. A. tumefaciens A1045 est un mutant de la souche de type sauvage C58 qui omet de faire 1,2 cyclique-β glucanes et aussi ne peut pas lier de planter des surfaces29. Sinorhizobium meliloti 1021 formant des nodules racinaires sur luzerne ne parvient pas à lier les non-légumineuses dont12de la tomate. Les techniques décrites dans les étapes 1.1, 5.1, 6,3 et 7,1 servaient à déterminer si la capacité de faire PGA généralement augmentée fixation bactérienne à la surface des racines. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau stérile. Racines ont été coupés en segments de 1 cm de longueur et placés dans l’eau stérile et les bactéries ont été inoculés. Comme ces deux espèces de bactéries croissent à des taux différents, contraignant a été mesurée à des moments différents pour permettre à peu près égales de la croissance bactérienne. La présence de le pMM11 de plasmide entraîne une augmentation significative similaire dans le nombre de bactéries dépendant de ces deux espèces (tableau 2)10. Une augmentation significative de la liaison a été également vu au microscope, mais la liaison était très différente chez les deux espèces (Figure 3). A. tumefaciens A1045 lié comme des bactéries à la surface de la racine. S. meliloti lié en larges bouquets où seulement quelques uns des bactéries ont été liés directement à la racine et la majorité des bactéries était attachée à d’autres bactéries. Cet exemple montre que l’analyse simplement le nombre de bactéries liés sans inclure l’observation au microscope peut donner une impression trompeuse des résultats d’une expérience. Bien que les deux méthodes (nombre de cellules viables et observation au microscope) montrent que pMM11 a augmenté fixation bactérienne aux racines de la tomate, le type de liaison causée par la production de PGA était différent pour les deux espèces bactériennes10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">L’effet de la pMM11 de plasmide sur la liaison des bactéries aux racines de la tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souche bactérienne</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Nombre de bactéries lié par la longueur des racines mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>aucun</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (synthèse de la PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>aucun</td>
			<td>aucun détecté</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>aucun détecté</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (synthèse de la PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">une liaison bactérienne a été mesurée après 2 heures</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b fixation bactérienne était mesure après 18 heures</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : l’effet d’un plasmide porteur de gènes pour la synthèse de PGA sur la liaison de A. tumefaciens A1045 et S. meliloti 1021 à sections de racines de tomates. Afin d’examiner la possibilité de poly-ß-1, 6 -N-acétyl-D-glucosamine (PGA) pour favoriser la fixation de bactéries pour planter des racines, l’effet d’un plasmide qui confère la capacité de faire PGA (pMM11) sur la liaison de deux souches de bactéries associées aux plantes à racines de tomates a été examinée. Aucune souche de la bactérie ont montré une liaison significative aux racines de la tomate en l’absence du plasmide ou en présence de plasmide sans les gènes codant la synthèse PGA (pBBR1mcs). L’ajout du plasmide porteur de gènes de synthèse de PGA a augmenté la fixation par les deux types de bactéries. Parce qu’a. tumefaciens se développe plus vite que la liaison de S. meliloti a été mesurée après 2 h d’incubation pour a. tumefaciens et après 18 h pour S. meliloti. Les techniques utilisées sont celles qui sont indiquées à l’étape 7. Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figure 3 : L’effet de la pMM11 du plasmide portant les gènes de biosynthèse de PGA sur la liaison d’a. tumefaciens A1045 et S. meliloti 1021 aux poils absorbants tomate. Liaison aux poils absorbants tomate de A) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 et D) S. meliloti 1021 pMM11. Bien que l’augmentation dans la liaison des deux espèces bactériennes est à peu près similaire, les détails de la liaison comme vu au microscope sont très différentes. Les techniques utilisées sont celles qui sont indiquées à l’étape 6. Ce chiffre a été modifié par Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Il est parfois possible d’utiliser la liaison à surfaces non biologiques pour aider à distinguer l’apport de bactéries et de la plante dans une interaction spécifique. Le polysaccharide(UPP) unipolaire d’a. tumefaciens a démontré pouvoir de médiation bactérienne contraignant à une variété de ces deux surfaces biologiques et non biologiques30. Calcium a été observée à inhiber la liaison de a. tumefaciens de planter des surfaces médiées par l' UPP28. Afin de déterminer si l’inhibition par les ions calcium de fixation bactérienne de planter des surfaces est due à un effet sur les bactéries ou sur la surface de la plante, la fixation des bactéries sur les filets en nylon a été examinée. Les techniques décrit à l’étape 8.2 ont été utilisés. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau tel que décrit à l’étape 1. Les bactéries ont été cultivés sur un milieu minimal avec saccharose et ajoutés aux racines de tomates ou de fils de nylon à une concentration finale d’environ 105/ml comme indiqué au point 5.1. A examiné l’effet de l’ACIC ajouté2 sur fixation bactérienne aux racines de tomates et de fils de nylon au microscope. La figure 4 montre une inhibition similaire de liaison par le calcium à l’aide soit surface ce qui suggère que l’effet du calcium est principalement sur les bactéries10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figure 4 : L’effet du calcium sur la liaison d’a. tumefaciens à poils absorbants tomate et fils nylon. A. tumefaciens est incubé avec les racines de la tomate (A et B) ou de fils de nylon (C et D) pendant 24 h dans une 01:10 dilution des sels de MS et une 01:20 dilution du milieu minimal AB, 0,4 % de sucrose (A et C) ou dans un 01:10 dilution des sels MS et 01:20 dilution du milieu minimal AB , 0,4 % de sucrose contenant 60 mM CaCl2 (B et D)31. L’ajout CaCl2 inhibent la liaison bactérienne à la fois des racines et des filets en nylon, ce qui suggère que l’inhibition est principalement due à un effet sur les bactéries plutôt que sur la surface de la plante. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Une méthode simple permettant de mesurer et de caractériser l’adhérence bactérienne aux plantes, en particulier les racines et les pousses, est décrit dans cet article.

Adhérence des bactéries à planter des Surfaces mesurées en laboratoire

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

L’objectif global de cette procédure est d’observer et de mesurer la liaison des bactéries aux surfaces des plantes. Cette méthode peut répondre à des questions importantes à la fois en phytopathologie et en sécurité alimentaire. En particulier, il peut répondre à des questions sur la façon dont les bactéries se lient aux surfaces végétales et comment elles peuvent être éliminées.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile, rapide et peu coûteuse. Pour préparer les semis cultivés dans l’eau, placez un petit nombre de graines dans un bécher en verre de 30, 50, 100 ou 150 millilitres. Ici, les graines de tomates sont utilisées.Couvrez les graines avec de l’éthanol à 80 % et remuez brièvement. Laissez ensuite tremper les graines pendant une minute. Videz l’éthanol et plongez les graines dans une solution composée à 50 % d’eau de Javel du commerce et à 0,1 % de Triton X-100 et d’eau du robinet.Laissez les graines tremper pendant 20 minutes ou plus si les graines sont grosses, comme les graines de haricots. Videz le mélange d’eau de Javel et lavez les graines trois fois avec de l’eau stérile, en laissant les graines tremper dans l’eau pendant une minute à chaque lavage. Versez les graines et une petite quantité d’eau dans une boîte de Pétri stérile et incubez les graines dans l’obscurité jusqu’à ce que les plants atteignent la taille souhaitée, entre un centimètre et 10 centimètres.Pour préparer des graines ou des plants cultivés dans du sable, après avoir stérilisé les graines et le matériel de plantation, inoculez les graines ou les plants avec des bactéries conformément au protocole de texte. À l’aide d’une tige de verre stérile, faites un trou peu profond dans le sable juste assez profond pour placer la graine sous la surface. Placez la graine dans le trou et couvrez-la d’une fine couche de sable.Utilisez ensuite un film d’étanchéité pour sceller le haut du récipient afin d’éviter la perte d’eau et l’entrée de microbes supplémentaires. Cultivez les plantes en laboratoire sous une lumière ou dans la serre à une température et une durée de jour appropriées pour l’espèce et la variété de plante. Plantez les semis dans le sable.Utilisez une tige de verre stérile pour faire un trou. Ensuite, à l’aide d’un crochet stérile en acier inoxydable, guidez soigneusement la racine dans le trou et utilisez du sable pour remplir les côtés du trou. Après avoir incubé des plantes avec des bactéries selon le protocole textuel, préparez un échantillon pour la microscopie en le plaçant dans une goutte d’eau ou un milieu d’incubation sur une lame de microscope et observez-le directement.S’il n’y a pas de bactéries libres visibles, il se peut qu’il y ait eu mort bactérienne ou liaison bactérienne au récipient dans lequel l’incubation a été effectuée. Lavez l’échantillon dans de l’eau ou un milieu d’incubation en le plaçant dans un flacon de liquide et en inversant doucement le flacon. Placez ensuite l’échantillon sur la lame du microscope dans un liquide frais pour l’observation.Pour monter l’échantillon, utilisez une lamelle ordinaire. Si l’échantillon est épais et fait un renflement, ajoutez le liquide et l’échantillon dans le puits d’une presse, appliquez une lamelle de recouvrement avec un anneau de caoutchouc ou de plastique autour du bord. Placez la diapositive sur le dessus et appuyez doucement pour sceller la lamelle sur la diapositive.Inversez la lame pour examiner l’échantillon. Alternativement, utilisez une lame de comptage d’algues et une lamelle de couverture de la même manière et regardez à un grossissement ne dépassant pas 20 fois. Pour déterminer le nombre de bactéries viables trouvées dans les plantes cultivées dans le sable, commencez par retirer le matériau d’étanchéité du haut et du bas du récipient.Placez le récipient sur un morceau de papier stérile et frappez doucement le récipient contre la surface pour détacher le sable avant de soulever doucement le sable avec la plante du récipient. Lorsque le cylindre de sable et la plante sont libres sur le papier, fendez le sable au milieu pour révéler la racine de la plante. Si vous le souhaitez, prélevez des échantillons de sable près du bord du récipient ainsi que près de la racine.Cela peut être utile pour déterminer la propagation, l’accumulation et la croissance des bactéries. Ramassez la racine et enlevez le sable et les bactéries qui adhèrent lâchement en trempant la racine dans un volume mesuré d’eau ou de tampon et en secouant doucement. Déterminez le nombre de cellules viables de la bactérie dans la suspension résultante en la plaquant sur des milieux appropriés tels que la gélose luria.Cela représente le nombre de bactéries vaguement associées à la racine. Enfin, retirez les bactéries étroitement liées par sonication et déterminez leur nombre. Ce graphique montre l’effet de deux mutations différentes de la cellulose moins sur la capacité des bactéries à coloniser les racines de tomates.Bien que les écarts-types de certaines mesures aient été aussi élevés que 0,9 log base de 10, la réduction de la liaison des mutants moins la cellulose est clairement évidente. Dans cette expérience, la liaison aux pousses de luzerne de type sauvage E.Coli 0157 :H7 chez des mutants incapables de fabriquer divers exopolysaccharides a été mesurée. Dans les deux souches, la production d’acide poly-bêta-1-6-glucuronique, ou PGA, semblait apporter la plus grande contribution à la liaison d’E. coli pathogène à la surface des plantes.L’acide colanique a également joué un rôle important dans la liaison. Ici, deux souches de bactéries qui sont incapables de se lier aux surfaces des plantes ont été modifiées pour produire de l’AGP afin de déterminer si elle est suffisante pour provoquer une liaison bactérienne aux racines de tomates. Dans le cas d’A. tumefaciens A1045, le PGA a provoqué la liaison individuelle de la bactérie à la surface de la racine.D’autre part, S. meliloti s’est lié en grands groupes, dans lesquels seules quelques-unes des bactéries étaient directement attachées à la racine, et la majorité des bactéries étaient attachées à d’autres bactéries. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure pour la configuration initiale, plus le temps d’incubation, et entre 10 minutes et une heure de score, selon l’échantillon. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les bactéries peuvent coller à presque toutes les surfaces.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’observer la liaison des bactéries aux surfaces végétales. Déterminez où les bactéries se lient sur la plante et déterminez le nombre de bactéries liées. N’oubliez pas que si vous effectuez ces procédures avec des agents pathogènes humains, la procédure peut être extrêmement dangereuse et des précautions telles que travailler avec une cagoule de confinement et porter des gants doivent toujours être prises.

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