Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation
December 21st, 2017
Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.
L’objectif global de ce protocole est de marquer des transcrits individuels chez E.Coli pour des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour la visualisation dans des expériences FiSH à molécule unique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des systèmes, telles que la caractérisation des transcrits de cellule à cellule du champ d’intérêt. Ainsi que les transcrits de localisation de la paroi cellulaire.
Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une quantité d’informations sur les statistiques des processus transcriptionnels. Pour commencer le protocole, cultivez E.Coli MG1655 en milieu LB pendant la nuit dans un agitateur orbital, à 260 tr/min et 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluez la culture de nuit à une à 100 dans un milieu frais et mesurez sa densité optique dans un spectrophotomètre, jusqu’à une valeur de 0,2 à 0,4.
Ensuite, granulez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 4 500 G à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant de tous les tubes. Ajoutez un millilitre de 1XPBS dans chaque tube et remettez la pastille en suspension pour minimiser l’agrégation de cellule à cellule.
Ajoutez ensuite quatre millilitres de tampon de fixation et agitez doucement le tube. Incuber les échantillons dans un agitateur orbital. Remettez la pastille en suspension afin de minimiser l’agrégation de cellule à cellule, qui peut interférer avec l’imagerie cellulaire.
Après l’incubation, granulez les cellules, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de 1XPBS. Transférez les suspensions dans des tubes de microcentrifugation à fond conique de 1,8 millilitre. Granuler les cellules par centrifugation.
Commencez la perméabilisation des bactéries en retirant soigneusement le surnageant. Utilisez des pipettes de petit volume pour retirer tout le liquide à l’extérieur de la pastille. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 300 microlitres d’eau traitée au DEPC.
Ajoutez 350 microlitres d’éthanol absolu de haute qualité et mélangez doucement la solution en inversant le tube. Ajoutez encore 350 microlitres d’éthanol et mélangez à nouveau. Ensuite, faites pivoter l’échantillon avec le rotateur de tube à 20 tr/min pendant une heure à température ambiante.
Granulez les cellules de la perméabilisation. Après la centrifugation, retirez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à 20 % aux échantillons.
Laissez-les reposer pendant plusieurs minutes. Ensuite, les cellules à granulés sont centrifugées pendant sept minutes à 750 G et quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant très doucement et utilisez des pipettes de petit volume pour éliminer tout le liquide à l’extérieur de la pastille.
Ajoutez ensuite la solution mère du jeu de sondes d’oligonucléotides à l’aliquote du tampon d’hybridation de sorte que la concentration finale d’oligonucléotides soit de 250 nanomolaires et faites un tourbillon vigoureux dans le tube. Suspendre les échantillons dans 50 microlitres de tampon d’hybridation qui contient les sondes oligonucléotidiques, tout en évitant la génération de bulles. Laissez les échantillons toute la nuit, dans l’obscurité, sur un bloc chauffant à 30 degrés Celsius.
Pour préparer le lavage, procurez-vous un nouveau tube de micro-centrifugeuse pour chaque échantillon à imager. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans chaque tube. Ajoutez 10 à 15 microlitres des échantillons hybridés dans le nouveau tube qui contient le tampon de lavage.
Granuler les cellules par centrifugation. Ensuite, retirez le surnageant. Lavez les échantillons deux fois de plus.
Remettez le granulé en suspension dans un tampon de lavage de 25 microlitres. Préparez un gel d’agarose en ajoutant 150 milligrammes d’agarose à 10 millilitres de tampon 2X SSC. Passez la solution au micro-ondes pendant 10 à 15 secondes à chaque fois, jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement.
Laissez ensuite refroidir le tube pendant quelques minutes. Ensuite, placez un cadre en silicone de séparation sur la diapositive afin que le centre de la diapositive reste exposé. Placez un anneau rigide de 10 millimètres de large et d’un à deux millimètres d’épaisseur au centre de la glissière.
Déposez une petite quantité de gel au centre pour sceller et attendez quelques minutes que le gel durcisse. Ajoutez ensuite plus de gel, jusqu’à ce qu’une forme de dôme élevé se forme. Attendez environ 10 minutes que le gel durcisse et retirez l’anneau.
Déposez 10 microlitres de cellules bactériennes de lavage sur le gel et scellez-le avec une lame de recouvrement numéro zéro. Gardez l’échantillon dans l’obscurité pour éviter le photo-blanchiment. Les mesures smFiSH des cellules E. coli montrent le niveau d’induction de galK en réponse à des concentrations variables de D-fucose extracellulaire.
Le signal de fond est représenté par une déformation supprimée galK, ou delta galK JW0740 en tant que contrôle négatif. De nombreuses taches sont observées dans la plupart des cellules. Correspond à un ou quelques transcrits galK lorsque deux millimolaires de D-fucose sont ajoutés à la culture bactérienne.
Alors que quelques taches sont observées en l’absence de D-fucose extracellulaire. Un autre exemple d’application de ce protocole est fourni par le gène sodB, avec des images de fluorescence et de contraste de phase de smFiSH dans un type sauvage ou une souche JW1648 sodB supprimée. Les échantillons préparés avec ce protocole peuvent également être imagés à l’aide de STORM, ce qui permet une précision précise des transcrits dans la cellule.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des systèmes pour explorer les statistiques des événements de transcription dans les cellules individuelles.
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Aperçu
Ce manuscrit décrit une méthode pour marquer des transcrits individuels d'ARN messager (ARNm) avec des sondes d'ADN marquées de façon fluorescente pour une utilisation dans des expériences d'hybridation in situ par fluorescence à molécule unique (smFISH) dans E. coli. Cette technique permet la détection, la localisation et la quantification simultanées de molécules d'ARNm uniques dans des cellules individuelles fixées.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biologie des systèmes
- Biologie cellulaire
Contexte
- L'hybridation in situ par fluorescence à molécule unique (smFISH) est une méthode de visualisation puissante.
- Cette méthode permet l'étude des processus de transcription au niveau d'une cellule unique.
- Comprendre la localisation et la quantification de l'ARNm est crucial pour la biologie des systèmes.
- E. coli sert d'organisme modèle pour ces expériences.
Objectif de l'étude
- Marquer des transcrits individuels d'ARNm dans E. coli.
- Visualiser la localisation de l'ARNm en utilisant des sondes d'ADN marquées de façon fluorescente.
- Améliorer la compréhension de la variabilité transcriptionnelle entre les cellules.
Méthodes utilisées
- Cultiver E. coli MG1655 dans du milieu LB pendant une nuit.
- Diluer la culture de la nuit dans un milieu frais.
- Mesurer la densité optique pour assurer des conditions de croissance appropriées.
- Appliquer des sondes d'ADN marquées de façon fluorescente pour l'analyse smFISH.
Résultats principaux
- Marquage réussi des transcrits individuels d'ARNm.
- Visualisation de la localisation de l'ARNm dans les cellules fixées.
- Quantification des processus de transcription au niveau de la molécule unique.
- Aperçu de la variabilité entre cellules dans l'expression des transcrits.
Conclusions
- La méthode fournit une approche robuste pour étudier la dynamique de l'ARNm.
- Elle apporte des informations précieuses au domaine de la biologie des systèmes.
- Cette technique peut être appliquée à diverses questions de recherche concernant l'expression des gènes.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
