Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

L’objectif global de ce protocole est de marquer des transcrits individuels chez E.Coli pour des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour la visualisation dans des expériences FiSH à molécule unique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des systèmes, telles que la caractérisation des transcrits de cellule à cellule du champ d’intérêt. Ainsi que les transcrits de localisation de la paroi cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une quantité d’informations sur les statistiques des processus transcriptionnels. Pour commencer le protocole, cultivez E.Coli MG1655 en milieu LB pendant la nuit dans un agitateur orbital, à 260 tr/min et 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluez la culture de nuit à une à 100 dans un milieu frais et mesurez sa densité optique dans un spectrophotomètre, jusqu’à une valeur de 0,2 à 0,4.

Ensuite, granulez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 4 500 G à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant de tous les tubes. Ajoutez un millilitre de 1XPBS dans chaque tube et remettez la pastille en suspension pour minimiser l’agrégation de cellule à cellule.

Ajoutez ensuite quatre millilitres de tampon de fixation et agitez doucement le tube. Incuber les échantillons dans un agitateur orbital. Remettez la pastille en suspension afin de minimiser l’agrégation de cellule à cellule, qui peut interférer avec l’imagerie cellulaire.

Après l’incubation, granulez les cellules, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de 1XPBS. Transférez les suspensions dans des tubes de microcentrifugation à fond conique de 1,8 millilitre. Granuler les cellules par centrifugation.

Commencez la perméabilisation des bactéries en retirant soigneusement le surnageant. Utilisez des pipettes de petit volume pour retirer tout le liquide à l’extérieur de la pastille. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 300 microlitres d’eau traitée au DEPC.

Ajoutez 350 microlitres d’éthanol absolu de haute qualité et mélangez doucement la solution en inversant le tube. Ajoutez encore 350 microlitres d’éthanol et mélangez à nouveau. Ensuite, faites pivoter l’échantillon avec le rotateur de tube à 20 tr/min pendant une heure à température ambiante.

Granulez les cellules de la perméabilisation. Après la centrifugation, retirez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage à 20 % aux échantillons.

Laissez-les reposer pendant plusieurs minutes. Ensuite, les cellules à granulés sont centrifugées pendant sept minutes à 750 G et quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant très doucement et utilisez des pipettes de petit volume pour éliminer tout le liquide à l’extérieur de la pastille.

Ajoutez ensuite la solution mère du jeu de sondes d’oligonucléotides à l’aliquote du tampon d’hybridation de sorte que la concentration finale d’oligonucléotides soit de 250 nanomolaires et faites un tourbillon vigoureux dans le tube. Suspendre les échantillons dans 50 microlitres de tampon d’hybridation qui contient les sondes oligonucléotidiques, tout en évitant la génération de bulles. Laissez les échantillons toute la nuit, dans l’obscurité, sur un bloc chauffant à 30 degrés Celsius.

Pour préparer le lavage, procurez-vous un nouveau tube de micro-centrifugeuse pour chaque échantillon à imager. Ajoutez un millilitre de tampon de lavage dans chaque tube. Ajoutez 10 à 15 microlitres des échantillons hybridés dans le nouveau tube qui contient le tampon de lavage.

Granuler les cellules par centrifugation. Ensuite, retirez le surnageant. Lavez les échantillons deux fois de plus.

Remettez le granulé en suspension dans un tampon de lavage de 25 microlitres. Préparez un gel d’agarose en ajoutant 150 milligrammes d’agarose à 10 millilitres de tampon 2X SSC. Passez la solution au micro-ondes pendant 10 à 15 secondes à chaque fois, jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement.

Laissez ensuite refroidir le tube pendant quelques minutes. Ensuite, placez un cadre en silicone de séparation sur la diapositive afin que le centre de la diapositive reste exposé. Placez un anneau rigide de 10 millimètres de large et d’un à deux millimètres d’épaisseur au centre de la glissière.

Déposez une petite quantité de gel au centre pour sceller et attendez quelques minutes que le gel durcisse. Ajoutez ensuite plus de gel, jusqu’à ce qu’une forme de dôme élevé se forme. Attendez environ 10 minutes que le gel durcisse et retirez l’anneau.

Déposez 10 microlitres de cellules bactériennes de lavage sur le gel et scellez-le avec une lame de recouvrement numéro zéro. Gardez l’échantillon dans l’obscurité pour éviter le photo-blanchiment. Les mesures smFiSH des cellules E. coli montrent le niveau d’induction de galK en réponse à des concentrations variables de D-fucose extracellulaire.

Le signal de fond est représenté par une déformation supprimée galK, ou delta galK JW0740 en tant que contrôle négatif. De nombreuses taches sont observées dans la plupart des cellules. Correspond à un ou quelques transcrits galK lorsque deux millimolaires de D-fucose sont ajoutés à la culture bactérienne.

Alors que quelques taches sont observées en l’absence de D-fucose extracellulaire. Un autre exemple d’application de ce protocole est fourni par le gène sodB, avec des images de fluorescence et de contraste de phase de smFiSH dans un type sauvage ou une souche JW1648 sodB supprimée. Les échantillons préparés avec ce protocole peuvent également être imagés à l’aide de STORM, ce qui permet une précision précise des transcrits dans la cellule.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des systèmes pour explorer les statistiques des événements de transcription dans les cellules individuelles.