Unicellulaire Quantification du taux de dégradation des protéines par microscopie de Fluorescence Time-lapse en Culture cellulaire adhérente

L’objectif global de cette approche d’imagerie par fluorescence est de déterminer la demi-vie d’une protéine d’intérêt dans des cellules vivantes uniques à l’aide d’un SNAP-tag. Les protéines cellulaires sont largement renouvelées, les taux de synthèse et de dégradation étant spécifiques à chaque protéine et soumis à une régulation physiologique. Cependant, les méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer la demi-vie des protéines sont soit limitées aux moyennes de population des cellules de poux, soit nécessitent l’utilisation d’inhibiteurs de la synthèse des protéines.

Dans cette vidéo, nous montrons comment un SNAP-tag associé à la microscopie à fluorescence peut être utilisé pour mesurer les demi-vies des protéines dans les cellules vivantes. L’avantage de cette méthode est qu’elle permet d’obtenir une résolution unicellulaire, et donc d’estimer l’hétérogénéité des demi-vies dans une population de cellules cultivées. La procédure expérimentale présentée ici peut être appliquée à tout type de cellules cultivées adhérentes, exprimant une protéine d’intérêt fusionnée à un SNAP-tag.

Cela peut être réalisé soit par marquage de protéines endogènes, soit en utilisant la surexpression de protéines marquées. Le SNAP-tag est une version mutante de l’enzyme de réparation de l’ADN, l’O6-alkylguanine-ADN alkyltransférase qui réagit spécifiquement avec la benzylguanine, qui peut être couplée à des sondes moléculaires. Par conséquent, toute protéine de fusion SNAP-tag peut être marquée de manière irréversible avec un colorant perméable aux cellules de fluorescence.

Lors du lavage du colorant résiduel, la population de protéines marquées diminuera de façon exponentielle, et la demi-vie de la protéine correspondante peut être déduite. Dans cette vidéo, nous utilisons des cellules souches embryonnaires, qui forment des colonies serrées lorsqu’elles sont cultivées classiquement sur des plats enrobés de gélatine. Pour leur permettre de se développer en tant que monocouche de cellules, et ainsi d’obtenir une résolution unicellulaire pour les expériences d’imagerie de la florescence, nous les avons cultivés sur des plaques revêtues adhérentes inc, ce qui réduit les interactions de cellule à cellule médiées par l’adhésion cellulaire inc exprimée au niveau de la membrane plasmique.

Diluez l’adhérence inc recombinante à cinq nanogrammes par microlitre dans du PBS et ajoutez 30 microlitres d’adhérence inc diluée par valve dans une plaque de 96 valves, adaptée à l’imagerie. Évitez l’utilisation intensive de pipettes, car l’adhérence recombinante est très fragile. Incuber à 37 degrés pendant une heure et demie.

Aspirez la solution adhérente, lavez une fois avec 100 microlitres de PBS et ajoutez jusqu’à 200 microlitres de milieu de culture ESL pré-vermifugé. Utilisez des lignes ESL exprimant une protéine d’intérêt fusionnée à l’étiquette SNAP. Lavez les cellules avec cinq ml de PBS.

Ajoutez ensuite deux ml de Tripson et incubez pendant quatre minutes à 37 degrés. Ajouter quatre ml de milieu de culture ESL, remettre en suspension et tourner à 1000 T pendant quatre minutes. Aspirez le surnageant, mettez-le en suspension dans un milieu frais et comptez les cellules.

Placez 30 000 cellules par centimètre carré dans la plaque d’imagerie enduite adhérente. Procédez à la coloration du colorant SNAP 24 heures après la mise en place de la cellule. Diluer le colorant cellulaire dans le milieu de culture ELS à la concentration optimale préalablement déterminée.

Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et ajoutez soigneusement 50 microlitres de colorant SNAP dilué. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés. Aspirez le colorant et lavez-le trois fois avec 200 microlitres de PBS pré-vermifuge.

Ajoutez 200 microlitres de milieu de culture ESL et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés. Effectuez les étapes de lavage à l’aide d’une pipette douce et n’utilisez pas d’aspirateur automatique car les cellules ont tendance à se détacher facilement. Répétez les mêmes étapes de lavage deux fois de plus, puis ajoutez 200 microlitres de support d’imagerie.

Utilisez un milieu sans rouge de phénol pour réduire le fond de floraison. Utilisez un microscope permettant de contrôler la température et le CO2. Réglez la température à 37 degrés et le CO2 à cinq pour cent avant l’utilisation, et laissez l’équilibre pendant une à deux heures.

Placez la plaque dans le microscope et choisissez l’endroit approprié pour l’imagerie. Les images en champ clair montrent l’EEG attaché à une parabole enduite adhérente en monocouche. Sélectionnez l’objectif, un objectif 20X est approprié pour cette taille d’EEG.

Sélectionnez les paramètres d’éclairage du canal de fluorescence à enregistrer. Ajustez la puissance et l’exposition du laser pour obtenir un signal fort, car il diminuera au cours du film. Sélectionnez les paramètres d’acquisition pour l’expérience en accéléré.

Pour les protéines dont la demi-vie attendue est de deux à vingt heures, choisissez des temps d’acquisition de 12 à 24 heures avec des intervalles de temps de 15 minutes. Démarrez l’expérience d’imagerie. Utilisez le logiciel FIJI pour le traitement et l’analyse du film.

Rassemblez les images acquises sous forme de pile et déformez-la. Utilisez la fonction soustraire l’arrière-plan FIJI pour supprimer l’arrière-plan de toutes les images de la pile. Sélectionnez une cellule d’intérêt, dessinez une région d’intérêt autour d’elle à l’aide de la barre d’outils FIJI et ajoutez la région d’intérêt au gestionnaire de retour sur investissement.

Passez à l’image suivante et répétez les actions précédentes. Suivez la cellule qui vous intéresse tout au long du film et enregistrez le retour d’intérêt défini pour chaque cellule suivie. Cliquez sur mesurer pour obtenir les valeurs de l’intensité moyenne et de la surface des ROI.

Pour estimer l’arrière-plan local, ajoutez une région d’intérêt proche de la cellule d’intérêt pour chaque période. À la fin, cliquez sur mesurer pour obtenir les valeurs de l’intensité de fond moyenne. Tout d’abord, calculez l’intensité moyenne de la cellule en multipliant la valeur obtenue pour l’intensité moyenne du retour sur investissement cellulaire par sa surface.

Ensuite, procédez au calcul de la valeur d’arrière-plan intégrée de la cellule, en multipliant l’intensité moyenne de la valeur d’arrière-plan par l’aire de la valeur d’origine cellulaire. Enfin, pour obtenir une valeur corrigée de l’arrière-plan pour l’intensité intégrée de la cellule, soustrayez la valeur de l’intensité de fond intégrée de la valeur d’intensité cellulaire intégrée. Pour obtenir une demi-vie moyenne de la population cellulaire, normalisez les valeurs obtenues à la valeur d’intensité de la première image pour chaque cellule.

Cela garantit que chaque cellule contribue avec le même poids à la valeur moyenne de demi-vie, indépendamment de son intensité absolue de fluorescence. Après les divisions cellulaires, les deux cellules filles suivent séparément et additionnent leurs intensités intégrées après soustraction de fond pour tenir compte de la dilution des protéines pendant la division cellulaire. Enregistrez les jeux de retour sur investissement pour les deux cellules filles.

Pour estimer la demi-vie d’une protéine, utilisez l’outil d’ajustement de courbe dans MATLAB. La décomposition des protéines suit une exponentielle où F(x) est l’intensité de la fluorescence à un point de temps donné, a » l’intensité initiale, et b » le taux de décomposition. Après avoir obtenu les valeurs du taux de décomposition b"à partir de l’ajustement, la demi-vie peut être calculée en divisant le logarithme de deux par b"Cette vidéo montre la désintégration de la fluorescence du colorant SNAP dans une lignée cellulaire de fusion de doxycycline inutilisable ou quatre SNAP-tag.

Le signal de florescence observé dépendra de la lignée cellulaire utilisée, du niveau d’expression de la protéine d’intérêt correspondante, ainsi que des propriétés du colorant utilisé. Pour les expériences de décomposition des protéines, il est important d’utiliser une concentration adéquate de colorant SNAP. La concentration doit être suffisamment élevée pour produire un signal de fluorescence brillant au début du laps de temps.

Cependant, l’utilisation de concentrations de colorant trop élevées peut entraîner la présence de colorant résiduel dans le support, même après le lavage. Le colorant libre pourrait par la suite se lier aux molécules SNAP-tag nouvellement produites au cours du film, ce qui déformerait la courbe de décomposition. Il est donc crucial d’optimiser la concentration du colorant SNAP en testant différentes dilutions.

Cette figure montre les courbes de décomposition pour huit concentrations différentes d’un colorant SNAP de fluorescence testé sur une lignée cellulaire inutilisable de doxycycline. Une concentration initiale de colorant de trois micromolaires a été choisie selon les instructions du fabricant pour l’imagerie de cellules vivantes, et une dilution en série de un à trois a été effectuée jusqu’à atteindre une concentration de 1,4 nanomolaire. Pour les deux concentrations les plus élevées, le signal ne diminue pas, tandis que la décroissance observée suit une courbe exponentielle pour les concentrations plus faibles.

Dans cet exemple, une concentration optimale de 12 nanomolaires a été sélectionnée, car cette concentration garantit des quantités minimales de colorant résiduel restant dans le milieu après le lavage, mais le signal de fluorescence est encore suffisamment brillant pour observer une courbe de décomposition claire. Le protocole décrit fournit une estimation de la variabilité et de la demi-vie d’une cellule à l’autre pour une protéine donnée fusionnée à SNAP-mark. Cette figure montre les désintégrations de cellules uniques et la moyenne de la population pour trois lignées cellulaires de fusion SNAP-tag inutilisables de doxycycline.

Nanog et Oct4 ont une durée de vie plutôt courte, avec des demi-vies moyennes de 2,9 et 4,8 heures. Alors que Srsf11 "a une durée de vie plus longue, avec une demi-vie moyenne de 25,3 heures. Les boîtes à moustaches montrent la distribution des demi-vies pour les trois protéines.

Nous avons montré que l’utilisation d’un SNAP-tag, en combinaison avec la microscopie à intervalle de florescence, permet de déterminer la demi-vie de toute protéine d’intérêt. Les mesures de la désintégration d’une seule cellule fournissent une estimation de l’hétérogénéité des demi-vies dans une population de cellules, ce qui est omis lors de l’utilisation d’autres méthodes pour déterminer les demi-vies des protéines. L’une des étapes les plus cruciales lors de l’utilisation d’un SNAP-tag pour surveiller la décomposition des protéines est de s’assurer qu’aucun colorant résiduel non lié n’est laissé dans le milieu ou dans les cellules après le lavage.

Sinon, il pourrait se lier à des molécules SNAP-tag nouvellement produites plus tard au cours de l’expérience et compromettre ainsi la courbe de désintégration. Ceci est réalisé d’une part en effectuant soigneusement toutes les étapes de lavage décrites. D’autre part, la concentration de colorant SNAP doit être maintenue aussi basse que possible tout en restant dans une plage qui permet d’obtenir un bon rapport signal sur bruit.

La concentration du colorant SNAP doit être optimisée pour chaque expérience en fonction de la lignée cellulaire et du type de colorant utilisé. Bien qu’il soit possible que le SNAP-tag puisse modifier la demi-vie des protéines candidates dans certains cas, nous ne voyons aucune preuve de tels effets, car les demi-vies déterminées du test des protéines candidates adhèrent à des valeurs publiées étroitement adaptées. Pour exclure davantage un effet du SNAP-tag sur la dégradation des protéines, une option serait de bloquer la synthèse des protéines avec du cycloheximide et d’effectuer des transferts aux toilettes à différents moments, en utilisant un anticorps qui reconnaît la protéine indigène.

Et de comparer directement la désintégration de la protéine candidate SNAP-tag avec la version indigène non marquée.