Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

L'objectif général de ce protocole est d'identifier et d'éliminer l'activité de nucléase contaminante au cours de la purification d'une protéine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la rétrovirologie, telles que la biochimie, la structure et la dynamique de l'intégration. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'identifier et de supprimer l'activité de nucléase ADN contaminante provenant d'une protéine recombinante d'intérêt pendant la purification.

Commencez par décongeler un culot de E.coli exprimant l'intégrase du virus foamy prototype sur de la glace. Utilisez un sonicateur équipé d'une sonde de 0,5 pouce de diamètre avec une micro-pointe conique de 0,125 pouce de diamètre pour soniquer pendant 30 secondes à une amplitude de 30 %, le tube étant placé sur de la glace. Après la sonication, transférez l'échantillon cellulaire dans un tube de centrifugation ultracentrifuge prérefroidi et centrifugez à 120 000 ×g pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, un culot bien visible doit être présent, et le surnageant peut présenter une couleur jaune. Transférez le surnageant dans un tube conique froid de 50 millilitres. Ensuite, préparez la colonne FPLC de 110 millimètres de longueur et de 5 millimètres de diamètre, contenant une résine chargée en nickel de 1,5 millilitre.

Commencez par raccorder la colonne à l'appareil de FPLC et appliquez le tampon. L'appareil doit enregistrer en temps réel les données de conductivité et d'absorbance UV à 280 nanomètres. Les mesures de conductivité et d'absorbance UV doivent se stabiliser.

Si nécessaire, continuez à faire circuler les tampons à travers la colonne jusqu'à ce que les mesures soient stables. À l'aide d'une boucle d'injection, chargez l'échantillon protéique sur la colonne à un débit de 0,15 millilitre par minute avec une pression maximale de 0,5 mégapascal. Fixez la boucle d'injection à la FPLC AKTA.

Après avoir lavé la colonne et élué les protéines, prélevez des aliquotes de 15 microlitres du flux initial, du lavage et des fractions présentant un pic d'absorbance à 280 nanomètres, puis ajoutez 15 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS-PAGE 2X à chaque échantillon. Portez les échantillons à ébullition pendant trois minutes. Chargez 10 microlitres de chaque échantillon sur des gels SDS-PAGE 10 %, ainsi que 4 microlitres d'étalons protéiques pré-colorés.

Inspectez visuellement le gel afin d'identifier les fractions qui semblent contenir une intégrase du prototype du virus foamy presque pure. Combinez ces fractions et notez le volume lors du pipetage. Ce volume est généralement de huit à dix millilitres.

À l'aide d'un spectrophotomètre, mesurez l'absorbance UV à 280 nanomètres des fractions combinées et calculez la quantité totale de protéine d'intégrase du virus foamy prototype. Un rendement typique est d'environ 10 milligrammes par litre de culture induite. Pour éliminer la marque hexahistidine, ajoutez à l'intégrase du virus foamy prototype une concentration finale de 10 millimolaire de DTT et de 0,1 millimolaire d'EDTA.

Ensuite, ajouter 15 microgrammes de protéase 3C du rhinovirus humain par milligramme d'intégrase du virus foamy prototype, et incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Pour réaliser la fractionnement par chromatographie d'affinité à l'héparine de l'intégrase du virus foamy prototype, réduire la concentration en chlorure de sodium de l'échantillon à 200 millimolaire en ajoutant 1,5 volume du tampon C. Charger ensuite l'échantillon dilué d'intégrase du virus foamy prototype sur la colonne d'héparine Sepharose à un débit de 0,5 millilitre par minute, avec une limite de pression maximale d'un mégapascal. Après avoir lavé la colonne et collecté le gradient et le lavage final, analyser les fractions de charge, d'écoulement, de lavage et les fractions par électrophorèse SDS-PAGE 8 %.

Ensuite, évaluer les fractions en colorant le gel avec du bleu de Coomassie. L'intégrase du virus foamy prototype et la nuclease contaminante présentent des affinités différentes pour la chromatographie sur héparine Sepharose. Identifier les fractions d'héparine Sepharose qui semblent contenir une intégrase du virus foamy prototype presque pure afin de les utiliser dans le dosage de la nuclease.

Pour commencer le dosage de nucléase, mélanger trois microlitres de fraction d’héparine et 50 nanogrammes d’ADN plasmidique superenroulé de trois kilobases avec le tampon de réaction jusqu’à un volume final de 15 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Arrêter la réaction avec une protéinase K à un milligramme par millilitre et du SDS à 0,5 %, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, ajouter 3,5 µL de colorant de charge 6X aux réactions de dosage des nucléases, puis charger tout le volume sur un gel d'agarose à 1 %. Faire migrer le gel à 100 volts à température ambiante pendant une heure ou jusqu'à ce que le front de colorant atteigne l'extrémité du gel. Une fois l'électrophorèse terminée, l'image du gel obtenue avec un scanner fluorescent doit montrer que l'ADN linéaire migre conformément à sa taille de trois kb, que l'ADN en forme de cercle superenroulé migre plus rapidement vers environ deux kb, et que l'ADN en forme de cercle relâché migre plus lentement, proche de 3,5 kb.

À l'aide d'un logiciel d'analyse d'image, calculez le volume en pixels des plasmides sous forme superenroulée, linéaire et circulaire relâchée dans chaque piste. Appelez la somme des volumes en pixels de ces trois formes d'ADN la valeur totale d'ADN, et utilisez-la pour calculer le pourcentage de formes linéaires et circulaires relâchées. Les fractions contenant des nucléases contaminantes présentent un pourcentage plus élevé de formes linéaires et circulaires relâchées par rapport au témoin négatif.

Combiner les fractions d'héparine Sepharose ne présentant aucune activité de nuclease contaminante, puis les transférer dans un tube de dialyse de 10 millimètres, avec une coupure moléculaire de six à huit kilodaltons. Effectuer la dialyse à quatre degrés Celsius pendant une nuit contre un litre de solution de dialyse. Le jour suivant, récupérer l'échantillon d'intégrase du virus foamy prototype exempt de nuclease à partir du tube de dialyse.

Mesurez l'absorbance à 280 nanomètres et calculez la concentration finale en protéine. Répartissez la protéine en aliquotes et congélez rapidement dans l'azote liquide. Conservez ensuite les aliquotes à moins 80 degrés Celsius.

Le test d'activité nuclease a été réalisé comme décrit dans cette vidéo. Les contrôles négatifs comprennent l'ADN plasmidique sans protéine et une purification antérieure de l'intégrase sauvage du virus foamy prototype, connue pour être dépourvue de nuclease. Un contrôle positif pour une activité nuclease contaminante est une purification antérieure de l'intégrase catalytiquement inactive du virus foamy prototype, connue pour contenir une nuclease contaminante.

Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des dosages biochimiques ou l'imagerie de molécules uniques, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la cinétique et la dynamique enzymatique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'identifier et d'éliminer l'activité nuclease contaminante d'une protéine recombinante.