Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

L’objectif global de cette méthode est la transfection stable d’hépatocytes in vivo, avec des constructions vectorielles pour l’expression de gènes inductibles ou d’ARNsh. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le foie. Par exemple, il peut être appliqué pour étudier les mécanismes du cancer du foie et de sa régénération.

Le principal avantage de cette technique est l’expression combinée de CreER avec une expression inductible du shRNA transgène R dans les hépatocytes de souris in vivo, obtenue par injection hydrodynamique de la veine de la queue. La démonstration de la procédure sera assurée par Eric Hubner, un étudiant en médecine de notre laboratoire. Commencez par combiner 150 nanogrammes de vecteur d’entrée contenant l’ARN en épingle à cheveux court pour la protéine ciblée avec 150 nanogrammes de vecteur pTC Tet et de tampon TE pour un volume total de huit microlitres.

Transférez ensuite le mélange d’enzymes clonase LR II dans de la glace et incubez pendant deux minutes. Vortex deux fois pendant l’incubation. Ajoutez ensuite deux microlitres d’enzyme clonase LR mix II à la réaction et incubez à 25 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, arrêtez la réaction en ajoutant un microlitre de solution de protéinase K. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius pendant dix minutes. Ensuite, transformez les bactéries compétentes de Stbl3 avec deux microlitres de mélange de clonage en utilisant un protocole de choc thermique standard.

Après le placage de la transformation sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline, incuber à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, choisissez des colonies individuelles et inoculez de petits volumes de milieu de croissance bactérienne pour l’incubation pendant la nuit. Après avoir isolé l’ADN et confirmé l’intégrité du vecteur par séquençage de Sanger, préparer des préparations d’ADN à grande échelle de la construction pour l’injection.

Commencez par peser les souris. Préparez ensuite une solution saline stérile contenant 15 microgrammes par millilitre de vecteur Sleeping Beauty sans endotoxines et un microgramme par millilitre de pchsB5 sans endotoxines. Préparez suffisamment de solution pour injecter à chaque souris un volume correspondant à 10 % de son poids corporel.

Remplissez une seringue stérile de 3 millilitres avec le volume requis pour une souris et fixez-y une aiguille de calibre 27. Après avoir ajouté une quantité appropriée de papier de soie pour laisser un minimum d’espace pour le mouvement mais suffisamment d’espace pour respirer, insérez la souris dans un dispositif de retenue approprié avec des trous de respiration. Réchauffez la queue à l’aide d’une lampe infrarouge pendant 30 à 60 secondes tout en surveillant attentivement les signes de surchauffe tels que le mouvement rapide de la queue ou d’autres signes d’agitation.

Nettoyez ensuite la queue avec un tampon imbibé d’alcool. Insérez l’aiguille presque horizontalement dans l’une des deux veines latérales de la queue près de la base de la queue. S’il est placé avec succès, une petite quantité de sang peut refluer dans le cône de l’aiguille.

Injectez le volume total dans la veine de la queue en huit à dix secondes. Après l’injection, retirez immédiatement la souris de la retenue. Compressez la plaie d’injection avec de la gaze stérile pendant au moins 30 secondes ou jusqu’à ce que tout saignement disparaisse.

Une injection hydrodynamique réussie de la veine caudale est cruciale pour la transfection et dépend surtout de la vitesse, du volume et du temps d’injection. Pour faciliter l’injection intraveineuse, assurez-vous que les souris ne sont pas stressées ou déshydratées le jour de l’injection. Après 30 à 60 minutes de logement en solo dans une cage de récupération, transférez la souris dans sa cage d’origine.

Amorcer l’induction de la Cre recombinase 10 à 15 jours après l’injection dans la veine caudale pour permettre l’élimination des vecteurs non intégrés. Dissoudre dix milligrammes de tamoxifène dans 40 microlitres d’éthanol et incuber à 55 degrés Celsius pendant dix minutes en secouant. Agitez plusieurs fois jusqu’à ce que le tamoxifène soit dissous.

Ajoutez ensuite 960 microlitres d’huile de maïs et incubez pendant cinq minutes à 55 degrés Celsius. Après refroidissement, aspirez la solution dans une seringue à insuline de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 20. Passez ensuite à une aiguille de calibre 27.

Pour injecter, écorchez d’abord la souris en saisissant soigneusement le cou de la souris avec le pouce et le deuxième doigt, en fixant la queue entre la base de la main et le quatrième et le cinquième doigt. Ensuite, injectez par voie intrapéritonéale 0,1 millilitre de la solution dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen. Pour les expériences de moins de dix jours, administrer continuellement de la doxycycline dans l’eau potable en suivant le protocole suivant.

Tout d’abord, dissolvez cinq grammes de saccharose dans 100 millilitres d’eau du robinet et d’autoclave. Dissoudre ensuite 100 milligrammes d’hyclate de doxycycline dans cinq millilitres de solution de saccharose dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une seringue de 10 millilitres pour filtrer stérilement la solution à travers un filtre de 0,2 micron.

Ajoutez ensuite la solution de doxycycline filtrée aux 95 millilitres restants de solution de saccharose et fournissez la solution à la souris au lieu de boire de l’eau. Vérifiez quotidiennement et remplacez-la immédiatement si la solution devient trouble, car cela indique une prolifération bactérienne. Préparez une seringue de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 27 avec un millilitre de solution de paraformaldéhyde à 4 %.

Utilisez des ciseaux de dissection et une pince anatomique pour effectuer une laparotomie médiane et exposer le foie de la souris euthanasiée. Déplacez l’intestin grêle vers la droite pour exposer la veine porte et la veine cave inférieure. Insérez l’aiguille de la seringue préparée dans la veine cave inférieure et coupez la veine porte.

Injectez lentement un millilitre de PFA pour profuser le tissu hépatique et éliminer les globules rouges autofluorescents. Après avoir retiré le foie, rincez-le à l’eau et transférez-le dans cinq à dix millilitres de solution PFA à 4 % pour post-fixer avant la section. L’injection d’une construction de transposon qui combine l’expression constitutive d’une recombinase Cre inductible avec l’expression inductible d’un transgène ou d’un shRNA de choix chez des souris rapporteures Cre a montré une expression robuste du gène rapporteur GFP après l’activation de la recombinase Cre par le tamoxifène.

Après un traitement à la doxycycline, l’expression inductible du transgène peut être visualisée par des anticorps appropriés dans les hépatocytes transfectés. Pour l’expression inductible de shRNA, l’expression cytoplasmique de la GFP détectée par immunomarquage peut être utilisée comme marqueur de substitution pour l’expression de shRNA. Une construction de transposon hébergeant une cassette d’expression de la luciférase sous le contrôle d’une construction promotrice spécifique du foie a été injectée.

Après l’injection de luciférine, les souris ont été imagées à l’aide d’un système d’imagerie in vivo deux semaines après l’injection hydrodynamique de la veine caudale. L’imagerie a montré une bioluminescence de la luciférase robuste et stable dans le foie 15 jours après l’injection, démontrant que le système peut être utilisé avec succès pour suivre la présence de cellules transfectées in vivo par imagerie par bioluminescence. Une fois maîtrisées, les injections hydrodynamiques de la veine caudale peuvent être effectuées en 15 minutes environ, tandis que l’ensemble de la procédure, du clonage de notre injection de souris, de l’induction de l’expression du transgène R shRNA à la préparation du foie, prendra environ trois à quatre semaines.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit la taille et l’intégrité de la séquence des plasmides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer le système pTC Tet avec votre transgène R shRNA de votre choix à n’importe quel modèle de souris Crelux Pbase.