Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation
8 décembre 2017
Ici, nous présentons un protocole pour la culture 3D du rat encéphales gliales, y compris les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Nous démontrons la culture cellulaire primaire, synthèse de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) hydrogel, HAMAphoto-polymérisation et le cell encapsulation et traitement d’imagerie microscopique confocal et balayage électronique des échantillons.
L’objectif global de ce protocole de culture cellulaire 3D est de modéliser l’événement cicatriciel glial du système nerveux central à l’aide de cellules indicatrices clés : microglie, astrocytes et oligodendrocytes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuro-inflammation, telles que le potentiel des cellules gliales à améliorer les stratégies de régénération et à démêler la cicatrice gliale. Le principal avantage de cette technique est que la biologie gliale peut être rapidement caractérisée dans un micro-environnement 3D avec des manipulations systématiques et à haut débit. Pour préparer les lamelles de recouvrement pour l’ensemencement, commencez par ajouter un millilitre de méthacrylate de 3-propyle à 49 millilitres d’eau distillée pour obtenir une solution à 2 %. Placez ensuite des lamelles en verre de 18 millimètres dans la solution et basculez-les pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, rincez les lamelles en trempant en série chaque lamelles dans trois béchers de 100 millilitres d’eau déminéralisée. Ensuite, séchez les lamelles de couverture sous vide avec un dessiccateur et un four à 40 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, à l’aide d’une pince, immergez rapidement les lamelles individuelles dans de l’éthanol à 70 %. Ensuite, sans sécher, déposez chaque lame de couvercle dans un puits d’une plaque de 12 puits. Ensuite, lavez chaque puits avec un millilitre d’eau déminéralisée stérile. Ajoutez ensuite un millilitre de poly stérile
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Aperçu
Cet article présente un protocole pour la culture 3D de cellules gliales issues du cerveau de rat, incluant les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes. Il décrit en détail les procédés de culture cellulaire primaire, de synthèse d'hydrogel et de techniques d'imagerie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les systèmes de culture cellulaire en 3D sont essentiels pour l'étude des cellules gliales.
- Les cellules gliales issues du cerveau de rat jouent un rôle crucial en neurobiologie.
- Les hydrogels offrent un environnement favorable à la croissance cellulaire.
- Les techniques d'imagerie sont essentielles pour analyser la morphologie cellulaire.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole fiable pour la culture de cellules gliales en 3D.
- Approfondir la compréhension des interactions entre cellules gliales.
- Faciliter l'imagerie avancée des cellules cultivées.
Méthodes utilisées
- Culture primaire de cellules gliales dérivées du cerveau de rat.
- Synthèse d'hydrogel d'acide hyaluronique méthacrylé (HAMA).
- Photo-polymérisation du HAMA pour l'encapsulation cellulaire.
- Traitement des échantillons pour la microscopie confocale et électronique à balayage.
Résultats principaux
- Encapsulation réussi de cellules gliales dans un hydrogel HAMA.
- Viabilité et fonctionnalité démontrées des cellules cultivées.
- Obtention d'images de haute qualité de la morphologie cellulaire.
- Le protocole fournit une base pour des études futures sur les cellules gliales.
Conclusions
- Le protocole développé est efficace pour la culture tridimensionnelle des cellules gliales.
- Cette méthode peut être appliquée à divers domaines de recherche en neurosciences.
- Des études futures pourront s'appuyer sur ce cadre pour des investigations avancées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La modélisation de processus neuroinflammatoires dans un environnement tridimensionnel physiologiquement pertinent permet une réduction mécanistique des risques associés aux thérapeutiques ciblant les cellules gliales. Cette approche renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en reproduisant la formation de la cicatrice gliale, une caractéristique pathologique clé des lésions du système nerveux central et de la neurodégénérescence. La méthode facilite la continuité translationnelle du stade de découverte à l'évaluation préclinique en offrant un système pertinent pour le dépistage de composés immunomodulateurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les interactions entre les cellules gliales dans un microenvironnement tridimensionnel afin de préciser les mécanismes pathogènes de la neuroinflammation.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des microglies, des astrocytes et des oligodendrocytes comme cibles thérapeutiques dans les troubles du système nerveux central.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les cibles en modélisant la formation de la cicatrice gliale, un facteur clé de la cytotoxicité et de l'altération de la régénération.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une plateforme standardisée et reproductible pour la préparation de biomatériaux hydrogélifiés chargés de cellules gliales destinés au criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Permet l'évaluation quantitative des réponses gliales par imagerie confocale et au microscope électronique à balayage, facilitant la mise au point de tests.
- Extensibilité : Compatible avec la manipulation en haut débit et la modification de substrats bioactifs pour l'optimisation des dosages.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les travaux précliniques en modélisant un système pertinent de formation de la cicatrice gliale.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Permet d'évaluer les effets des composés sur l'activation gliale et la maturation de la cicatrice, orientant ainsi leur développement avec un risque ajusté.
- Alignement sur les biomarqueurs : Permet d'évaluer la morphologie et la réactivité gliales comme biomarqueurs translationnels de la réponse neuroinflammatoire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs et aux études précliniques, en fournissant un système de culture gliale en 3D qui modélise la pathologie neuroinflammatoire.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les voies inflammatoires médiées par les cellules gliales et les interactions cellulaires dans un environnement biomimétique.
- Criblage : Permet la standardisation des tests et des mesures quantitatives pour évaluer les effets immunomodulateurs sur le phénotype et la fonction des cellules gliales.
- Analytique : Fournit des images haute résolution par microscopie confocale et MEB afin de quantifier la morphologie, la distribution et les états d'activation cellulaires.
- Recherche translationnelle : Relie la modulation précoce des cibles gliales aux résultats précliniques en reproduisant un processus pathologique clé des lésions et maladies du système nerveux central.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme hydrogel réutilisable pour des modèles d' neuroinflammation chronique et aiguë dans divers projets de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à une compréhension mécanistique de la formation de la cicatrice gliale et des cascades neuroinflammatoires.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité des cultures gliales en 3D pour des expérimentations cohérentes entre équipes.
- Valeur stratégique : Décisions améliorées d'aller ou de ne pas aller de l'avant en réduisant l'ambiguïté biologique liée à l'engagement des cibles gliales et à la modulation des voies.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des thérapeutiques du SNC fondée sur l'efficacité dans la modulation des réponses gliales dans un système pertinent pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences en isolement de cellules gliales primaires, en synthèse d'hydrogels et en techniques de culture 3D sont requises.
- Les équipements comprennent des systèmes de photopolymérisation UV, des microscopes confocaux et des microscopes électroniques à balayage pour la caractérisation.
- La standardisation entre équipes exige une formulation d'hydrogel, une densité d'ensemencement cellulaire et des protocoles d'imagerie cohérents.
- L'adaptation à d'autres sources de cellules gliales ou à des modèles de maladies peut nécessiter une optimisation de la rigidité de l'hydrogel et du revêtement bioactif.
- Les limites pratiques incluent la variabilité du rendement des cellules primaires et la nécessité d'une technique aseptique durant les étapes d'encapsulation et de polymérisation.
