Fabrication de puits d’Agarose personnalisé pour l’ensemencement de la cellule et l’anneau de tissu auto-assemblage à l’aide de moules 3D-imprimé

L’objectif global de cette procédure est de créer des moules d’ensemencement de cellules personnalisés qui sont utilisés pour fabriquer des anneaux de tissus auto-assemblés de différentes dimensions. Cette méthode nous permet de créer des anneaux tissulaires tridimensionnels à partir de cellules humaines qui peuvent être utilisés pour évaluer la structure, la force et la fonction des tissus. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple pour fabriquer des moules pour des tissus auto-assemblés avec des dimensions personnalisées.

Pour commencer la procédure, utilisez un logiciel de conception assistée par ordinateur pour créer un dessin d’un moule aux dimensions souhaitées. Envoyez le fichier CAO vers une imprimante 3D haute résolution. Imprimez le moule dans un plastique avec une finition brillante stable à 50 degrés Celsius.

Lavez soigneusement le moule imprimé avec une brosse, un détergent et de l’eau. Rincez le moule à l’eau distillée et laissez-le sécher à l’air libre dans une grille. Il est important de choisir un plastique imprimé en 3D qui est stable à la température de durcissement du PDMS.

Les résidus qui se transfèrent sur le PDMS pendant le chauffage peuvent affecter la formation d’anneaux. Ensuite, mesurez 25 grammes de base PDMS dans un bateau de pesée jetable. Ajouter l’agent de durcissement dans un rapport de 1:10 en poids et remuer vigoureusement jusqu’à ce que la base et l’agent de durcissement soient bien mélangés.

Ensuite, fixez du ruban adhésif de laboratoire sur les côtés du moule pour former une paroi d’environ un centimètre de haut autour du visage avec les puits imprimés. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’espace dans la paroi du ruban. Versez le mélange PDMS dans le moule imprimé en 3D.

Dégazez le PDMS dans une chambre à vide pendant 30 à 60 minutes ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles. Faites durcir le PDMS à 50 degrés Celsius pendant deux à quatre heures ou jusqu’à ce que le PDMS soit suffisamment solide pour être retiré du moule. Ensuite, retirez le ruban adhésif et séparez soigneusement le négatif PDMS du moule.

Incuber le négatif PDMS dans un four à 60 degrés Celsius pendant une heure pour s’assurer qu’il est complètement durci. Ensuite, lavez soigneusement le négatif avec un détergent et de l’eau. Rincez le moule à l’eau distillée et laissez-le sécher à l’air.

Avant de fabriquer le moule à agarose, autoclavez le négatif PDMS, une paire de pinces émoussées et tout autre outil souhaité. Pour commencer la fabrication, préparez et autoclavez au moins 50 millilitres d’agarose à deux pour cent dans du DMEM. Préparez les puits d’agarose un jour avant l’ensemencement annulaire.

Pipetez quatre millilitres d’agarose fondu dans le négatif PDMS autoclave, en prenant soin de ne pas trop remplir le moule. Ensuite, pipetez l’agarose fondue dans les cavités des poteaux de puits d’agarose. Utilisez la pointe de la pipette pour éliminer toutes les bulles d’air.

La surface finale de l’agarose doit être plane. Laisser refroidir l’agarose pendant environ 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pince émoussée, séparez soigneusement le moule d’agarose refroidi du négatif PDMS.

Placez le moule face vers le haut dans un puits d’une assiette à six puits. Ajoutez le milieu de culture complet approprié dans le puits de la plaque afin que les puits d’agarose soient complètement immergés. Équilibrez les puits d’agarose à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant utilisation.

Tout d’abord, dans une boîte de culture de 15 centimètres, cultivez des cellules musculaires lisses aortiques de rat à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % jusqu’à ce que 70 % de confluence soit atteinte. Une fois que la moisissure d’agarose souhaitée a été préparée et équilibrée pendant la nuit, rincez deux fois la boîte de culture avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Après avoir retiré le PBS, ajoutez trois millilitres de tripzine à 0,25 pour cent dans le plat.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient détachées de la boîte. Neutralisez le tripzine avec trois millilitres du milieu de culture complet. Transférez les cellules dans un tube conique et pipetez doucement les cellules jusqu’à ce qu’elles soient complètement remises en suspension.

Diluez un aliquat de la suspension cellulaire avec un volume égal de colorant bleu trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, centrifugez la suspension à 200 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de culture complet pour atteindre une concentration de 10 millions de cellules par millilitre.

Les étapes les plus importantes pour assurer une formation uniforme d’anneaux sont l’optimisation du nombre de cellules et du milieu de culture pour la lignée cellulaire que vous utilisez. Ensuite, obtenez les puits d’agarose équilibrés. Aspirez soigneusement tout le milieu à la fois autour de l’extérieur de l’agarose et à l’intérieur des puits d’agarose, en prenant soin de ne pas percer le fond des puits.

Pipeter 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits. Ajoutez deux millilitres de milieu frais autour de l’extérieur des puits d’agarose sans laisser le milieu se déverser dans les puits. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 5 % de CO2 pour permettre aux cellules de s’agréger.

Ensuite, aspirez le milieu de l’extérieur de l’agarose. Ajoutez 4,5 millilitres de milieu frais dans le puits de l’assiette afin que les puits d’agarose soient remplis et que tout le moule d’agarose soit complètement immergé. Continuez à incuber la plaque jusqu’à ce que les anneaux tissulaires soient suffisamment développés, en remplaçant le milieu chaque jour.

Ensuite, faites glisser doucement chaque anneau de tissu de son poteau à l’aide d’une pince. Immédiatement, fixez les anneaux pour l’histologie ou utilisez les anneaux pour des évaluations fonctionnelles ou mécaniques. L’impression 3D a permis une conception de moules plus flexible.

Les diamètres des tenons étaient facilement variés, comme le montrent mes anneaux de cellules musculaires lisses de rat fabriqués autour de tenons de deux, quatre et douze millimètres de diamètre. Des anneaux tissulaires ont également été préparés à partir de CML humaines primaires, de cellules souches mésenchymateuses humaines et de CML dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Les anneaux ont été utilisés comme modèles tissulaires in vitro pour l’évaluation de la fonction tissulaire et de la résistance mécanique.

Bien que cette méthode ait été conçue à l’origine pour fabriquer et modéliser des tissus vasculaires, elle peut également être utilisée pour fabriquer des segments d’autres types de tissus, tels que le cartilage, les muscles squelettiques et les tissus cardiaques. Cette méthode offre aux chercheurs un moyen simple de créer des moules personnalisés pour fabriquer des anneaux de tissu 3D de différentes dimensions. Ces anneaux peuvent être utilisés pour évaluer la structure, les propriétés mécaniques et la fonction de tissus modifiés fabriqués à partir de différents types de cellules.