Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

L’objectif global de ce système est de permettre l’observation facile des rapporteurs bioluminescents dans un large éventail de conditions extracellulaires, y compris sous une perfusion constante de milieux. Cette méthode peut être utilisée pour observer longitudinalement la bioluminescence à partir de cellules et de tissus cultivés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’enregistrer à partir de cellules dans des conditions variables de milieux extracellulaires et de gaz, ce qui n’est pas possible dans la plupart des systèmes existants.

Bien que nous démontrions ici cette technique dans le contexte d’expériences sur le rythme circadien, elle pourrait facilement être appliquée à d’autres systèmes nécessitant une bioluminescence ou un enregistrement fluorescent sur des échelles de temps allant de quelques jours à quelques semaines. Pour commencer la procédure, ensemencez les cellules cultivées dans des boîtes ou des plaques de culture tissulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les monocouches aient atteint 100 % de confluence.

Immédiatement avant l’expérience, utilisez un incubateur cycliste contrôlé par ordinateur pour alterner entre 32 et 37 degrés Celsius toutes les 12 heures pendant un minimum de 72 heures afin de synchroniser les rythmes cellulaires. Une synchronisation robuste des oscillations circadiennes cellulaires à l’intérieur et entre les cultures est cruciale pour la reproductibilité expérimentale. Nous y parvenons en appliquant des cycles de température quotidiens avant chaque enregistrement qui synchronisent les cellules en imitant les rythmes de température corporelle.

Alternativement, la synchronisation pharmacologique peut également être très efficace. Ensuite, combinez 8,3 grammes de poudre de DMEM à haute teneur en glucose avec 900 millilitres d’eau ultra-pure. Remuez la solution pendant 30 minutes pour dissoudre complètement la poudre.

Ensuite, ajoutez à la solution 50 millilitres de solution de glucose de 100 grammes par litre, 20 millilitres de pH 7,6, une solution molaire de MOPS et 10 millilitres de solution de 100 fois de pénicilline streptomycine. Remuez le mélange pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 4,7 millilitres d’une solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % et remuez le mélange pendant cinq minutes de plus.

Utilisez de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,6 à température ambiante. Ajoutez de l’eau ultrapure à la solution pour obtenir un volume final d’un litre. Filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,22 micromètre dans une fiole stérile.

Conservez le milieu filtré à quatre degrés Celsius. Immédiatement avant d’effectuer l’expérience, complétez la quantité souhaitée de milieu mère avec 10 % de sérum, deux millimolaires de GlutaMAX, 2 % de NS21 et un millimolaire de luciférine. Passez le fluide de travail obtenu à travers un filtre stérile de 0,22 micromètre.

Utilisez une solution à cinq molaires de chlorure de sodium pour ajuster l’osmolalité du milieu de travail à 350 milliosmoles. Ensuite, réchauffez le milieu à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Ensuite, pour commencer à faire la mise au point de la caméra de l’incubateur de bioluminescence, dévissez le filtre à densité neutre chauffé imperméable à l’eau.

Dans le logiciel de l’instrument, réglez le temps d’exposition sur 0,2 seconde et le temps de cycle cinétique sur 0,3 seconde. Vérifiez que le gain multiplicateur d’électrons est désactivé, puis fermez la fenêtre de configuration et démarrez l’enregistrement vidéo. Utilisez le cylindre de mise au point pour faire pivoter l’objectif de l’appareil photo jusqu’à ce que les éléments de test sur l’étagère d’échantillon appropriée soient clairement nets.

Ensuite, arrêtez l’enregistrement vidéo. Remplacez le filtre à densité neutre et retirez les éléments de test. Ensuite, utilisez le panneau de commande situé à l’avant de l’incubateur de bioluminescence pour régler les niveaux d’oxygène, de dioxyde de carbone et de température souhaités pour l’expérience.

Pour une expérience humidifiée, remplissez le bac à eau à la base de l’incubateur. Retirez les cellules de l’incubateur de culture tissulaire et remplacez le milieu de culture par le milieu de travail préchauffé. Pour les expériences humidifiées utilisant de petits volumes, scellez les plaques avec un film ou du ruban adhésif perméable aux gaz.

Placez les plaques dans l’incubateur bioluminescent. Fermez l’incubateur et fixez le couvercle de la porte pour exclure la lumière du système. Ensuite, dans le logiciel de l’instrument, réglez le mode d’acquisition sur cinétique.

Réglez le temps d’exposition souhaité. Réglez les accumulations à un, la durée de la série cinétique au nombre souhaité de cycles d’acquisition et le temps du cycle cinétique à l’intervalle d’imagerie souhaité. Réglez une vitesse de changement de vitesse de 4,33 microsecondes, un gain de un et un gain EM du niveau souhaité.

Ensuite, définissez le type de fichier d’enregistrement automatique sur sif ou tiff. Nommez le fichier d’enregistrement automatique et définissez son chemin d’accès. Définissez le type de fichier de spoule sur sif ou tiff.

Nommez la pile de fichiers et définissez son chemin d’accès. Fermez la fenêtre de configuration et commencez à enregistrer les données. Une fois la collecte des données terminée, importez la pile d’images acquise dans un logiciel de traitement d’images.

Ajustez la luminosité et le contraste pour une visualisation optimale de la bioluminescence. Ensuite, sélectionnez les régions d’intérêt et exportez le signal moyen pour les zones sélectionnées. Copiez les données dans un logiciel d’analyse pour un traitement ultérieur.

Pour commencer l’expérience, des cellules d’amorçage sur des lames monocanal avec des connecteurs Luer et une profondeur de canal de 0,6 ou 0,8 millimètre. Cultivez et entraînez les cellules. Préparez et réchauffez un milieu de perfusion DMEM à faible teneur en glucose tamponné à l’hydrogénocarbonate.

Ensuite, coupez cinq sections de deux centimètres de tube en silicone d’un diamètre intérieur d’un millimètre. Découpe de tubes d’éthylène tétrafluoroéthylène d’un millimètre de diamètre intérieur de 1,2 mètre, 10 centimètres et 30 centimètres. Stérilisez la tubulure avec de l’éthanol à 70 % et rincez la tubulure avec du PBS stérile.

Utilisez le tube en silicone stérilisé pour connecter le tube ETFE de 1,2 mètre à un connecteur Luer femelle stérile et à un connecteur Luer coudé stérile. Utilisez cet ensemble pour connecter la seringue de moyen de perfusion à une lame de canal Luer vide. Ensuite, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu de perfusion préchauffé.

Remplissez une seringue stérile de 20 millilitres avec un milieu de perfusion préchauffé. Montez le tube ETFE de 10 centimètres avec des connecteurs Luer à l’aide du tube en silicone et connectez le tube à la glissière. Rincez trois à cinq millilitres de milieu de perfusion à travers la tubulure et la glissière du canal.

Ensuite, installez le tube ETFE de 30 centimètres sur la glissière du canal contenant la cellule. Connectez l’extrémité libre du tube ETFE de 10 centimètres à l’autre extrémité de la lame du canal cellulaire pour former le système de perfusion complet. Rincez un millilitre de milieu de perfusion à travers le tube et les lames pour éviter les bulles d’air.

Transportez le système de perfusion vers l’incubateur de bioluminescence. Fixez la seringue remplie de fluide de perfusion dans un pousse-seringue en prenant soin de ne pas déconnecter la tubulure. Utilisez le pousse-seringue pour injecter un millilitre de fluide de perfusion à travers le système de perfusion.

Entrez le diamètre de la seringue sur la pompe et réglez le débit sur 50 microlitres par heure. Il est crucial qu’il n’y ait pas de bulles dans le système de perfusion au début de l’expérience, car celles-ci peuvent perturber le signal de bioluminescence. Démarrez la pompe et fermez immédiatement la porte de l’incubateur de bioluminescence.

Fixez le couvercle de la porte pour exclure la lumière du système. Acquérir et analyser les données comme décrit pour les cultures de tissus statiques. Six plaques de fibroblastes PER2 LUC ont été entraînées à l’aide de cycles de température quotidiens et imagées à l’aide d’un incubateur de bioluminescence.

Les images de puits sélectionnés ont été analysées et la production de bioluminescence a été quantifiée. Les cellules LUC PER2 ont également été imagées dans des conditions de perfusion afin d’évaluer les effets d’un inhibiteur de la caséine kinase sur l’expression de LUC PER2. Les résultats ont été comparés à des cellules traitées avec la même concentration de l’inhibiteur dans des conditions statiques, ce qui a révélé un allongement de période nettement plus important dans des conditions statiques.

L’ampleur de l’allongement de la période dans des conditions de perfusion s’est avérée proche de celle observée in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de bioluminescence statique et perfusée à l’aide d’un alligator.