Name: Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Découvrez l'imagerie bioluminescente longitudinale avec le système ALLIGATOR pour l'étude des rythmes circadiens dans les cellules cultivées. Cette méthode permet l'enregistrement non invasif de l'expression génique sous diverses conditions extracellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Cairn recherche pour travailler avec nous pour développer ce système, en particulier Mark Henson, Jeremy Graham et Joao Correia. Nous remercions également David Welsh et Reddy Akhilesh discussion précieuse pendant la phase de conception, ainsi que Peter Laskey (anciennement de Hamamatsu) pour organiser le prêt d’un appareil de démo et David Wong pour son apport critique du manuscrit.

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
<li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li>
<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêt n’existe.

Le protocole décrit ici est pour la culture de cellules de mammifères, aussi bien dans des conditions statiques et perfusées. Toutefois, l’ALLIGATOR peut être facilement adaptée à d’autres systèmes de modèle. En effet, il a déjà été démontré pour fournir une excellente plate-forme pour une surveillance simultanée de locomotion, de sommeil et rythmes d’expression de gène périphériques chez Drosophila melanogaster , maintenus dans l’obscurité totale15. On notera également que, selon l’application, les types d’appareil photo autre que celui mentionné ici peuvent être appropriés. Nous envisageons qu’avec les filtres appropriés, une version modifiée de la configuration actuelle pourrait en principe être utilisée pour la quantification de la fluorescence.
Seules les applications pour lesquelles l’ALLIGATOR pourrait ne pas convenir sont celles pour lesquelles particulièrement haute résolution spatiale est nécessaire, comme l’imagerie d’organisation spatio-temporelle de l’expression PER2::LUC en tranches organotypique des mammifères noyau suprachiasmatique, ou autres petites tranches.
L’ALLIGATOR permet de nombreuses expériences à réaliser qui jusqu’ici n’ont pas été facile du faire par des techniques d’enregistrement classiques. Par rapport aux méthodes actuelles de mesure de la bioluminescence, l’ALLIGATOR fournit une plus grande souplesse à la fois le type de boîte de Petri de cellule ou diapositive qui peut être utilisé, les conditions du milieu externe, sensibilité et processivité.
Cela est particulièrement vrai à la fois lorsqu’il y a un éloignement des modèles de culture cellulaire 2D standard vers des systèmes de culture organoïde et flux 3D. Par conséquent, il est prévu que l’ALLIGATOR fournira une méthode adaptable par laquelle, bioluminescence peut être mesurée pendant plusieurs jours et des semaines sous un large éventail de conditions.

L’utilisation de luciférases comme reporters de l’expression génique et l’activité de la protéine est devenue une technique populaire en recherche en biologie moléculaire et cellulaire. Cela est vrai dans le domaine circadien, où la cinétique de la synthèse de luciférase firefly et inactivation catalytique sont particulièrement bien adaptés pour avoir signalé les changements longitudinaux dans l’expression des gènes qui se produisent pendant environ 24 h cycle circadien. Par conséquent, luciférase travaille comme journaliste circadienne dans un large éventail d’organismes, y compris les champignons, les plantes, les mouches et les mammifères1,2,3,4.
Lors de la quantification circadienne gene expression in vitro, un tube photomultiplicateur (PMT) est couramment utilisé pour enregistrer le signal de bioluminescent. Mesures PMT ont peu de flexibilité cependant, habituellement étant limité à une taille prédéterminée d’assiette ou un plat. Il n’est également pas possible de recueillir toute information spatiale des échantillons contrôlés à l’aide d’un PMT, qui peut conduire à une perte d’information lors de l’imagerie des exemples qui montrent la variation spatiale dans l’expression de la luciférase. En outre, comme le PMT et électroniques associés ont tendance à mal fonctionner lorsqu’il est exposé à l’environnement humidifié d’un incubateur de culture cellulaire standard, enregistrement de luciférase longitudinales à l’aide de PMT est toujours effectuée dans des incubateurs non humidifié. En conséquence, les récipients de culture cellulaire doivent être scellés hermétiquement pour empêcher la perte d’humidité par évaporation et les milieux de culture doit donc être mis en mémoire tampon avec 3 - sulfonique (N- morpholino) (MOPS) ou 4-(2-hydroxyéthyl) -1- acide piperazineethanesulfonic (HEPES), plutôt que le CO2/bicarbonate mise en mémoire tampon de système qui fonctionne en vivo et est utilisé couramment en culture de tissus chez les mammifères.
En raison de ces limitations, mesure de la bioluminescence par PMTs met généralement des restrictions sévères sur les conditions dans lesquelles les cellules sont maintenues au cours d’expériences. Pour surmonter ces problèmes et aussi pour augmenter la portée des conditions expérimentales possibles, nous utilisons un standard CO2/N2 170 L vitroplants incubateur qui a été adapté par l’ajout d’un eau réfrigérée électron-multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD) appareil photo avec optique anti-buée et contrôle numérique des niveaux de température et de gaz. Il a été surnommé un automatique longitudinale luciférase Imaging gaz et Temperature-Optimized enregistreur ou ALLIGATOR. L’ALLIGATOR permet une flexibilité une augmentation substantielle de bioluminescent imaging, tant pour l’imagerie des plaques de culture de tissus standard haut-débit (jusqu'à 6 x 96 ou 384 puits plaques en même temps) et aussi pour les systèmes de culture de tissus non standard, ces comme les cellules perfusés en Dispositifs microfluidiques. Cet instrument permet également d’imagerie pour se produire dans des conditions humidifiées et avec contrôle variable de CO2 et O2 partielle pression tant que la température.
Le protocole ci-dessous décrit une méthode pour l’enregistrement bioluminescente de cellules de mammifères et de systèmes de culture de tissus à l’aide d’un ALLIGATOR (ci-après dénommé « incubateur de bioluminescence »). Toutefois, il est à noter que le système serait bien adapté à l’imagerie bioluminescente et aussi, avec quelques modifications, imagerie, dans un certain nombre d’autres systèmes biologiques et des contextes fluorescente.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Sérum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>milieu basal</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Superoxyde Dismutase</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrine</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-Carnitine</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Corticostérone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Acide linoléique</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Acide linolénique</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Acide lipoïque</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de rétinol</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Rétinol, tous trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Tocophérol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alpha-Acétate de tocophérol</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium Solution</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R incubateur&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Solution de glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM poudre</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm de diamètre intérieur tube en silicone&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur Luer Coudé</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Raccords Luer mâles</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Raccords Luer femelles</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro ;-slide Luer I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak Seringue 20ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm Tube I.D. ETFE</td><td>GEG Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase Tampon Isotherme</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à densité neutre chauffé.</td><td>Cairn Research</td><td>Article</td><td></td>personnalisé</tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>Discontinué 300</td><td></td></tr><tr><td>mOsmol/kg étalon étalon</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Récipient de mesure</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre de mise au point</td><td>Cairn Research</td><td>Article</td><td></td>personnalisé</tr><tr><td>NE-1600 Pompe à seringue programmable</td><td>Pump Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis Logiciel</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure souples de reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (alligator)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Axée sur la luciférase reporters de l’expression génique cellulaire sont largement utilisées depuis longitudinales et des analyses de point d’arrêt de l’activité biologique. Dans la recherche de rythmes circadiens, par exemple, fusions de gènes d’horloge avec luciférase firefly donnent lieu aux rythmes robustes bioluminescence cellulaire qui persistent pendant plusieurs jours. Limitations techniques associées aux tubes photomultiplicateurs (PMT) ou des méthodes classiques axées sur la microscopie pour la quantification de la bioluminescence ont généralement exigé que les cellules et les tissus soit maintenu dans des conditions tout à fait non physiologiques au cours de enregistrement, avec un compromis entre sensibilité et le débit. Nous rapportons ici un raffinement des méthodes antérieures qui permet à long terme d’imagerie de bioluminescence haute sensibilité et un débit qui prend en charge un large éventail de conditions de culture, y compris les gaz variable et régulateur d’humidité, et qui accepte plusieurs différents plaques de culture de tissus et de plats. Cette luciférase longitudinale automatisé imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) également permet l’observation des variations spatiales dans l’expression de la luciférase à travers une monocouche de cellules ou de tissus, qui ne peuvent être facilement observés par traditionnel Méthodes. Nous mettons en évidence comment l’ALLIGATOR fournit beaucoup plus de flexibilité pour la détection de l’activité de la luciférase en comparaison avec les méthodes existantes.

Cet article décrit un protocole pour l’imagerie bioluminescente de cellules de mammifères à l’aide d’un ALLIGATOR (incubateur de bioluminescence). Cette technique donne une flexibilité de configuration physique et conditions extracellulaires bioluminescentes systèmes d’imagerie. Méthodes pour simple culture de tissus statique (Figure 1, supplémentaire vidéo 1) et culture de cellules perfusé (Figure 2, supplémentaires vidéo 2) sont décrits, mais de nombreuses autres configurations pourraient être photographiées à l’aide de ce système. Toutes les données ont été quantifiées en utilisant les méthodes décrites dans la Section 7.
Figure 1 a montre un exemple de vidéo d’une bioluminescence enregistrement à partir de plaques 6 x 96 puits contenant de fibroblastes PER2::LUC4. Les puits ultrapériphériques ne contiennent pas de cellules car elles n’étaient pas requis pour cette expérience. Les cellules ont subi l’entraînement différentiel de température, par lequel ils subissent un cycle de température de 12 h, à 32 ° C, suivie à 12 h 37 ° C pendant 72 h ou l’inverse (12 h, à 37 ° C, suivie à 12 h, à 32 ° C pendant 72 h), avant se tient à la constante de 37 ° C pour l’enregistrement. 60 min expositions étaient prises toutes les heures. Deux de ces conditions sont quantifiés dans la Figure 1 b.
Figure 2 a montre une représentation schématique de l’installation d’un système de culture de tissus perfusé. Il s’agit de deux diapositives canal connectés avec la tuyauterie. Media est conduit à travers les cellules par un pousse-seringue. Le premier de ces diapositives agit comme un barboteur perméable de gaz (diapositive tampon) et ne contient aucune cellule, avec le second contenant les cellules d'où la bioluminescence est enregistré. Un représentant d’enregistrement vidéo de ce système est illustré à la Figure 2 b. 15 min expositions étaient prises toutes les 15 min. Ici, les cellules sont maintenues dans des conditions standard de perfusion ou en présence de l’inhibiteur de la kinase caséine PF670462, qui a déjà été démontré que rallonger la période circadienne et réduire l’amplitude des horloge gene expression rythmes en élevage les cellules de mammifères,14. L’effet sur l’expression PER2::LUC est illustré dans la Figure 2 (panneau supérieur) contre les cellules traitées avec la même concentration de médicament dans les conditions de culture de cellules statiques standard illustré à la Figure 2 (panneau inférieur), avec la quantification de la période illustré à la Figure 2D. Il ressort clairement de ce que le traitement avec PF670462 influence PER2::LUC expression sous les deux ensembles de conditions. Cependant, tandis que les cellules traitées avec PF670462 sous conditions perfusées Voir la période allongement d’environ 3 h (3 h de ±0.9), des cellules dans des conditions statiques, traitées avec le médicament montrent un allongement période nettement supérieur à une période de &gt; 48 h. Ceci peut être adapté par un cosinus amorti, tel que décrit dans la Section 7, (F extra-somme des carrés d’essai par rapport à une ligne droite, p &lt; 0,0001). Fait intéressant, l’ampleur de l’allongement période sous perfusion est beaucoup plus proche de celle observée in vivo14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : exemple de données. (A) exemple de capture vidéo de la bioluminescence de PER2::LUC immortalisées dans 6 x 96 plaques bien dans l’incubateur de bioluminescence. Puits à quantifier ont été surlignés en jaune dans le supplémentaire vidéo 1. (B) Quantification de la bioluminescence chez A. Deux ensembles de 3 plaques de cellules ont été entraînés à l’aide des cycles de température (12 h, à 32 ° C ; 12 h, à 37° C) qui étaient anti-phasiques mutuellement pour produire en face des phases d’expression de protéine PER2 (n = 6, moyenne ± et). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
Figure 2 : Perfusion avec inhibiteurs de la CK1δ. (A) Représentation schématique du système de perfusion. (B) exemple de vidéo instantané d’une bioluminescence enregistrement de PER2::LUC cellules sous perfusion. Une zone de prélèvement de quantification est surlignée en jaune. (C) Quantification de la bioluminescence des fibroblastes PER2::LUC sous perfusion et dans des conditions statiques avec ou sans inhibiteur de CK1 µM 3 PF670462 (n = 3, moyenne ± et). Bioluminescence a été normalisée aux valeurs minimales et maximales. (D) l’analyse de la période (Two-Way ANOVA, test de comparaisons multiples de Holm-Sidak).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Concentration moyenne finale (μM)</td>
			<td>Stock (mg/mL)</td>
			<td>Pour 400 mL NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumine bovine</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>0,01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathion</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline</td>
			<td>0,6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxyde dismutase</td>
			<td>0,077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferrine</td>
			<td>0,062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0,0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Éthanolamine</td>
			<td>16</td>
			<td>Liquide (1 g/ml)</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-Galactose</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sélénite de sodium</td>
			<td>0,083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticostérone</td>
			<td>0,058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide linoléique</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide linolénique</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acide lipoïque</td>
			<td>0,2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progestérone</td>
			<td>0,02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acétate de rétinol</td>
			<td>0,2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rétinol, toutes les trans</td>
			<td>0,3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocophérol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-alpha-tocophérol</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : NS21 préparation.
Supplémentaire 1 vidéo : vidéo d’exemple de la bioluminescence de plats. Exemple vidéo instantané de bioluminescence de PER2::LUC immortalisée en plaques bien 6 x 96 dans l’incubateur de bioluminescence. Puits à doser sont surlignés en jaune. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaire 2 vidéo : capture vidéo exemple d’une bioluminescence enregistrement de PER2::LUC cellules sous perfusion. Une zone de prélèvement de quantification est surlignée en jaune. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

L’objectif global de ce système est de permettre l’observation facile des rapporteurs bioluminescents dans un large éventail de conditions extracellulaires, y compris sous une perfusion constante de milieux. Cette méthode peut être utilisée pour observer longitudinalement la bioluminescence à partir de cellules et de tissus cultivés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’enregistrer à partir de cellules dans des conditions variables de milieux extracellulaires et de gaz, ce qui n’est pas possible dans la plupart des systèmes existants.Bien que nous démontrions ici cette technique dans le contexte d’expériences sur le rythme circadien, elle pourrait facilement être appliquée à d’autres systèmes nécessitant une bioluminescence ou un enregistrement fluorescent sur des échelles de temps allant de quelques jours à quelques semaines. Pour commencer la procédure, ensemencez les cellules cultivées dans des boîtes ou des plaques de culture tissulaire. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les monocouches aient atteint 100 % de confluence.Immédiatement avant l’expérience, utilisez un incubateur cycliste contrôlé par ordinateur pour alterner entre 32 et 37 degrés Celsius toutes les 12 heures pendant un minimum de 72 heures afin de synchroniser les rythmes cellulaires. Une synchronisation robuste des oscillations circadiennes cellulaires à l’intérieur et entre les cultures est cruciale pour la reproductibilité expérimentale. Nous y parvenons en appliquant des cycles de température quotidiens avant chaque enregistrement qui synchronisent les cellules en imitant les rythmes de température corporelle.Alternativement, la synchronisation pharmacologique peut également être très efficace. Ensuite, combinez 8,3 grammes de poudre de DMEM à haute teneur en glucose avec 900 millilitres d’eau ultra-pure. Remuez la solution pendant 30 minutes pour dissoudre complètement la poudre.Ensuite, ajoutez à la solution 50 millilitres de solution de glucose de 100 grammes par litre, 20 millilitres de pH 7,6, une solution molaire de MOPS et 10 millilitres de solution de 100 fois de pénicilline streptomycine. Remuez le mélange pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 4,7 millilitres d’une solution de bicarbonate de sodium à 7,5 % et remuez le mélange pendant cinq minutes de plus.Utilisez de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,6 à température ambiante. Ajoutez de l’eau ultrapure à la solution pour obtenir un volume final d’un litre. Filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,22 micromètre dans une fiole stérile.Conservez le milieu filtré à quatre degrés Celsius. Immédiatement avant d’effectuer l’expérience, complétez la quantité souhaitée de milieu mère avec 10 % de sérum, deux millimolaires de GlutaMAX, 2 % de NS21 et un millimolaire de luciférine. Passez le fluide de travail obtenu à travers un filtre stérile de 0,22 micromètre.Utilisez une solution à cinq molaires de chlorure de sodium pour ajuster l’osmolalité du milieu de travail à 350 milliosmoles. Ensuite, réchauffez le milieu à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Ensuite, pour commencer à faire la mise au point de la caméra de l’incubateur de bioluminescence, dévissez le filtre à densité neutre chauffé imperméable à l’eau.Dans le logiciel de l’instrument, réglez le temps d’exposition sur 0,2 seconde et le temps de cycle cinétique sur 0,3 seconde. Vérifiez que le gain multiplicateur d’électrons est désactivé, puis fermez la fenêtre de configuration et démarrez l’enregistrement vidéo. Utilisez le cylindre de mise au point pour faire pivoter l’objectif de l’appareil photo jusqu’à ce que les éléments de test sur l’étagère d’échantillon appropriée soient clairement nets.Ensuite, arrêtez l’enregistrement vidéo. Remplacez le filtre à densité neutre et retirez les éléments de test. Ensuite, utilisez le panneau de commande situé à l’avant de l’incubateur de bioluminescence pour régler les niveaux d’oxygène, de dioxyde de carbone et de température souhaités pour l’expérience.Pour une expérience humidifiée, remplissez le bac à eau à la base de l’incubateur. Retirez les cellules de l’incubateur de culture tissulaire et remplacez le milieu de culture par le milieu de travail préchauffé. Pour les expériences humidifiées utilisant de petits volumes, scellez les plaques avec un film ou du ruban adhésif perméable aux gaz.Placez les plaques dans l’incubateur bioluminescent. Fermez l’incubateur et fixez le couvercle de la porte pour exclure la lumière du système. Ensuite, dans le logiciel de l’instrument, réglez le mode d’acquisition sur cinétique.Réglez le temps d’exposition souhaité. Réglez les accumulations à un, la durée de la série cinétique au nombre souhaité de cycles d’acquisition et le temps du cycle cinétique à l’intervalle d’imagerie souhaité. Réglez une vitesse de changement de vitesse de 4,33 microsecondes, un gain de un et un gain EM du niveau souhaité.Ensuite, définissez le type de fichier d’enregistrement automatique sur sif ou tiff. Nommez le fichier d’enregistrement automatique et définissez son chemin d’accès. Définissez le type de fichier de spoule sur sif ou tiff.Nommez la pile de fichiers et définissez son chemin d’accès. Fermez la fenêtre de configuration et commencez à enregistrer les données. Une fois la collecte des données terminée, importez la pile d’images acquise dans un logiciel de traitement d’images.Ajustez la luminosité et le contraste pour une visualisation optimale de la bioluminescence. Ensuite, sélectionnez les régions d’intérêt et exportez le signal moyen pour les zones sélectionnées. Copiez les données dans un logiciel d’analyse pour un traitement ultérieur.Pour commencer l’expérience, des cellules d’amorçage sur des lames monocanal avec des connecteurs Luer et une profondeur de canal de 0,6 ou 0,8 millimètre. Cultivez et entraînez les cellules. Préparez et réchauffez un milieu de perfusion DMEM à faible teneur en glucose tamponné à l’hydrogénocarbonate.Ensuite, coupez cinq sections de deux centimètres de tube en silicone d’un diamètre intérieur d’un millimètre. Découpe de tubes d’éthylène tétrafluoroéthylène d’un millimètre de diamètre intérieur de 1,2 mètre, 10 centimètres et 30 centimètres. Stérilisez la tubulure avec de l’éthanol à 70 % et rincez la tubulure avec du PBS stérile.Utilisez le tube en silicone stérilisé pour connecter le tube ETFE de 1,2 mètre à un connecteur Luer femelle stérile et à un connecteur Luer coudé stérile. Utilisez cet ensemble pour connecter la seringue de moyen de perfusion à une lame de canal Luer vide. Ensuite, remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu de perfusion préchauffé.Remplissez une seringue stérile de 20 millilitres avec un milieu de perfusion préchauffé. Montez le tube ETFE de 10 centimètres avec des connecteurs Luer à l’aide du tube en silicone et connectez le tube à la glissière. Rincez trois à cinq millilitres de milieu de perfusion à travers la tubulure et la glissière du canal.Ensuite, installez le tube ETFE de 30 centimètres sur la glissière du canal contenant la cellule. Connectez l’extrémité libre du tube ETFE de 10 centimètres à l’autre extrémité de la lame du canal cellulaire pour former le système de perfusion complet. Rincez un millilitre de milieu de perfusion à travers le tube et les lames pour éviter les bulles d’air.Transportez le système de perfusion vers l’incubateur de bioluminescence. Fixez la seringue remplie de fluide de perfusion dans un pousse-seringue en prenant soin de ne pas déconnecter la tubulure. Utilisez le pousse-seringue pour injecter un millilitre de fluide de perfusion à travers le système de perfusion.Entrez le diamètre de la seringue sur la pompe et réglez le débit sur 50 microlitres par heure. Il est crucial qu’il n’y ait pas de bulles dans le système de perfusion au début de l’expérience, car celles-ci peuvent perturber le signal de bioluminescence. Démarrez la pompe et fermez immédiatement la porte de l’incubateur de bioluminescence.Fixez le couvercle de la porte pour exclure la lumière du système. Acquérir et analyser les données comme décrit pour les cultures de tissus statiques. Six plaques de fibroblastes PER2 LUC ont été entraînées à l’aide de cycles de température quotidiens et imagées à l’aide d’un incubateur de bioluminescence.Les images de puits sélectionnés ont été analysées et la production de bioluminescence a été quantifiée. Les cellules LUC PER2 ont également été imagées dans des conditions de perfusion afin d’évaluer les effets d’un inhibiteur de la caséine kinase sur l’expression de LUC PER2. Les résultats ont été comparés à des cellules traitées avec la même concentration de l’inhibiteur dans des conditions statiques, ce qui a révélé un allongement de période nettement plus important dans des conditions statiques.L’ampleur de l’allongement de la période dans des conditions de perfusion s’est avérée proche de celle observée in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de bioluminescence statique et perfusée à l’aide d’un alligator.

flexible-measurement-bioluminescent-reporters-using-an-automated

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici, nous décrivons les procédures pour l'étude des changements dans la phagocytose induite par l'expression des gènes avec une approche basée sur la luciférase du gène rapporteur utilisant le système à double GloTM Luciferase Assay de Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Ici, nous décrivons les méthodes pour construire, visualiser et quantifier les réactions bioluminescentes à la fois luciole et la luciférase Renilla enzymes exprimées en cellules cancéreuses mammaires métastatiques au cours de leur croissance et les...

In vivo double Substrat Bioluminescent Imaging

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Bioluminescent imagerie bactérienne<em&gt; In Vivo</em

La vidéo montre le dosage de la luciférase utilisé pour quantifier les protéines marquées à la luciférase. Le test utilise une enzyme luciférase modifiée composée d’un gros fragment qui se lie au petit fragment, qui est conjugué à une protéine d’intérêt. Les sous-unités liées forment une enzyme active qui, en présence du substrat, libère un signal luminescent. Ce signal est ensuite quantifié à l’aide d’un luminomètre.

Le test de la luciférase : un test à haut débit pour mesurer les signaux luminescents à l’aide de biorapporteurs basés sur le système de nanoluciférase

Les cellules de mammifères exprimant la cassette du gène de bioluminescence bactérienne...

Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Nous présentons ici un roman Ca 2+ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.

In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d&#39;imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

Bactéries bioluminescentes réglementent la production légère au moyen de divers mécanismes, tels que quorum sensing. Cette nouvelle méthode permet l’enquête in situ de la bioluminescence et la corrélation de l’émission de lumière densité cellulaire. Un artificiel bioluminescentes Escherichia coli système permet la caractérisation des opérons lux , Lux protéines et leur interaction.

In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Découvrez l'imagerie bioluminescente longitudinale avec le système ALLIGATOR pour l'étude des rythmes circadiens dans les cellules cultivées. Cette méthode permet l'enregistrement non invasif de l'expression génique sous diverses conditions extracellulaires.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Explorer plus de vidéos