Name: In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez la technique de résonance paramagnétique électronique in vivo pour évaluer quantitativement et non invasivement les paramètres physiologiques du microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

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Ce travail a été partiellement pris en charge par les NIH confèrent aux CA194013, CA192064 et U54GM104942. Le WVCTSI est reconnu pour le démarrage à VVK, AB et TDE. Les auteurs remercient Dr M. Gencheva et K. Steinberger pour l’aide avec les expériences illustratives. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes présentées permettent non invasif in vivo l’évaluation des paramètres critiques de la TME chimique, à savoir pO2, pH, statut redox et concentrations de Pi interstitielle et de GSH intracellulaire. Les techniques de résonance magnétique, tels que les IRM et champ faible EPR, sont les méthodes de choix non invasif in vivo par profilage de ces paramètres TME. MRI visualise les structures anatomiques mais manque de sensibilité fonctionnelle. Contrairement à l’IRM, les techni...

Un rôle clé de la TME dans la progression du cancer et la thérapie est de plus en plus apprécié1. Parmi les paramètres physiologiques importants de la TME dans les tumeurs solides, d’une hypoxie tissulaire2, acidose3,4, réducteurs haute capacité5, des concentrations élevées de6,de GSH intracellulaire7, et interstitielle Pi8 sont bien documentés. Non invasif in vivo pO2, pH, Pi, BA et oxydo-réduction évaluations fournissent un aperçu unique des processus biologiques dans TME et outils d’avance pour le dépistage préclinique des médicaments anticancéreux et stratégies thérapeutiques ciblées TME. Une profondeur de pénétration de radiofréquence raisonnable dans les tissus par l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des techniques basées sur l’EPR de champ faible rend les approches les plus appropriées pour l’évaluation non invasive de ces paramètres TME. MRI dépend en grande partie d’imagerie protons de l’eau et est largement utilisé dans les milieux cliniques pour fournir une résolution anatomique mais manque de résolution fonctionnelle. Les mesures de 31P RMN (31P-NMR) de concentration de Pi et pH basé sur un signal de phosphate endogène extracellulaires sont potentiellement intéressants pour la caractérisation de la TME, mais sont habituellement masqués par plusieurs fois plus élevé intracellulaire Pi concentrations9,10. En revanche, mesures de l’EPR s’appuient sur la spectroscopie et imagerie de spécialement conçu des sondes paramagnétiques pour fournir une résolution fonctionnelle. Notez qu’exogène EPR sondes ont un avantage sur les exogènes NMR sondes en raison de la grande sensibilité intrinsèque plus élevée de l’EPR et l’absence de signaux RPE fond endogène. Le développement récent d’une nitroxyles double fonction de pH et redox probe11 et multifonctionnel trityle sonde12 offre des possibilités inégalées pour in vivo des mesures simultanées de plusieurs paramètres TME et leur analyses de corrélation dépend de la distribution de la sonde et l’heure de la mesure. À notre connaissance, il n’y a pas d’autres méthodes disponibles pour évaluer simultanément en vivo physiologiquement importants paramètres chimiques TME dans des sujets vivants, tels que pO2, pHe, Pi, oxydo-réduction et BA.
Sondes pour In Vivo Mesures fonctionnelles :
La figure 1 illustre les structures chimiques des sondes paramagnétiques utilisés pour accéder aux paramètres TME, incluent des sondes particulaires et solubles. Haute sensibilité fonctionnelle, de la stabilité dans les tissus vivants et toxicité minimale sont quelques avantages qui rendent les particules sondes préféraient plutôt que des sondes solubles pour in vivo l’oxymétrie EPR. Par exemple, particules sondes ont augmenté les temps de rétention sur le site de l’implant de tissus par rapport aux sondes solubles permettant la mesure longitudinale du tissu pO2 sur plusieurs semaines. En revanche, les sondes solubles surpassent particules sondes en fournissant des mesures spatiales résolues en utilisant EPR axée sur les techniques d’imagerie ainsi que permettant des analyses concomitantes de plusieurs fonctionnalités (pO2, pH, Pi, redox, et BA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> La figure 1. Structures chimiques des sondes paramagnétiques qui assemblent des test d’évaluation de TME. Cela inclut la sonde de2 particules pO, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) et les sondes solubles : double fonction sonde pH et redox, NR ; BA-sensible à la sonde, RSER ; et multifonctionnel pO2, pH et sonde de Pi du microenvironnement extracellulaire, la sonde espoir. La synthèse de ces sondes a été décrite dans les références fournies 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Spectromètre EPR en bande L</td><td>Magnettech, Allemagne</td><td></td><td>Spectromètre à résonance paramagnétique électronique (EPR) en bande L (1,2 GHz) pour la collecte in vitro et in vivo de spectres de molécules paramagnétiques</td></tr><tr><td>&nbsp ; Température & Contrôleur de gaz&nbsp ;</td><td>Noxygen, Allemagne</td><td></td><td>Température & Régulateur de gaz conçu pour contrôler et ajuster la température et la composition du gaz&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathion réduit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp ; souris</td><td>Chez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nous DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 cellules de cancer du sein murin</td><td>Chez</td> C57Bl<td></td><td></td></tr><tr><td>/6 souris de type sauvage&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Exclusion Dye&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>sigma-Aldrich Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulateur E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde LiNc-BuO</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde Octa-n-Butoxy-Naphtalocyanine a été synthétisée selon la réf 13</td></tr><tr><td>Sonde NR</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde Nitroxide a été synthétisée selon la réf 11</td></tr><tr><td>Sonde RSSR</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde di-Nitroxide a été synthétisée selon la réf 15</td></tr><tr><td>HOPE <sonde >em</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde triarylméthyle monophoshonnée a été synthétisée selon la réf 12</td></tr></tbody></table>

in vivo Évaluation des epr du ph, po2, statut redox et les concentrations de phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Ce protocole démontre la capacité de résonance paramagnétique électronique de champ faible (RPE)-basé techniques en combinaison avec des sondes paramagnétiques fonctionnelles pour fournir des informations quantitatives sur le microenvironnement tumoral chimique (TME), y compris p O2, statut redox, pH, concentrations d’interstitielle phosphate inorganique (Pi) et intracellulaire glutathion (GSH). En particulier, une demande d’une sonde trityle multifonctionnel soluble récemment développés fournit une occasion inégalée pour in vivo des mesures simultanées de p,H, pO2 et Pi dans E espace mi (sonde d’espoir). Les mesures des trois paramètres à l’aide d’une seule sonde permettant leur analyse de corrélation indépendantes de distribution de la sonde et l’heure des mesures.

Tissu p O 2 Évaluation en utilisant le clic-BuO sondes :
En utilisant la procédure décrite sous étape 1.1, nous avons effectué l’étalonnage de suspension de microcristaux LiNc-BuO fraîchement préparée. La figure 2 illustre la dépendance de l’oxygène typique de la largeur des raies de la sonde de ...

La résonance paramagnétique électronique champ faible (bande L, 1,2 GHz) à l’aide des sondes nitroxyles et trityle solubles est démontrée pour l’évaluation des paramètres physiologiques importants dans le microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

L’objectif global de cette technologie de résonance paramagnétique électronique in vivo est d’évaluer quantitativement et de manière non invasive les paramètres physiologiquement pertinents du microenvironnement tissulaire local dans des contextes précliniques dans des modèles animaux de cancer. Cette technique est basée sur la combinaison d’APR de fluorochamp avec des sondes paramagnétiques fonctionnelles de conception spéciale pour fournir des informations quantitatives sur l’oxygénation des tissus sous forme de CDT à l’état de dock ainsi que sur les concentrations interstitielles de phosphate organique et intercellulaires. Cette technique non invasive fournit un aperçu unique du monde du microenvironnement tumoral et de la régénération tumorale et pourrait contribuer à la conception rationnelle future de thérapies anticancéreuses ciblées sur le microenvironnement tumoral.L’application de cette technique s’étend à la corrélation cérébrale entre les paramètres d’application des sondes APR multifonctionnelles. Fournissant ainsi un aperçu supplémentaire des mécanismes biologiques sous-jacents. En plus de moi et d’Andrey, Marieta Gencheva et le Dr Benoit Driesschaert et une étudiante

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L'imagerie par bioluminescence des inducible factor-1α activité hypoxie est appliqué pour surveiller le développement intracrânienne hypoxie tumorale dans un modèle de cancer du sein métastatique cerveau de souris.

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Ici, la surveillance en temps réel du métabolisme des cellules tumorales, combinée à un modèle in vivo de métastases à membrane chorio-allantoïde (CAM) d’embryon de poulet, est utilisée pour évaluer de nouvelles cibles/agents anticancéreux pour leur capacité à sensibiliser les cellules tumorales aux chimiothérapies endommageant l’ADN.

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Une méthode, rapide balayage EPR (RS-EPR) nouvelle résonance paramagnétique électronique (EPR), est mise en évidence pour la 2D imagerie spatiale spectrale qui est supérieure à la technique traditionnelle onde continue (CW) et ouvre de nouveaux espaces pour l' imagerie in vivo. Les résultats sont démontrés à 250 MHz, mais la technique est applicable à toute fréquence.

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Ce manuscrit décrit le développement d’un modèle animal qui permet de tester directement les effets de l’hypoxie tumorale sur les métastases et de déchiffrer les mécanismes de son action. Bien que les expériences décrites ici se concentrent sur le sarcome d’Ewing, une approche similaire peut être appliquée à d’autres types de tumeurs.

Modèle in vivo pour tester l&#39; effet de l&#39; hypoxie sur la tumeur métastase

Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.

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Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.

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Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Nous avons développé une méthode reproductible pour visualiser l’internalisation de l’adénosine triphosphate fluorescente non hydrolysable (ATP), un substitut de l’ATP, avec une résolution cellulaire élevée. Nous avons validé notre méthode en utilisant des tests indépendants in vitro et in vivo - des lignées de cellules tumorales humaines et des souris immunodéficientes xénogreffées avec du tissu tumoral humain.

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Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Des cartes quantitatives 3D de l’oxygène des tumeurs murines ont été imagées de manière non invasive à l’aide de la résonance paramagnétique électronique pulsée. L’échographie en mode B et le Doppler de puissance ont été utilisés pour l’anatomie et la structure vasculaire. Des images des deux modalités ont été superposées, ce qui a permis une analyse multiparamétrique des tumeurs.

Évaluation de l’hypoxie tumorale : imagerie 3D de l’oxygène in vivo par résonance paramagnétique électronique 

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