Name: In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez la technique de résonance paramagnétique électronique in vivo pour évaluer quantitativement et non invasivement les paramètres physiologiques du microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

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Ce travail a été partiellement pris en charge par les NIH confèrent aux CA194013, CA192064 et U54GM104942. Le WVCTSI est reconnu pour le démarrage à VVK, AB et TDE. Les auteurs remercient Dr M. Gencheva et K. Steinberger pour l’aide avec les expériences illustratives. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes présentées permettent non invasif in vivo l’évaluation des paramètres critiques de la TME chimique, à savoir pO2, pH, statut redox et concentrations de Pi interstitielle et de GSH intracellulaire. Les techniques de résonance magnétique, tels que les IRM et champ faible EPR, sont les méthodes de choix non invasif in vivo par profilage de ces paramètres TME. MRI visualise les structures anatomiques mais manque de sensibilité fonctionnelle. Contrairement à l’IRM, les techni...

Un rôle clé de la TME dans la progression du cancer et la thérapie est de plus en plus apprécié1. Parmi les paramètres physiologiques importants de la TME dans les tumeurs solides, d’une hypoxie tissulaire2, acidose3,4, réducteurs haute capacité5, des concentrations élevées de6,de GSH intracellulaire7, et interstitielle Pi8 sont bien documentés. Non invasif in vivo pO2, pH, Pi, BA et oxydo-réduction évaluations fournissent un aperçu unique des processus biologiques dans TME et outils d’avance pour le dépistage préclinique des médicaments anticancéreux et stratégies thérapeutiques ciblées TME. Une profondeur de pénétration de radiofréquence raisonnable dans les tissus par l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et des techniques basées sur l’EPR de champ faible rend les approches les plus appropriées pour l’évaluation non invasive de ces paramètres TME. MRI dépend en grande partie d’imagerie protons de l’eau et est largement utilisé dans les milieux cliniques pour fournir une résolution anatomique mais manque de résolution fonctionnelle. Les mesures de 31P RMN (31P-NMR) de concentration de Pi et pH basé sur un signal de phosphate endogène extracellulaires sont potentiellement intéressants pour la caractérisation de la TME, mais sont habituellement masqués par plusieurs fois plus élevé intracellulaire Pi concentrations9,10. En revanche, mesures de l’EPR s’appuient sur la spectroscopie et imagerie de spécialement conçu des sondes paramagnétiques pour fournir une résolution fonctionnelle. Notez qu’exogène EPR sondes ont un avantage sur les exogènes NMR sondes en raison de la grande sensibilité intrinsèque plus élevée de l’EPR et l’absence de signaux RPE fond endogène. Le développement récent d’une nitroxyles double fonction de pH et redox probe11 et multifonctionnel trityle sonde12 offre des possibilités inégalées pour in vivo des mesures simultanées de plusieurs paramètres TME et leur analyses de corrélation dépend de la distribution de la sonde et l’heure de la mesure. À notre connaissance, il n’y a pas d’autres méthodes disponibles pour évaluer simultanément en vivo physiologiquement importants paramètres chimiques TME dans des sujets vivants, tels que pO2, pHe, Pi, oxydo-réduction et BA.
Sondes pour In Vivo Mesures fonctionnelles :
La figure 1 illustre les structures chimiques des sondes paramagnétiques utilisés pour accéder aux paramètres TME, incluent des sondes particulaires et solubles. Haute sensibilité fonctionnelle, de la stabilité dans les tissus vivants et toxicité minimale sont quelques avantages qui rendent les particules sondes préféraient plutôt que des sondes solubles pour in vivo l’oxymétrie EPR. Par exemple, particules sondes ont augmenté les temps de rétention sur le site de l’implant de tissus par rapport aux sondes solubles permettant la mesure longitudinale du tissu pO2 sur plusieurs semaines. En revanche, les sondes solubles surpassent particules sondes en fournissant des mesures spatiales résolues en utilisant EPR axée sur les techniques d’imagerie ainsi que permettant des analyses concomitantes de plusieurs fonctionnalités (pO2, pH, Pi, redox, et BA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> La figure 1. Structures chimiques des sondes paramagnétiques qui assemblent des test d’évaluation de TME. Cela inclut la sonde de2 particules pO, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3) et les sondes solubles : double fonction sonde pH et redox, NR ; BA-sensible à la sonde, RSER ; et multifonctionnel pO2, pH et sonde de Pi du microenvironnement extracellulaire, la sonde espoir. La synthèse de ces sondes a été décrite dans les références fournies 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Spectromètre EPR en bande L</td><td>Magnettech, Allemagne</td><td></td><td>Spectromètre à résonance paramagnétique électronique (EPR) en bande L (1,2 GHz) pour la collecte in vitro et in vivo de spectres de molécules paramagnétiques</td></tr><tr><td>&nbsp ; Température & Contrôleur de gaz&nbsp ;</td><td>Noxygen, Allemagne</td><td></td><td>Température & Régulateur de gaz conçu pour contrôler et ajuster la température et la composition du gaz&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathion réduit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp ; souris</td><td>Chez</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nous DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 cellules de cancer du sein murin</td><td>Chez</td> C57Bl<td></td><td></td></tr><tr><td>/6 souris de type sauvage&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Exclusion Dye&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>sigma-Aldrich Lauda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulateur E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde LiNc-BuO</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde Octa-n-Butoxy-Naphtalocyanine a été synthétisée selon la réf 13</td></tr><tr><td>Sonde NR</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde Nitroxide a été synthétisée selon la réf 11</td></tr><tr><td>Sonde RSSR</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde di-Nitroxide a été synthétisée selon la réf 15</td></tr><tr><td>HOPE <sonde >em</td><td>En interne</td><td></td><td>La sonde triarylméthyle monophoshonnée a été synthétisée selon la réf 12</td></tr></tbody></table>

in vivo Évaluation des epr du ph, po2, statut redox et les concentrations de phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Ce protocole démontre la capacité de résonance paramagnétique électronique de champ faible (RPE)-basé techniques en combinaison avec des sondes paramagnétiques fonctionnelles pour fournir des informations quantitatives sur le microenvironnement tumoral chimique (TME), y compris p O2, statut redox, pH, concentrations d’interstitielle phosphate inorganique (Pi) et intracellulaire glutathion (GSH). En particulier, une demande d’une sonde trityle multifonctionnel soluble récemment développés fournit une occasion inégalée pour in vivo des mesures simultanées de p,H, pO2 et Pi dans E espace mi (sonde d’espoir). Les mesures des trois paramètres à l’aide d’une seule sonde permettant leur analyse de corrélation indépendantes de distribution de la sonde et l’heure des mesures.

Tissu p O 2 Évaluation en utilisant le clic-BuO sondes :
En utilisant la procédure décrite sous étape 1.1, nous avons effectué l’étalonnage de suspension de microcristaux LiNc-BuO fraîchement préparée. La figure 2 illustre la dépendance de l’oxygène typique de la largeur des raies de la sonde de ...

La résonance paramagnétique électronique champ faible (bande L, 1,2 GHz) à l’aide des sondes nitroxyles et trityle solubles est démontrée pour l’évaluation des paramètres physiologiques importants dans le microenvironnement tumoral dans des modèles murins de cancer du sein.

In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

L’objectif global de cette technologie de résonance paramagnétique électronique in vivo est d’évaluer quantitativement et de manière non invasive les paramètres physiologiquement pertinents du microenvironnement tissulaire local dans des contextes précliniques dans des modèles animaux de cancer. Cette technique est basée sur la combinaison d’APR de fluorochamp avec des sondes paramagnétiques fonctionnelles de conception spéciale pour fournir des informations quantitatives sur l’oxygénation des tissus sous forme de CDT à l’état de dock ainsi que sur les concentrations interstitielles de phosphate organique et intercellulaires. Cette technique non invasive fournit un aperçu unique du monde du microenvironnement tumoral et de la régénération tumorale et pourrait contribuer à la conception rationnelle future de thérapies anticancéreuses ciblées sur le microenvironnement tumoral.L’application de cette technique s’étend à la corrélation cérébrale entre les paramètres d’application des sondes APR multifonctionnelles. Fournissant ainsi un aperçu supplémentaire des mécanismes biologiques sous-jacents. En plus de moi et d’Andrey, Marieta Gencheva et le Dr Benoit Driesschaert et une étudiante diplômée, Kayla Steinberger du Centre IMMR, feront la démonstration de la procédure.Pour préparer la sonde sensible à l’oxygène particulaire, pesez d’abord 60 milligrammes de microcristaux. Pour l’étalonnage de la sensibilité à l’oxygène, suspendez les microcristaux dans trois millilitres de milieu aigle modifié Dolbeckas. Sonicate pendant cinq minutes, sur de la glace, avec une sonde à 20 kilohertz en utilisant sept watts de puissance dans un tube en verre à fond rond de cinq millilitres.Ensuite, placez un millilitre de microcristaux soniqués dans un tube de verre dans la bobine de surface résignatrice du spectromètre EPR en bande L. Acquérez des spectres EPR à ondes continues à une température physiologique de 37 degrés Celsius et à des concentrations d’oxygène de zéro, un, deux, quatre, huit et 20,9 %. Pour préparer la sonde de pH et redox à double fonction, dissolvez 6,34 milligrammes de la sonde dans un millilitre de solution saline.Ajustez le pH à 7,2 avec de petites portions d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium à l’aide d’un pH-mètre. Pour effectuer l’étalonnage du pH de la sonde de nitroxide, ajoutez d’abord 0,1 millilitre de la solution mère de la sonde à 0,9 millilitre de tampon de phosphate de sodium à deux millimolaires, 150 millimolaires de chlorure de sodium. Titrez ensuite la solution de sonde d’un millimolaire obtenue avec des doses d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium au pH requis à l’aide d’un pH-mètre.Enregistrez les spectres EPR des échantillons dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à l’aide du spectromètre EPR en bande L. Pour préparer la sonde RSSR sensible au GSH, dissolvez 4,05 milligrammes de la sonde dans un millilitre de solution de DMSO. Ensuite, déterminez la valeur de la constante de vitesse de la réaction de RSSR avec GSH.Pour ce faire, ajoutez d’abord 20 microlitres de la solution mère RSSR à 0,98 millilitre d’un tampon de phosphate millimolaire pH 7,2, 150 millimolaires de chlorure de sodium pour obtenir une solution de sonde RSSR de 0,2 millimolaire. Mélangez ensuite des volumes égaux de solution RSSR de 0,2 millimolaire dans l’une des solutions de GSH pour une concentration finale de la sonde à 0,1 millimolaire et de GSH à 0,5, un ou 2,5 millimolaires. Immédiatement après le mélange de la solution RSSR et GSH, placez l’échantillon dans le résignateur EPR et enregistrez les spectres EPR toutes les 12 secondes pendant 10 minutes.Calculez ensuite la cinétique de l’augmentation de l’amplitude spectrale monoradicalaire de la sonde multifonctionnelle HOPE pour l’évaluation du pH de l’oxygène et du Pi. Dissoudre 10,7 milligrammes de la sonde dans un millilitre de solution saline et ajuster le pH à 7,4. Ajoutez ensuite 20 microlitres de la solution mère préparée à 0,98 millilitre de solution saline pour obtenir une solution de sonde de 0,2 millimolaire.Pour l’étalonnage du pH de la sonde, titrer 0,2 millimolaire de la solution de la sonde par l’ajout d’un petit volume d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique de sorte que la dilution finale de l’échantillon soit inférieure à 1 %Acquérir les spectres EPR à pH intermédiaire comme décrit dans le protocole textuel. Pour l’étalonnage de la sonde de sensibilité à l’oxygène, acquérez les spectres EPR de la sonde à différentes concentrations d’oxygène, comme décrit dans le protocole texte. Pour l’étalonnage de la sonde Pi, acquérir les spécifications EPR de la sonde à différentes concentrations de phosphate.Utilisez la solution radicalaire avec un pH proche de la PKA et titrez-la avec différentes concentrations de phosphate. Maintenez la température et la composition du gaz comme auparavant. Dans le cas du modèle tumoral MET1 pour l’internalisation de la sonde particulaire dans les cellules MET1, ajoutez 100 microlitres de suspension soniquée dans un ballon T75 avec 10 millilitres de milieu de culture contenant des cellules MET1.Toutes les procédures se déroulent dans une enceinte de biosécurité et le milieu contient de la pénicilline et de la streptomycine pour minimiser l’infection potentielle. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures ou jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence. Aspirez le milieu et lavez les cellules cinq fois avec 10 millilitres de PBS.Détachez les cellules avec cinq millilitres de tripson EDTA. Après avoir collecté les cellules et centrifugé comme précédemment, colorez l’échantillon de cellules du colorant d’exclusion pour déterminer la viabilité et la quantité des cellules. Suspendez les cellules à une concentration d’un million de cellules par 100 microlitres dans un DMEM minimal.À l’aide d’une seringue à insuline, injectez lentement 100 microlitres de la suspension cellulaire contenant les microcristaux internalisés dans les coussinets adipeux mammaires numéro quatre d’une souris femelle de type sauvage âgée de huit semaines, comme décrit dans le protocole textuel. Surveiller l’initiation et la croissance de la tumeur. Pour les mesures spectroscopiques EPR, anesthésier les souris par inhalation d’un mélange d’isophlorane dans l’air à l’aide d’un appareil d’anesthésie comme décrit dans le protocole textuel.Effectuez des mesures fonctionnelles à l’aide d’un spectromètre EPR en bande L en plaçant le résignateur de bobine de surface sur une glande mammaire normale ou une tumeur mammaire. Procédez à la mise au point du spectromètre. Dans le cas de sondes solubles, acquérir les spectres EPR immédiatement après l’injection de la sonde pendant cinq à 10 minutes.Acquérez les spectres EPR de la sonde particulaire implantée pendant cinq à 10 minutes pendant plusieurs semaines après l’implantation. Enfin, analysez les spectres EPR et les sondes comme décrit dans le protocole texte. La sensibilité spectrale EPR de la sonde particulaire LiNc-BuO à l’oxygène est illustrée ici.Le spectre EPR a été mesuré à 0 % de pO2 et 37 degrés Celsius. Les dépendants représentatifs de la largeur de ligne du spectre EPR de la suspension de la sonde sur la pression partielle d’oxygène sont indiqués. La largeur de la ligne augmente linéairement avec le pO2.Un spectre mesuré dans le tissu tumoral mammaire d’une souris femelle anesthésiée correspond à un tissu d’oxygène partiel de 7,5 millimètres de mercure. Les spectres EPR en bande L de la solution de la sonde NR ont été acquis à 37 degrés Celsius à différents niveaux de pH. Les dépendants de la constante de séparation hyperfine observée sur le pH sont tracés et ajustés avec la courbe de titrage standard.L’évaluation multifonctionnelle du microenvironnement tumoral combine la sonde LiNc-BuO sensible à l’oxygène dans le pH à double fonction de la sonde redox NR. Le spectre triplet observé du NR est superposé à la ligne EPR unique de la sonde LiNc-BuO intégrée dans la tumeur. L’évaluation in vivo par EPR des concentrations de glutathion dans les tissus intracellulaires est présentée ici.La cinétique du changement d’intensité spectral monoradical mesurée par l’EPR en bande L dans la tumeur mammaire dans la glande mammaire normale des souris FVBN immédiatement après l’injection intratissulaire de la sonde RSSR est montrée. La cinétique plus rapide reflète la concentration plus élevée de GSH dans le tissu tumoral. La technique aide les chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer avec des opportunités inégalées pour la réalisation in vivo de paramètres cellulaires, physiologiques importants du microenvironnement tumoral et le transpotentiel pour la traduction.La sensibilité des sondes selon les procédures précédentes nécessite une expertise en chimie de synthèse et est essentielle pour la présentation. Notre centre a signalé la difficulté de cette technologie et aux sites sur une base collaborative.

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