Name: Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez la synthèse de micelles amphiphiles peptidiques ciblant les monocytes pour l'imagerie de l'athérosclérose. Cette méthode permet de différencier les lésions précoces et avancées avec une spécificité accrue.

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Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.

Remarque : Lire la fiche signalétique pour réactifs et suivre toutes les mesures de sécurité chimique tel que requis par l’institution locale.
1. préparation du MCP-1 PAMs
<ol><li>
Préparation du peptide de MCP-1
	<ol>
<li>Peser 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang dans un réacteur (RV). Rincez le côté de la RV avec 5 mL de dimethylforamide (DMF) sous une hotte chimique.</li>
		<li>Charger le RV sur un synthétiseur de peptide de benchtop automatisé. Flacons d’acides aminés charge préemballé, N « - CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C », de la C à l’extrémité N-terminale. Comprend un flacon vide à la fin de l’étape finale de déprotection. Remarque : Un peptide brouillé avec séquence, N « - CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C », peut aussi être synthétisé en utilisant le même protocole.</li>
		<li>Synthèse terminée, transférer les peptides sur résine de la RV dans le flacon à scintillation avec 2-3 mL de méthanol jusqu'à ce que toutes les résines sont transférées. Après que la résine a coulé vers le bas, retirez le surnageant de méthanol et évaporer le restant à sec. Aspirateur sec pendant 2 h supplémentaires, ou toute la nuit à température ambiante.</li>
		<li>Faire 12 mL de solution clivage composé acide (TFA) :ethanedithiol:water:triisopropylsilane à 94:2.5:2.5:1 % en volume dans une hotte chimique. Agiter la solution de clivage pour s’assurer que c’est mélangé uniformément. ATTENTION : Triisopropylsilane et éthanedithiol étant sensible à air, argon purge des flacons stocks de triisopropylsilane et éthanedithiol pendant 1 min avant de les remettre.</li>
		<li>Placer le récipient de synthèse (SV) sur un agitateur de bras de serrage au bas de la moitié de la SV. Transférer le peptide-résine à la SV avec 2 mL de solution de clivage jusqu'à ce que tous les adsorbants sont transférés.</li>
		<li>Laver les côtés de la SV avec 3 mL de solution de clivage. Fermez le bouchon de la SV et l’agiter à 300 oscillations/min pendant 4 h.</li>
		<li>Peser avec un tube de centrifugation de vide de 50 mL. Enregistrement de la messe.</li>
		<li>Après 4 h, vider la solution de peptide clivés de la SV dans le tube de centrifuger de 50 mL. Rincer la SV plusieurs fois avec la solution restante de clivage.</li>
		<li>Évaporer le peptide clivées solution avec de l’azote jusqu'à ce qu’il y a moins de 4 mL restant dans le tube à centrifuger.</li>
		<li>Ajouter 36 mL d’éther glacé à la solution de peptide clivée.</li>
		<li>Vortex la solution jusqu'à ce qu’il est complètement blanc ou jaune. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 40 mL éther glacée dans le tube. Vortex et laisser agir à nouveau. Répétez le processus de centrifugation. Décanter le liquide surnageant.</li>
		<li>Sécher le culot PA brut avec azote gaz purge jusqu'à ce que l’éther est visiblement évaporé.</li>
		<li>Ajouter 20 mL bidistillée, vortex, l’eau et laisser agir jusqu'à ce que le peptide est complètement dissous dans la solution.</li>
		<li>Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.</li>
		<li>Une fois que le peptide est séché, peser la masse du tube à centrifuger contenant le peptide brut. Dissoudre le peptide brut à 5 mg/mL d’eau.</li>
		<li>Dissoudre 25 mg de peptide de MCP-1 brut dans 5 mL d’eau bidistillée à une concentration totale de 5 mg/mL. Purifier le peptide de MCP-1 brut par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide de 0,1 % TFA dans de l’eau (solvant A) et 0,1 % TFA dans l’acétonitrile (solvant B) comme des phases mobiles sur une colonne en phase inversée C8. Injecter les 5 mL du peptide dans la CLHP. Remarque : La phase mobile initiale était composé de 100 % de solvant A un débit de 9,0 mL/min. diminuer le solvant A lentement à 30 % en 27 min et le tenir à cette composition pendant 3 min. retour du gradient à 100 % de solvant un plus 3 min et maintenez à cette composition pendant 1 min donner une exécution totale de 34 min. maintenir la température de la colonne à 55 ° C. Utiliser le mode de source d’ions positifs pour l’analyse. L’acide formique peut être utilisé à la place de TFA, si TFA est trop acide pour la colonne HPLC. Il est recommandé que la vitesse de rampe de composition du solvant organique ne doit pas dépasser 2%/min pour une meilleure séparation.</li>
		<li>Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice pour le produit attendu de m/z à 2 890. NOTE : Dissoudre l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique à 1 mg/mL dans l’acétonitrile/eau (50 : 50 % en volume) comme la solution de la matrice. Repérez les 0,75 µL de solution de matrice sur la plaque MALDI, suivie de 0,75 µL de chaque fraction. Effectuer l’analyse à l’aide d’un mode positif ion réfléchissant à une gamme de masses de 500-5 000 Da.</li>
		<li>Combiner des fractions de produit, souffler dans l’acétonitrile, geler et lyophiliser peptides purifiés à sec.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de MCP-1 PA
	<ol>
<li>Préparer un excès molaire 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maléimide au peptide dans des flacons séparés à scintillation. Dissoudre les deux composés dans l’eau bidistillée à ~ 15 mg/mL. Laisser agir pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les deux solutions sont tout à fait claires. Remarque : Le DSPE-PEG (2000)-Cy5 est synthétisé en utilisant le même protocole avec DSPE-PEG (2000)-amine et Cy5 fonctionnalisés ester N-hydroxysuccinimide (NHS), à l’exception de l’étape 1.2.3, où le pH de la solution est ajusté à 8,5.</li>
		<li>Ajouter DSPE-PEG (2000)-maléimide solution à la solution de peptide. Vortex et laisser agir.</li>
		<li>Ajouter 1 M NaOH goutte à goutte (1 µL) à la fois jusqu'à ce que le pH de la solution est de 7.</li>
		<li>Solution de purge d’azote pendant 5 min. remuer la solution du jour au lendemain.</li>
		<li>Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.</li>
		<li>Une fois que le produit brut est séché, dissoudre le solide à 5 mg/mL d’eau.</li>
		<li>Purifier par HPLC, tel que décrit ci-dessus. NOTE : Peptide non conjuguée et DSPE-PEG(2000) devraient éluer entre 15-30 % concentration organique (% en volume), tandis que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugué doit éluer entre 40-50 % concentration organique.</li>
		<li>Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI pour les correspondants m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 devrait avoir un pic large m/z à 5 760. NOTE : acide 2, 5-dihydroxybenzoïque est mieux utilisé comme matrice pour DSPE-PEG (2000)-MCP-1 avec la MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assemblée de MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Dissoudre 1,75 mg PAs de MCP-1 avec 3 mL de méthanol dans un flacon 1-dram. Laisser agir jusqu'à dissolution complète de la MCP-1 PA. NOTE : Cy5 amphiphiles peut être incorporé à un rapport molaire de 10 : 90 PA de MCP-1 pour les applications d’imagerie.</li>
		<li>Evaporer le méthanol en présence d’azote dans un mouvement circulaire tout en rinçant le méthanol restant sur le côté de la cuvette jusqu'à ce qu’un film uniform est formé au fond du flacon. Séchage sous vide le film du jour au lendemain.</li>
		<li>Hydrater le film avec 3 mL de tampon phosphate ou de l’eau saline (PBS), afin de préparer une solution de 100 µM de MCP-1 PAMs. Vortex doucement et laisser agir la solution jusqu’au clair. Incuber à 80 ° C pendant 30 min. Remarque : La température élevée a été montrée pour accélérer le processus d’auto-assemblage et permet au composant de peptide former la structure secondaire plus stable, tout en réduisant la micellaire critique concentration (CMC)42,43.</li>
		<li>Cool la dispersion obtenue à la température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caractérisation des MCP-1 PAMs
<ol><li>
Diffusion dynamique de la lumière (DLS) et potentiel zêta
	<ol>
<li>Place de 100 µM de MCP-1 PAM ou brouillée PAM dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta. Remarque : Des cuvettes de potentiel DLS et zeta peuvent être différents selon les instructions de l’instrument.</li>
		<li>Equilibrer l’instrument à la température ambiante. Mesurer la taille et la charge superficielle de la PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopie électronique à transmission (TEM)
	<ol>
<li>Ajouter 7 µL de 50 µM MCP-1 PAM ou brouillée PAM vers une grille de TEM suspendu dans une pince fermeture automatique pour 5 min. mèche à la goutte avec une lingette de tâche délicate.</li>
		<li>Ajouter 7 µL d’eau pour laver la grille. Mèche à la goutte.</li>
		<li>Ajouter 7 µL de 1 wt % l’acide phosphotungstique pour 2 min. mèche à la goutte. Répétez l’étape 2.2.2.</li>
		<li>Sécher la grille TEM avant l’analyse TEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
	<ol>
<li>Allumez l’azote pendant 5-10 min avant l’utilisation de l’instrument.</li>
		<li>Déposer 300 µL de vide (eau ou PBS) dans la cuvette.</li>
		<li>Mesurer les spectres à 190-265 nm, 0. 2 mm-longueur du chemin avec un temps d’intégration 1 s et une bande passante de 1 nm à température ambiante. Collecter 3 répétitions.</li>
		<li>Mesure 100 µM peptide de MCP-1, MCP-1 PAM, brouillés peptidique et brouillés PAM sous la même condition décrite à l’étape 2.3.3. Soustraire de l’essai à blanc.</li>
		<li>Ajuster les données à l’aide d’une interpolation linéaire des spectres de base polylysine.</li>
		<li>Éteignez l’appareil. Attendre 10 min avant d’éteindre l’azote.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. l’analyse in Vitro de MCP-1 PAMs
<ol><li>
In vitro de biocompatibilité
	<ol>
<li>Culture et développez WEHI 274,1 murines monocytes dans Eagle modifié milieu de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol à 37 ° C moins de 5 % de CO2 passage 5. NOTE : WEHI 274,1 sont des cellules en suspension. Lorsque la mise en culture, les médias devraient être réapprovisionnés tous les 2-3 jours.</li>
		<li>Monocytes pipette dans les médias dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Aspirer les anciens médias et resuspendre dans 10 mL de milieu frais dans le tube à centrifuger. Mélanger lentement jusqu'à ce que les cellules sont réparties uniformément dans les médias. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre.</li>
		<li>Diluer les cellules telles qu’il y a 4 000 monocytes par 90 µL des médias / puits. Ajouter 90 µL de cellules dans le puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant 24 h. Remarque : Évitez d’utiliser les puits sur le bord extérieur de la plaque pour éviter des différences entre évaporation et des variations thermiques de la plaque. Remplir les puits extérieurs avec 100 µL PBS.</li>
		<li>Dissoudre 0,15 µmol de peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide brouillé ou brouillés-PAM dans 150 µL de PBS dans des tubes de microcentrifuge distinct, stérilisé. Effectuer des dilutions pour faire 65 µL de 1, 10 et 100 µM de chaque échantillon.</li>
		<li>Ajouter 10 µL PBS de chacune des concentrations dans les puits contenant WEHI 274,1 (volume total : 100 µL par bien, 6 lignes, total de 96 puits). Incuber pendant 72 h.</li>
		<li>Ajouter 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure.</li>
		<li>Analyser l’absorbance à l’aide d’un lecteur à 490 nm ou selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liaison de micelle in vitro
	<ol>
<li>Monocytes graine 500 000 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL de support contenant 100 µM étiquetés Cy5 MCP-1 PAM (10 : 90 rapport molaire du DSPE-PEG (2000)-Cy5 et PA de MCP-1). Incuber pendant 1 heure.</li>
		<li>Recueillir WEHI 274,1 par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer les médias.</li>
		<li>Resuspendre et laver les cellules dans 2 mL de PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le PBS. Répétez le processus de lavage avec 2 mL de PBS. Aspirer le PBS.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Pipette les cellules fixes sur une lamelle de verre stériles dans les puits d’une plaque de 6 puits. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez le paraformaldéhyde. Lavez et rincez une fois avec 2 mL de PBS. Remettre en suspension avec 1 mL PB Remarque : Lorsque le rinçage, ne pas perturber les cellules sur la lamelle couvre-objet.</li>
		<li>Mettez 10 µL de 90 % de glycérol dans du PBS sur une diapositive. Utiliser une aiguille et une pince pour ramasser de la lamelle. Sécher le bord de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur une lame face vers le bas.</li>
		<li>Doucement, sceller le bord de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placer au réfrigérateur jusqu’au moment de l’imagerie.</li>
		<li>Utiliser un confocal laser scanning microscope (CLSM) installé avec des lasers pour Cy5 à λexcitation = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et la diversité st...

Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myocarde,4,5. Les cellules endothéliales expriment des molécules de cytokines et d’adhérence, incluent des MCP-1 qui se lie au récepteur des chimiokines C-C (CCR2) à la surface des monocytes6,7,8. Cholestérol oxydé convertit monocytes macrophages durant les premiers stades de formation de la plaque, qui amplifie la réponse inflammatoire dans la région et conduit à la lésion des tissus et la formation de plaques instables ou vulnérables9, 10.
Traditionnellement, l’athérosclérose est évaluée en évaluant la sténose luminale par imagerie anatomique à l’aide d’ultrasons ou angiographie11,12. Cependant, ces méthodes ne peuvent déterminer un rétrécissement sévère de la paroi artérielle et pas le stade précoce de l’athérosclérose, car la croissance initiale plaque entraîne un remodelage artériel maintenir la taille de l’artère et le sang écoulement tarifaire12,13, 14. Par conséquent, les angiogrammes sous-représenter la prévalence de l’athérosclérose. En outre, les techniques d’imagerie non invasives comme une émission de photon unique calculé tomographie, tomographie par émission de positons et l’imagerie par résonance magnétique ont récemment été utilisées pour caractériser la morphologie de la plaque car ils peuvent fournir des détails initiaux et caractérisation des plaques. Toutefois, ces modalités sont souvent limitées par le manque de sensibilité, résolution spatiale, ou exigent l’utilisation de rayonnements ionisants, rendant la progression plaque d’imagerie à des stades différents, beaucoup plus difficile de15,16, 17. Un système d’imagerie permettant d’identifier plus précisément les plaques à différents stades de l’athérosclérose reste à développer.
NANOPARTICULES ont montré pour être une plate-forme émergente pour in vivo plaque ciblage et diagnostics18,19,20,21. En particulier, PAMs sont avantageuse en raison de leur diversité chimique et de la capacité d’accueillir une variété de moitiés, compositions, tailles, formes et fonctionnalisation de surface22. Peptides amphiphiles (Fe) se composent d’un peptide « tête hydrophile, » attaché à une queue hydrophobe, qui sont généralement des lipides ; Cette structure amphiphile confère des capacités de l’auto-assemblage et permet un affichage multivalent des peptides sur la surface des particules22,23,24. Le peptide polaires peuvent influer sur la forme des particules par le biais de pliage et de liaisons hydrogènes entre les peptides25. Les peptides qui se replient grâce à l’interaction de feuillet β auraient dû être divulgués afin de former des micelles allongés, tandis que α-hélicoïdale confirmation peut former deux micelles sphériques et allongée22,23,24, 25,26,27. Linkers de polyéthylène glycol (PEG) qui protègent la charge superficielle du peptide peuvent être placés entre le peptidiques hydrophiles et la queue hydrophobe de PAMs, améliorer l’accessibilité de la NANOPARTICULE dans la circulation systémique28, 29 , 30 , 31. PAMs sont aussi avantageuses car elles sont biocompatibles et auraient dû être divulgués d’avoir un large éventail d’applications32,,33. Solubilité dans l’eau des micelles offre un avantage sur les autres systèmes à base de nanoparticules comme certaines nanoparticules polymériques qui ne sont pas solubles dans l’eau et ont dû être suspendu en solubilisants pour injections34. En outre, la possibilité de créer des PAMs qui démonter en réponse à un stimulus spécifique fait PAMs un candidat attrayant pour drogue intracellulaire contrôlée livraison35.
En se liant au récepteur CCR2 et qui s’accumulent dans la crosse aortique, PAMs ont été développées précédemment monocyte visant à surveiller les différents stades de lésions athéroscléreuses dans l' aorte9. Chez les souris- / - de l’ApoE, accumulation de monocytes augmente proportionnellement à la plaque progression36. En outre, il a été constaté que les patients avec des plaques sujettes à rupture, stades contiennent des quantités plus élevées de monocytes37. Par conséquent, la modification des PAMs d’incorporer des MCP-1 est utile car il permet une plus grande précision de ciblage et de différencier les lésions athéroscléreuses et fin-début. Ces études de validation a également vérifié que PAMs sont suffisamment sûres pour être utilisé en préclinique et sont effacées insuffisants38. Monocytes et l’inflammation étant caractéristique à d’autres maladies, MCP-1 PAMs ont le potentiel d’être utilisé pour des applications thérapeutiques et diagnostiques dans d’autres maladies au-delà de l’athérosclérose8,39,40 , 41.
Ici, nous rapportons la fabrication de hautement évolutif et auto-assemblés PAMs de MCP-1 qui fait preuve de la particule taille optimale, charge superficielle et ciblage sélectif aux monocytes pour des applications d’imagerie dans l’athérosclérose.

<table><tbody><tr><td>1,2-éthanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL, polypropylène</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>pour diverses applications</td></tr><tr><td>Acide 2,5-dihydroxybenzoïque, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>pour MALDI</td></tr><tr><td>25 mL jetable Pipettes sérologiques</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables de 5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>pour diverses applications</td></tr><tr><td>Gourde de culture de 75 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Récipient de réaction de 75 mL</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>pour la synthèse de peptides</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 96 puits</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>pour le dosage MTS</td></tr><tr><td>Acétonitrile, grade HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>pour la purification HPLC</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>pour la synthèse PAM</td></tr><tr><td>Pipette en verre borosilliqué, pointes longues</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>pour diverses applications</td></tr><tr><td>Lamelle, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>pour la microscopie confocale</td></tr><tr><td>Cy5 amine</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>pour la conjugaison peptidique</td></tr><tr><td>Éther diéthylique, grade ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>pour la précipitation peptidique</td></tr><tr><td>Jetable seringues, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>pour la purification HPLC</td></tr><tr><td>Hémocytomètre double neubauer réglé</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amine</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>pour la conjugaison peptidique</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maléimide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>pour la conjugaison peptidique</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&nbsp ;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>pour la conjugaison à Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified eagle medium-high glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, qualifié, inactivé par la chaleur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC pour la</td><td>synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Résine Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>pour la synthèse de peptides</td></tr><tr><td>Acide formique, grade optima LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>pour la purification HPLC</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>pour la microscopie confocale</td></tr><tr><td>Compteur de pointage manuel</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>pour le comptage de cellules</td></tr><tr><td>Barres d’agitation magnétiques, </td><td>VWR</td><td>58949-006</td> en forme d’œuf <td>pour la conjugaison peptidique</td></tr><tr><td>Méthanol, certifié ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>pour la synthèse PAM</td></tr><tr><td>Kit de test colorimétrique de prolifération cellulaire MTS</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>pour le dosage MTS</td></tr><tr><td>N,N-Diméthylformamide, grade de séquençage</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>N-Méthylmorpholine</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>pour la fixation des cellules</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>pour diverses applications</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine, 10 000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Récipient de synthèse peptidique, 25 mL& nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>pour la synthèse peptidique</td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>pour TEM</td></tr><tr><td>Spectre</td><td>de pipéridine</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>pour la synthèse de peptides</td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre ordinaire 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>pour microscopie confocale</td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs, stériles&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pince à épiler à fermeture automatique</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>pour TEM</td></tr><tr><td>Film de support TEM</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>pour TEM</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>pour le clivage peptidique et la purification HPLC</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>pour le clivage peptidique</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>pour le comptage cellulaire</td></tr><tr><td>Pince à épiler, à usage général dentelé</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>pour la microscopie confocale</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp ; CRL-1679</td><td></td></tr><tr><td>synthétiseur de peptides de paillasse automatisé de monocytes</td> murins <td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Synthétiseur de peptides de paillasse</td></tr><tr><td>&alpha ;- cyano-4- acide cinnamique, 99 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>pour MALDI</td></tr></tbody></table>

synthèse de ciblage de monocyte peptide amphiphile micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.

Préparation du PAM de MCP-1 Le motif de liaison CCR2 (résidus 13-35) de la protéine MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou un peptide brouillé [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] a été modifié par l’ajout d’un résidu de cystéine sur l’extrémité N-terminale. Le peptide de MCP-1 a été synthétisé par une méthode de phase solide Fmoc-négociée à l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé. Le peptide brut a été purifié par HPLC en phase inversée sur une colonne de C8 à 50 ° C à l’aide ...

Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.

Synthèse de ciblage de Monocyte Peptide Amphiphile Micelles pour l’imagerie de l’athérosclérose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

L’objectif global de ce protocole est de synthétiser des micelles amphiphiles peptidiques ciblant les monocytes pour l’imagerie de l’athérosclérose. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine cardiovasculaire sur l’imagerie diagnostique de la plaque d’athérosclérose. Le principal avantage de cette technique est que l’incorporation de micelles peptidiques amphiphiles avec MCP-1 permet une plus grande spécificité de ciblage et une différenciation entre les lésions athéroscléreuses à un stade précoce et avancé.Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic de la plaque à différents stades de l’athérosclérose, car les patients atteints de plaques tardives sujettes aux ruptures contiennent un nombre plus élevé de monocytes. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’athérosclérose, elle peut également être appliquée à d’autres maladies, telles que le cancer. Jonathan Wang, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec moi.Commencez par peser 0,25 millimole de résine fmach-L-lysine-bach-wong dans un récipient de réaction. Transférez le récipient dans une hotte chimique et rincez les côtés du récipient avec cinq millilitres de diméthylforamide. Chargez le récipient de réaction et les flacons d’acides aminés préemballés de l’extrémité C-à-N sur un synthétiseur peptidique de paillasse automatisé, y compris un flacon vide à la fin pour le réglage final de la déprotection.Après avoir exécuté la synthèse, transférez les peptides et la résine du récipient de réaction dans un flacon à scintillation contenant deux à trois millilitres de méthanol jusqu’à ce que toute la résine ait été transférée. Lorsque la résine a coulé au fond du flacon, retirez le supernane et laissez la résine sécher à l’air, puis faites sécher sous vide pendant au moins deux heures à température ambiante. Lorsque le flacon est complètement sec, à l’aide d’une pince, fixez la moitié inférieure d’un récipient de synthèse sur un agitateur de bras et ajoutez deux millilitres de solution de clivage dans le flacon à scintillation.Transférez tout le volume de résine peptidique dans le récipient de synthèse et lavez les côtés du récipient avec trois millimètres de solution de clivage fraîche. Ensuite, secouez le récipient, bouché, pendant quatre heures à 300 oscillations par minute. À la fin de l’incubation par agitation, égouttez la solution peptidique clivée dans un tube conique équilibré de 50 millilitres et rincez le récipient de synthèse plusieurs fois avec le reste de la solution de clivage.Évaporez la solution peptidique clivée avec de l’azote jusqu’à ce qu’il reste moins de quatre millilitres de solution dans le tube à centrifuger et ajoutez 36 millilitres d’éther glacé à la solution clivée peptidique. Vortex la solution résultante. Lorsque la suspension devient complètement blanche ou jaune, granulez les peptides par centrifugation.Remettez le peptide en suspension dans 40 millilitres d’éther glacé et de vortex et sonicez à nouveau le peptide. Après une deuxième centrifugation et une décantation du surnageant, sécher la pastille amphiphile de peptide brut avec une purge à l’azote gazeux. Lorsque l’éther s’est visiblement évaporé, ajoutez 20 millilitres d’eau double distillée dans le tube et faites un vortex et sionisez le tube jusqu’à ce que le peptide soit complètement dissous en solution.Congelez la solution et lifelize jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Ensuite, pesez à nouveau le tube et dissolvez le peptide brut dans cinq milligrammes par millilitre d’eau. Ensuite, injectez tout le volume de peptide MCP-1 brut dans un instrument de chromotographie liquide ou HPLC haute performance.Analysez chaque fraction à l’aide de la spectroscopie de masse par désorption ionisation laser assistée par matrice pour la charge massique attendue du produit à 2 890. Combinez ensuite les fractions de produit. Soufflez l’acétonitrile et congelez et lifelisez les peptides purifiés jusqu’à ce qu’ils soient secs.Pour préparer le peptide amphiphile MCP-1 ou PA, dissolvez d’abord le peptide lifelized dans 15 milligrammes par millilitre d’eau et combinez la solution peptidique avec 15 milligrammes par millilitre de solution millimétrique DSPE PEG 2000. Ajoutez une mole d’hydroxyde de sodium goutte à goutte jusqu’à ce que le pH de la solution soit égal à sept. Ensuite, purgez l’azote pendant cinq minutes, puis remuez pendant la nuit.Le lendemain matin, congelez et lifelisez la solution. Lorsque le produit brut est sec, dissolvez le solide dans cinq milligrammes par millilitre d’eau et purifiez le peptide par HPLC, comme nous venons de le démontrer. Pour assembler les membranes PA, dissolvez 1,75 milligramme de PA MCP-1 dans trois millilitres de méthanol dans un flacon d’un dram et sonicate jusqu’à ce que le PA MCP-1 soit complètement dissous.Évaporez le méthanol sous l’azote tout en déplaçant le flacon d’un mouvement circulaire et en rinçant le méthanol restant sur les côtés du flacon, jusqu’à ce qu’un film uniforme se forme au fond. Faites sécher le film sous vide pendant la nuit. Le lendemain matin, hydratez le film avec trois millilitres d’eau pour obtenir une solution de MCP-1 PAM de 100 micromolaires et agitez doucement la solution jusqu’à ce qu’elle soit claire.Incuber la solution à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis refroidir la dispersion obtenue. Dans l’expérience représentative suivante, le MCP-1 et le peptide brouillé ont été purifiés par HPLC en phase inverse sur une colonne d’AC à 50 degrés Celsius en utilisant 0,1 % d’acide trifluoroacétique dans des mélanges d’eau acétonitrile. Et caractérisé par une spectrométrie de masse par ionisation par désorption laser assistée par matrice, comme cela vient d’être démontré.Les peptides contenant le désistement ont été conjugués sur du milliamide DSPE PEG 2000 pour produire des conjugués peptidiques DSPE PEG 2000 via une liaison thioéther et purifiés par HPLC à l’aide d’une colonne C4. L’analyse de la diffusion dynamique de la lumière et l’imagerie par microscopie électronique à transmission des monocytes ciblant les PAM ont révélé des nanoparticules sphériques bien dispersées avec des potentiels zêta légèrement positifs. L’analyse par spectroscopie circulaire a confirmé que l’incorporation du peptide MCP-1 dans la micelle a amélioré la structure secondaire.Les monocytes d’incubation amalse avec des concentrations micromolaires allant jusqu’à 100 micromolaires de peptide MCP-1, de PAM MCP-1, de peptide brouillé et de PAM brouillé pendant 72 heures ont démontré la viabilité et la biocompatibilité des peptides. La liaison spécifique des monocytes aux PAM MCP-1 par rapport aux PAM brouillés est ensuite établie par microscopie confocale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer un monocyte ciblant le peptide amphiphile, micelle, grâce à la synthèse et à la purification du peptide MCP-1, à l’assemblage de l’amphiphile et des micelles du peptide MCP-1.N’oubliez pas que travailler avec un réactif chimique peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la lecture de la fiche signalétique et le travail à l’intérieur d’une hotte chimique, doivent toujours être prises lorsque vous travaillez avec ces matériaux.

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