Flux de travail complet pour le génome-large d’Identification et de la Meta-analyse de l’Expression de la famille des gènes ATL E3 ubiquitine Ligase à Grapevine

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une caractérisation exhaustive d’une famille de gènes chez les plantes selon une approche globale comprenant la définition de la structure des gènes, des motifs protéiques concernés, de la localisation chromosomique, des duplications de gènes et des modèles d’expression. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la classification des plantes dans des familles, telles que l’identification génomique mondiale des membres de la famille et leur transcriptomie fournit cela grâce à l’analyse de l’expression génique. Le principal avantage de l’ensemble de la procédure est de fournir une liste exhaustive des étapes expérimentales permettant d’obtenir une caractérisation complète de la famille de gènes.

Cette procédure peut être appliquée à toute famille de gènes de n’importe quelle espèce végétale pour laquelle des données génétiques sont disponibles. De plus, cette approche fournit des informations précieuses pour identifier des candidats intéressants pour des études fonctionnelles. Pietro Ariani de mon laboratoire fera la démonstration de l’ensemble de la procédure.

Ouvrez la page Web Blast et cliquez sur la section protein blast. Dans le champ Entrer la séquence de requête, entrez la séquence d’acides aminés de la protéine qui sera utilisée comme sonde pour identifier les autres membres de la famille. Utilisez une protéine qui possède toutes les caractéristiques importantes qui caractérisent la famille.

Ensuite, dans le champ choisissez l’ensemble de recherche, sélectionnez la base de données de protéines de référence et l’organisme d’intérêt. Maintenant, dans la sélection du programme de terrain, sélectionnez l’algorithme PSI-BLAST. Si vous le souhaitez, cliquez sur les paramètres de l’algorithme pour ajuster les paramètres avancés tels que la séquence cible maximale et la matrice de score.

La valeur E est le seuil qui, pour cette recherche, est réduit de 005 à 001. Cliquez sur le bouton BLAST pour exécuter l’analyse. Parmi toutes les séquences affichant des correspondances relatives à la requête, désélectionnez les entrées qui n’appartiennent clairement pas à la famille.

Pour ce faire, cliquez sur la coche dans la colonne de sélection de PSI-BLAST. Ensuite, exécutez une deuxième itération PSI-BLAST en cliquant sur le bouton Aller. Toutes les séquences nouvellement identifiées seront surlignées en jaune.

Là encore, désélectionnez les résultats qui n’appartiennent pas à la famille. Poursuivez ce processus jusqu’à ce que l’algorithme ne trouve aucune entrée pertinente ou qu’il atteigne la convergence. Une fois que tous les faux positifs sont éliminés, rassemblez les séquences d’acides aminés dans un fichier au format FASTA et téléchargez le fichier dans la suite logicielle bio-informatique.

Ensuite, sélectionnez toutes les séquences importées dans la liste et cliquez sur le bouton aligner/assembler dans la barre d’outils. Cliquez ensuite sur l’alignement multiple par paire et sélectionnez Alignement MUSCLE et OK. L’alignement sera maintenant effectué à l’aide des valeurs par défaut. Visualisez maintenant le logo de la séquence de l’alignement et inspectez visuellement les gènes pour rechercher les faux positifs.

Une analyse plus approfondie des paramètres physiques et des domaines protéiques, de la distribution chromosomique, des duplications et de l’organisation des introns d’exon est décrite dans le protocole textuel. Ensuite, analysez les relations entre les membres de la famille ATL à travers la construction d’un arbre phylogénétique de haute qualité et la définition d’une nomenclature familiale. Tout d’abord, récupérez les séquences ATL de systeliana arabes, requises comme références pour une nomenclature de gènes de vigne, à partir de la base de données UmoProt pour référence.

Faites ensuite un fichier FASTA comprenant toutes les séquences nucléotidiques de la vigne et les membres de la famille des gènes Arabidopsis pour l’analyse phylogénétique. Parcourez maintenant la page d’accueil de phylogénie France et sélectionnez le pipeline d’analyse de phylogénie. Un clic convient dans la plupart des cas, mais si nécessaire, il est possible de sélectionner des paramètres avancés spécifiques à l’aide des options avancées ou même une analyse entièrement personnalisée à l’aide des options à la carte.

Ensuite, entrez un nom pour l’analyse et téléchargez le fichier FATA. Cliquez ensuite sur Soumettre pour exécuter l’analyse. Si cette procédure génère un message d’erreur, effectuez chaque étape du pipeline de la suite de phylogénie individuellement.

Tout d’abord, rendez-vous sur la page d’accueil du logiciel MUSCLE et téléchargez le fichier FATA. Sélectionnez Pearson FASTA comme format de sortie et soumettez-le. Ensuite, téléchargez le fichier au format FASTA et éliminez toutes les positions mal alignées.

Ouvrez l’outil serveur G-block, téléchargez le fichier FASTA d’alignement, sélectionnez l’ADN comme type de séquence et choisissez la rigueur qui correspond le mieux à l’analyse. Pour l’alignement d’une famille de gènes ATL de vigne, sélectionnez les trois options proposées pour une sélection moins stricte en raison de la divergence de séquence élevée. Cliquez ensuite sur obtenir des blocs pour exécuter l’analyse.

Pour enregistrer les résultats, cliquez sur l’alignement résultant en bas de la page de sortie et créez un nouveau fichier FATA. Les blocs G éliminent la position mal alignée dans les régions divergentes d’un ADN ou l’alignement d’aiguillon afin qu’il devienne plus adapté à une analyse phylogénétique. Pour cette étape, la sélection des paramètres impericle pour la rigueur des colonnes est cruciale pour s’assurer qu’elles sont un passif des trois.

Pour compléter l’arbre, nous nous tournons vers la page d’accueil de Phylogeny France. Là, sélectionnez le pipeline à la carte et désélectionnez les options suivantes :alignement multiple et curation d’alignement. Ensuite, cliquez sur créer un flux de travail, téléchargez le fichier FASTA organisé par G-blocks, sélectionnez la procédure d’amorçage et utilisez les paramètres et paramètres par défaut.

Enfin, cliquez sur Soumettre pour exécuter l’analyse. Le processus est terminé étape par étape. Maintenant que l’arbre phylogénique est fabriqué, effondrez les branches mal supportées avec des valeurs bootstrap inférieures à 70 %Ensuite, téléchargez les résultats finaux au format Newick pour une analyse plus approfondie.

Le protocole textuel fournit des instructions sur l’attribution d’un nom de gène en fonction de la phylogénie. Pour ce protocole, créez un fichier de format texte tapé, linéaire et linéaire des valeurs d’expression normalisées arma tirées d’une bibliothèque d’expression génique. Organisez les valeurs de chaque gène de la famille sous les mêmes rangées de motifs.

Ensuite, effectuez l’analyse hiérarchique bi-cluster à l’aide d’un logiciel de visualisation multi-expériences. Tout d’abord, téléchargez la matrice de données de travail et sélectionnez le fichier texte. Sélectionnez un tableau unicolore et supprimez la coche de l’annotation de chargement lorsqu’aucune annotation automatique n’est fournie.

Sélectionnez la valeur d’expression la plus à gauche de l’aperçu de la table d’expressions, puis cliquez sur le bouton Charger. Ensuite, ajustez les données en appliquant la transformation Log2 et la normalisation gène/ligne. Définissez ensuite la limite d’échelle appropriée.

Calculez maintenant le clustering hiérarchique. Dans le champ d’optimisation de l’ordre, sélectionnez optimiser l’ordre des feuilles des gènes et optimiser l’ordre des feuilles des échantillons. Ensuite, dans le champ de sélection de la méthode de liaison, sélectionnez Agrégation de liaison moyenne et dans le champ de sélection de la matrice de distance, choisissez Corrélation de Pearson.

Cliquez ensuite sur OK pour exécuter l’analyse. Affichez les résultats dans le panneau de gauche de la fenêtre et exportez la carte thermique en cliquant sur Enregistrer l’image dans le menu Fichier. Le gène le plus similaire à l’arabidopsis thaliana ATL2, selon une recherche BLAST-P, a été utilisé pour étudier les membres de la famille ATL dans le génome de la vigne.

L’analyse PSI BLAST a convergé après quelques cycles, fournissant une liste de gènes présumés dans la famille de gènes. La présence du domaine canonique de l’anneau H2 pour chaque candidat a été évaluée par l’inspection visuelle de l’alignement MUSCLE. Cela a permis de restreindre la recherche à 96 gènes de vigne

Une analyse phylogénétique des gènes identifiés les comparant à la famille de gènes ATL d’arabidopsis a été utilisée pour une nomenclature. 13 des 96 ATL de vigne ont reçu un identifiant spécifique en tant qu’orthologue du gène ATL d’arabidopsis. La cartographie des gènes identifiés dans l’atlas mondial d’expression génique de la vigne à l’aide d’une analyse hiérarchique bi-cluster a montré que les 96 sont exprimés dans au moins un tissu et que cinq groupes d’expression peuvent être identifiés.

Une approche similaire a été appliquée pour étudier l’expression de ces gènes en réponse à des stress biotiques. Il y avait une implication directe de la famille de gènes ATL en réponse à l’infection par un agent pathogène avec 62 gènes montrant une modulation significative dans au moins deux conditions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter les logiciels utilisés pour caractériser une famille de gènes.

Lors de cette procédure, il est important de définir soigneusement les caractéristiques d’une famille de gènes donnée et la sonde correspondante utilisée pour l’identification de l’ensemble des membres de la famille du génome. En suivant cette procédure, il est possible d’étudier l’évolution de la famille de gènes et la fonction de P30 en créant des arbres phylogénétiques supplémentaires basés sur certaines espèces autres que celles requises pour l’attribution de la nomenclature des familles de gènes.