Name: Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez l'isolation de mitochondries fonctionnelles chez Arabidopsis thaliana pour étudier la respiration et le métabolisme énergétique. Cette méthode permet d'obtenir des mitochondries pures à partir de petites quantités de tissu végétal.

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Cette étude a été financée par un australien recherche Conseil Centre d’Excellence en usine énergie biologie CE140100008, une australienne Conseil avenir bourse de recherche (FT130100112) pour MWM et une bourse de recherche Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondation, Allemagne) au JS.

Ce protocole est utilisé pour l’isolation des mitochondries intactes des organes d’Arabidopsis thaliana cultivées sur un sol à l’aide de gradients de densité colloïdal continue. Toutes les procédures après la collecte du matériel sont réalisés à 4 ° C.
1. préparation du tampon de Medium, lavage et Gradient Solutions de meulage
<ol><li>Préparer 300 mL de broyage moyen (moins ascorbate et cystéine) et 200 mL de tampon de lavage x 2 après le tableau 1 , un jour avant l’isolement, les garder au froid à 4 ° C. NOTE : Ajouter ascorbate de sodium et de la L-cystéine (base libre) à une concentration finale de 17,84 et 20,36 mM, respectivement, au milieu de broyage dans la matinée de l’isolement. Si les mitochondries sont utilisés pour la tache occidentale ou bleu natif-polyacrylamide gel analyses d’électrophorèse (BN-PAGE), composent 2 x tampon de lavage sans BSA.</li>
	<li>Préparer des gradients dans la matinée d’isolement mitochondriale (Figure 1 et tableau 1).<ol>
<li>Faire les solutions lourdes et légères de gradients dans deux béchers ; 35 mL de chacune est suffisant pour deux tubes de gradients.</li>
		<li>Laver les chambres du bec verseur dégradé et tuyau péristaltique en PVC avec de l’eau désionisée et assurer un flux même par l’intermédiaire de la tubulure de tous les tuyaux.</li>
		<li>Mettre 2 tubes à centrifuger (50 mL) avec un léger angle sur la glace avec les sorties du tube péristaltique PVC collée à l’intérieur des tubes pour que la solution dégradée s’exécute sur le côté des tubes.</li>
		<li>Fermer la connexion entre les chambres intérieures et extérieures (levier noir vers le bas). Placez verseur dégradé sur un agitateur magnétique avec une barre de petits remous dans la chambre intérieure.</li>
		<li>Versez la solution dégradé lourd de 35 mL dans la chambre intérieure (chambre avec sortie tube). Diluer la solution dégradée lourde dans les tubes à deux centrifuger mis dans la glace jusqu'à ce que la moitié est restant avec le taux de pompe péristaltique rapide (300 mL/h) la valeur.</li>
		<li>Verser la solution de dégradé léger 35 mL dans le vase externe (chambre sans prise de tubes). Ouvrir la connexion entre les chambres (levier-poussoir noir à mi-chemin vers le haut) et permettent des solutions à mélanger doucement. Mélanger les solutions à l’aide de l’agitateur magnétique.</li>
		<li>Permettre les solutions couler lentement (60 mL/h) jusqu'à ce que tous le mix dégradé a été prélevée des chambres entraînant deux 0 - 4,4 % (p/v) tubes remplis de gradient de la polyvinylpyrrolidone (PVP). Garder les gradients sur la glace jusqu’au moment de l’utiliser en étape 2.12. Remarque : Une fois que le dégradé a été établi, diluer 2 x lavage moyen à 1 x avec prérefroidies-désionisée et garder froid à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. l’homogénéisation et l’isolement mitochondriale
<ol><li>Couper le tissu de rosette entière de 4 - semaine vieux Arabidopsis plantes cultivées sur le sol avec des ciseaux, au moins 80 usines sera nécessaires pour 1 prép. NOTE : 10-14 jours vieille eau cultures, minimum de 5 pots/prep, ou 2 - semaine vieux plantules cultivées sur milieu gélosé milieu de Murashige et Skoog basale sel mélange (MS), minimum de 4 assiettes, peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Placer la moitié de la matière végétale qui a été coupée en petits morceaux dans un grand mortier préalablement refroidi à 4 ° C et le pilon avec 75 mL de broyage moyen (tableau 1) et moudre intensivement pendant plusieurs minutes jusqu'à ce qu’aucun des gros morceaux de tissu ne sont laissés.</li>
	<li>Pré mouillage 4 couches de matériau de filtration (22-25 µm taille de pore) avec support de meulage et filtrer l’homogénat à travers les 4 couches de matériau de filtration à travers un entonnoir en plastique dans une fiole conique de 500 mL.</li>
	<li>Broyer l’autre moitié du tissu avec un autre 75 mL de milieu de meulage.</li>
	<li>Combiner des homogénats dans les matériaux de filtration et filtre autant que possible homogénat à travers.</li>
	<li>Moudre le tissu restant restant sur le matériel de filtration à nouveau avec le restant 150 mL de mouture moyenne, filtre à nouveau dans la fiole conique de 500 mL.</li>
	<li>Centrifuger l’homogénat filtrée dans 8 tubes de centrifugeuse en plastique préalablement refroidie 50 mL à 2 500 g à 4 ° C dans un rotor à angle fixe pendant 5 min.</li>
	<li>Versez le liquide surnageant dans tubes à centrifuger propre (50 mL ; ne pas perturber la pastille verte) et centrifuger à 17 500 x g à 4 ° C pendant 20 min dans un rotor à angle fixe.</li>
	<li>Jeter tout sauf < 3 mL du surnageant par aspiration (ou décanter doucement sans déranger le culot). Doucement Resuspendre le culot dans le surnageant résiduel à l’aide d’un petit pinceau fin.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de 1 x tampon de lavage à chaque tube et combiner 4 tubes en tube 1 centrifugeuse propre (c'est-à-dire, donnant 2 tubes).</li>
	<li>Remplir ces tubes de 50 ml de tampon de lavage 1 x et répétez les étapes 2,7 à 2,9.</li>
	<li>Piscine bruts granulés mitochondriales dans 1 tube à l’aide d’un compte-gouttes et dispersent uniformément avec le pinceau fin (une petite quantité du tampon de lavage peut-être être utilisée mais le volume final doit être inférieur à 3 mL pour s’adapter sur le dessus de la pente). La couche doucement la suspension mitochondriale avec un compte-gouttes sur les gradients PVP 0 - continus 2 4,4 % (p/v).</li>
	<li>Équilibrer les tubes en poids (à l’aide de 1 x tampon de lavage) et centrifuger à 40 000 x g à 4 ° C pendant 40 min. Vérifiez que la pause est éteint. Mitochondries vont migrer vers une bande au bas du tube, ou peuvent être présents dans la solution lourde au fond du tube (identifié par une bande nuageuse, jaunâtre ; La figure 2).</li>
	<li>Retirez soigneusement les 5 cm supérieur de solution au-dessus de la bande mitochondriale par aspiration.</li>
	<li>Distribuer le reste de la solution contenant les mitochondries dans 2 tubes propres et remplir avec 1 x tampon de lavage. Répartir uniformément le gradient de densité colloïdales et des mitochondries en couvrant l’embouchure du tube avec un film de paraffine en plastique et en retournant plusieurs fois. Centrifuger 15 min à 31 000 x g à 4 ° C avec freinage lent. Remarque : Avant la centrifugation, assurez-vous que les mitochondries et le gradient de densité colloïdal restantes sont réparties uniformément. Dans le cas contraire, le gradient de densité colloïdal peut se concentrer au fond du tube et empêcher la granulation des mitochondries.</li>
	<li>Retirez le surnageant par aspiration, remplir le tube avec lavage 1 x jusqu'à 50 mL de tampon, puis retournez à nouveau pour assurer un mélange. Centrifuger 15 min à 31 000 x g à 4 ° C avec freinage lent.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et recueillir les pellets mitochondriales en aussi petit un volume (~ 500 µL) possible à l’aide d’une pipette avec mis à jour le 200 µL conseils (coupés la pointe un peu au-dessus de son extrémité pour augmenter son ouverture). Placer les mitochondries dans un tube de 1,5 mL et le maintenir sur la glace pour une utilisation immédiate ou conserver à-80 ° C. Remarque : Si vous servira des mitochondries pour sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE), BN-PAGE ou analyses immunoblot, 1 x tampon de lavage sans BSA utilisent pour les liquides de lavage finales (c.-à-d., étape 2.15 et 2.16).</li>
	<li>Déterminer la concentration de protéines des mitochondries à l’aide de la méthode de Bradford. Remarque : Pour les aliquotes de BN-PAGE centrifuger à 4 ° C et pellet magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Pour la mesure de la consommation d’oxygène, seuls les mitochondries fraîchement isolées peuvent être utilisés.</li>
</ol>3. les mesures de consommation d’oxygène
NOTE : La consommation d’oxygène par fraîchement isolées plante mitochondries peuvent être analysées avec une électrode à oxygène de type Clark, permettant la détermination de mitochondrial intact, l’activité cytochrome c voie et l’activité de la voie alternative.
<ol><li>Installation du logiciel<ol>
<li>Installer sous licence oxygène surveillance logiciel sur l’ordinateur utilisé pour la mesure de la consommation d’oxygène.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du milieu de respiration, substrats, solutions chimiques de stock et la sonde à oxygène de type Clark<ol>
<li>Préparer le support de la respiration (300 mM de sucrose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) utilisé pour des essais de consommation d’oxygène.</li>
		<li>Préparer des substrats, inhibiteurs et effecteurs utilisés pour mesurer la respiration mitochondriale (tableau 2). Ceux-ci peuvent être préparés plus tôt et conservés à-20 ° C. NOTE : Neutraliser le pH des solutions acides tels que les acides organiques à pH 7,0 avec NaOH avant utilisation.</li>
		<li>Chauffer le milieu de la respiration à la même température que la chambre de test (25 ° C).</li>
		<li>Assembler la sonde à oxygène de type Clark comme décrit dans le protocole du fabricant.</li>
		<li>Placer 1 mL d’eau saturée d’air (l’eau saturée d’air est obtenue en agitant vigoureusement une petite quantité d’eau déionisée dans une fiole conique de grande) dans la chambre de mesure. Pour basculer sur l’agitateur, cliquez sur le bouton de « Vitesse d’agitation ». Cliquez sur le bouton « On » et régler la vitesse de l’agitateur à 65 tr/min. Cliquez sur « OK » pour continuer. Remuer l’eau continuellement à 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Étalonnage de la sonde à oxygène<ol>
<li>Chauffer l’eau qui est utilisée pour l’étalonnage à la même température que la chambre de test (25 ° C).</li>
		<li>Attendez que le courant à stabiliser et à calibrer la sonde à oxygène.</li>
		<li>Pour démarrer l’étalonnage de la sonde à oxygène, cliquez sur le bouton de « Calibrer », sélectionnez « Calibrage de Phase liquide », puis « Air saturées eau. »</li>
		<li>Une nouvelle fenêtre s’ouvrira (oxygène Calibration (Phase liquide) - étape 1 de 5). Sélectionnez le canal à étalonner (le canal de) que la boîte de commande d’électrode est attachée) et entrez les variables (définies « Température de la chambre » à 25 ° C et la « Pression atmosphérique » à 101,32 kPa). Cliquez sur « OK « pour continuer.</li>
		<li>Dans la prochaine étape (étape 2 de 5), le programme d’installation de la vitesse d’agitation (65 tr/min) et cliquez sur « OK » pour continuer.</li>
		<li>À l’étape 3 de 5, attendez le signal atteindre un plateau. Le terme « Plateau atteint, appuyez sur OK pour continuer » s’affiche dans la boîte. Cliquez sur « OK » pour continuer.</li>
		<li>À l’étape 4 de 5, établir zéro d’oxygène dans la chambre en ajoutant le dithionite de sodium 5 mg. Cliquez sur « OK » pour continuer. Remarque : Une baisse de la concentration d’oxygène doit être visible dans la trace et devrait atteindre 0.</li>
		<li>Dans la dernière étape de calibrage (étape 5 de 5), attendez le signal atteindre un plateau. Le terme « Plateau atteint, appuyez sur OK pour continuer » s’affiche dans la boîte. Cliquez sur « OK » pour continuer.</li>
		<li>Cliquez sur « Calibrage de sauver » pour enregistrer l’étalonnage. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Cliquez sur « OK » pour confirmer pour enregistrer le nouveau calibrage de la boîte de contrôle de l’oxygène. Remarque : Après l’étalonnage réussi, l’étiquetage « oxygène (nmol/mL) » s’affiche sur l’axe y.</li>
		<li>Après calibration, nettoyer la chambre de mesure en rinçant la chambre avec de l’eau (au moins 5 - 10 fois) afin d’assurer un nettoyage correct. Placez 1 mL de milieu de respiration dans la mesure de chambre et laisser la membrane s’équilibrer pendant quelques minutes jusqu'à ce que la trace de la consommation d’oxygène est linéaire.</li>
		<li>Adapter la balance de la trace de la consommation d’oxygène pour obtenir une vue de la bonne pente. Cliquez sur « Zoom XY » et entrez les variables (valeur « Oxygen » 0 - 300 et le « axe du temps » de 0 à 45 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Détermination de l’intégrité mitochondriale<ol>
<li>Avec piston ouvert, ajouter 970 µL de milieu de respiration d’air saturé à la chambre de réaction.</li>
		<li>Ajouter 30 µL isolé mitochondries ou 150 µg de protéines mitochondriales déterminée après l’isolement des mitochondries (protéine totale doit être inclus dans les calculs par la suite) à la chambre de réaction à l’aide d’une pipette avec une pointe coupée.</li>
		<li>Agiter la suspension mitochondriale en continu avec un agitateur magnétique bar (65 tr/min) à 25 ° C à air-saturer la solution.</li>
		<li>Sceller la chambre avec le piston, cliquez sur « Start Recording » pour enregistrer la consommation d’oxygène et permettre la consommation d’oxygène stabiliser (1-2 min).</li>
		<li>Déterminer le taux de consommation d’oxygène manuellement après l’ajout d’ascorbate de 10 mM et 25 µM cytochrome c pendant 5 min obtenir le taux « avant détergent ». Remarque : Pour spécifier que l’addition de substrats, inhibiteurs et effecteurs directement dans la trace, cliquez sur le bouton « Ajouter événement marque » et saisissez la désignation étiquette correspondante. Cliquez sur « OK » pour continuer.</li>
		<li>Déterminer le taux de consommation d’oxygène manuellement pendant 3 min après l’ajout de détergent de 0,05 % (v/v) pour donner le rythme « après détergent ». Cliquez sur « Arrêter l’enregistrement ».</li>
		<li>Cliquez sur le bouton « Tarifs de la Table de modifications ». 2 curseurs apparaissent comme des lignes verticales sur l’écran graphique. Cliquer et glisser les deux curseurs de taux aux postes requis dans la trace pour définir l’intervalle de taux. Déplacer l’intervalle de vitesse le long de la trace à l’aide du curseur gauche taux. Définissez l’intervalle de taux lui-même en utilisant le curseur de droite taux. L’oxygène automatiquement le logiciel de surveillance dessine une ligne de régression entre les deux curseurs tout en déplaçant les curseurs d’intervalle de vitesse le long de la trace.</li>
		<li>Une fois que l’intervalle de taux souhaité et la position a été définie, entrer le taux dans la table avec un clic droit sur 1 des 2 curseurs et sélectionnez « Ajouter le taux à Table. » Cliquez sur le bouton « Ajouter » pour confirmer pour afficher la vitesse sur le tableau principal taux.</li>
		<li>Calculer l’intégrité mitochondriale en divisant le taux « avant détergent » par le taux « après détergent », exprimé en pourcentage et il en soustraire 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Détermination de la respiration mitochondriale<ol>
<li>Avec piston ouvert, ajouter 970 µL de milieu de respiration d’air saturé à la chambre de réaction. Ajouter 500 µM ATP et 30 mitochondries µL isolé ou 150 µg de protéines mitochondriales en utilisant une pipette avec une pointe coupée au milieu de la respiration dans la chambre de réaction.</li>
		<li>Agiter la suspension mitochondriale en continu à l’aide d’un agitateur magnétique bar (65 tr/min) à 25 ° C.</li>
		<li>Piston à proximité, cliquez sur « Start Recording » pour enregistrer la consommation d’oxygène et attendre 1-2 min pour le taux de consommation d’oxygène stabiliser (lorsque la trace de la consommation d’oxygène est linéaire). Ajouter succinate de 5 mM. Enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant environ 2 min. Remarque : Pour spécifier que l’addition de substrats, inhibiteurs et effecteurs directement dans la trace, cliquez sur le bouton « Ajouter événement marque » et saisissez la désignation étiquette correspondante. Cliquez sur « OK » pour continuer.</li>
		<li>Ajouter 1 mM l’adénosine diphosphate (ADP). Continuer à enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant 2 min.</li>
		<li>Ajouter 1 mM NADH. Enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant 4 à 8 min. Ce taux est la capacité de respiration par l’intermédiaire de la cytochrome oxydase.</li>
		<li>Ajouter 1 mM le cyanure de potassium (KCN) (ou 2,5 µM myxothiazol ou 5 µM antimycine A) pour inhiber la voie du cytochrome c et continuer d’enregistrer pendant environ 2 min observer la consommation d’oxygène par l’intermédiaire de l’oxydase alternative.</li>
		<li>Ajouter 5 mM le dithiothréitol (DTT) et pyruvate de 10 mM pour activer complètement l’oxydase alternative. Continuer à enregistrer pour les 5-7 min : il s’agit de la capacité de l’oxydase alternative.</li>
		<li>Ajouter 500 µM n-propyl gallate (nPG) et d’enregistrer pendant 2 min. Cela évalue le taux de consommation d’oxygène résiduel qui ne peut être inhibée chimiquement. Soustrayez ce taux depuis les autres taux enregistrés, car il n’est pas susceptible d’être mitochondriale à l’origine. La consommation d’oxygène produisent encore après l’inhibition du cytochrome c et voie AOX (par KCN et nPG) est très probablement provenir des peroxydases présents comme contaminants dans les mitochondries isolées9.</li>
		<li>Cliquez sur « Arrêter l’enregistrement ».</li>
		<li>Cliquez sur le bouton « Tarifs de la Table de modifications » et entrer le taux dans la table avec un clic droit sur l’un des deux curseurs, puis sélectionnez « Ajouter des taux à Table ». Cliquez sur le bouton « Ajouter » pour confirmer pour afficher la vitesse sur le tableau principal taux. Remarque : Lorsque ajoutant effecteurs dissous dans des solvants organiques (p. ex.., l’antimycine A, nPG, myxothiazol), la chambre et le piston doivent être rincés avec de l’éthanol et puis de l’eau pour assurer un nettoyage correct.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Day, D. A. <a target="_blank" href="https://santai.ichotels.com.tr/lib/download/asin=1493926381">Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology.</a> Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).</li>
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<li>Eubel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-flow+electrophoresis+for+purification+of+plant+mitochondria+by+surface+charge%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge.</a> Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

En règle générale, isolation des mitochondries de l’Arabidopsis laisse rendements jusqu'à 3 mg de mitochondries d’environ 80-100 3 - 4 - semaine vieilles centrales, bien que les rendements de plus de 5 mg est possible souvent avec ponçage minutieux. Le rendement varie en fonction des conditions de croissance et diminue considérablement comme feuilles sénescentes, bien que la structure de la mitochondrie semble être bien entretenu au cours de la sénescence,9. Une des caractéristiques plus important...

L’histoire de recherche mitochondriale plante remonte à plus de 100 ans1. Les mitochondries intactes ont été isolées pour la première dans les années 1950 en utilisant la centrifugation différentielle. Mitochondries à être purifié sans souffrir l’ajustement osmotique a permis l’avènement d’un gradient de densité colloïdales dans les années 1980. Tandis que les mitochondries purifiées dégradés ne conviennent pas pour la plupart des cas, en raison de la sensibilité de la spectrométrie de masse, contaminants même relativement mineures peuvent être détectés et peuvent être affectées indûment un emplacement mitochondrial2. L’utilisation de libre circulation électrophorèse peut enlever les deux plastidique et peroxysomes contamination3, mais libre écoulement électrophorèse est une technique hautement spécialisée et n’est pas requis pour la grande majorité des études. En outre, quand déterminer l’emplacement d’une protéine, qu'il faut rappeler que double ou multiple ciblant des protéines se produit dans les cellules. Plus de 100 doubles protéines ciblées sont décrits pour les chloroplastes/plastes et mitochondries4et un certain nombre de protéines ciblées aux mitochondries et peroxysomes sont également connus5. En outre, la re-localisation de protéines sous des stimuli spécifiques, par exemple le stress oxydatif, est un thème émergent dans la biologie cellulaire6. Ainsi, l’emplacement des protéines doit être examinée dans le contexte de la biologie a étudié, et une variété d’approches sont utilisées pour déterminer et vérifier l’emplacement2.
Les mitochondries sont généralement isolés des tissus végétaux par homogénéisation, il faut un équilibre entre rupture ouverte la paroi pour libérer les mitochondries et ne pas endommager les mitochondries. Traditionnellement, avec pommes de terre et chou-fleur, homogénéisation implique l’utilisation d’appareils ménagers blender/centrifugeuse pour faire un extrait liquide dans un tampon avec différents composants pour maintenir l’activité. Isolation des mitochondries de feuilles de pois, (un matériel populaire pour isolement mitochondriale à l’aide de jeunes plants (~ 10 jours), utilise un mélangeur pour lyser les cellules car le matériel de feuille est doux. Avec la disponibilité d’insertional knock out de Arabidopsis thaliana ADN-T, la nécessité d’être en mesure de purifier les mitochondries à réaliser des études fonctionnelles a nécessité l’élaboration de méthodes pour isoler les mitochondries des feuilles, racines ou fleurs tissus. Dans l’ensemble les méthodes mises au point pour les autres plantes a travaillé bien contre7, avec l’accessoire qui broyer du matériel nécessaire pour être optimisé. Pour Arabidopsis, cela peut être réalisé de diverses façons (voir ci-dessous) et diffère entre les types de tissus (racine contre shoot). L’utilisation du gradient continu peut également être optimisée comme la densité des mitochondries des différents organes ou stades moyens ils peuvent migrer différemment. Ainsi, pour séparation maximale, la densité du gradient peut être raffinée pour faire en sorte de réaliser la meilleure séparation.
Une fois purifié la mitochondrie peut être utilisée pour une variété d’études, y compris les expériences d’absorption de protéines et ARNt, tests d’activité enzymatique, chaîne respiratoire et buvardage de western. Mitochondries isolées peuvent également servir pour les analyses de la spectrométrie de masse de l’abondance de la protéine. Ciblé plusieurs réaction suivi des analyses (MRM) permet pour la quantification des définie des protéines, mais nécessitent le développement significatif de dosage. En revanche, quantification de diméthyle ou autres isotopes étiquettes8, fournit une approche de découverte dans l’identification des différences à travers le protéome entier qui peut être utilisé pour découvrir de nouveaux points de vue biologiques.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Produit chimique, dissous dans</td></tr><tr>l’éthanol<td>Anticorps AOX</td><td>de Tom Elthon</td><td></td><td>Elthon et al., 1989</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Ascorbate Oxydase de Cucurbita sp.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSAS 1.0</td><td>Clarté chimique</td></tr><tr><td>substrat ECL occidental</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Criterion Gels préfabriqués sans coloration 8-16 % 18 puits</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678104</td><td>Cyanure chimique</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>chimique</td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3131</td><td>Gélose</td></tr><tr><td>Difco chimique, granulée</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Chimique EDTA Sel disodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Gamborg B-5 Milieu basal</td><td>Austratec</td><td>G398-100L</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Gamborg Vitamin Solution (1000x)</td><td>Austratec</td><td>G219-100ML</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris IgG (H + L)-HRP Conjugué</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706516-2ml</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin IgG (H + L)-HRP Conjugué</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706515-2ml</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chimique Sulfate</td> <td>de magnésiumSigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Austratec</td><td>M524-100L</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5580</td><td>Chimique, dissous dans l’éthanol</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Ndufs4</td><td>anticorps de Etienne Meyer</td><td></td><td>Meyer et al., 2009</td></tr><tr><td>n-Propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td>Chimique, dissous dans l’éthanol</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>Produit chimique, gradient de densité colloïdale</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone (PVP40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Chimique Cyanure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td>Produit chimique</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td> chimique <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Chlorure</td></tr> de <tr><td>sodium</td> chimique <td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>Dithionite de sodium</td><td>chimique Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td></td></tr><tr><td>Chimique L-ascorbate de sodium</td><td>Sigma</td><td>A4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>Succinate</td> chimique <td>Sigma-Aldrich S2378</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chimique Saccharose</td><td>Chem-Supply</td><td>SA030</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375</td><td>Pyrophosphate</td></tr><tr><td>tétrasodique chimique (Na4P2O7 &middot ; 10H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704271</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Chimique, détergent</td></tr><tr><td>Western Blocking Réactif</td><td>Sigma</td><td>11921681001</td><td>Balance chimique</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Béchers</td><td>Isolab</td><td>50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26XP</td><td></td></tr><tr><td>Équipement Tubes à centrifuger</td><td>Nalgene</td><td>3117-9500</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Circulateur</td><td>Julabo</td><td>1124971</td><td>Attaché à chambre d’électrode d’oxygène</td></tr><tr><td>Fiole conique</td><td>Isolab</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Compte-gouttes</td><td></td><td>3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td></td></tr><tr><td>Équipement Entonnoir</td><td>Per Alimenti</td><td>14 cm</td><td>Pour la filtration</td></tr><tr><td>Verseur à gradient</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4120</td><td>Pour la préparation des gradients</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique ATE</td><td>VELP Scientifica</td><td>F20300165</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>Matériau de filtration</td></tr><tr><td>Mortier et pilon</td><td>Jamie Oliver</td><td>Granite, 6 Inch Equipment</td><td></td></tr><tr><td>O2view</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td>Logiciel de surveillance de l’oxygène</td></tr><tr><td>Système Oxygraph Plus</td><td>Hansatech Instruments</td><td>1187253</td><td>électrode d’oxygène de type Clark</td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>Artiste premier choix</td><td>1008R-12</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>film de paraffine plastique</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>Pour la préparation des dégradés</td></tr><tr><td>Tube péristaltique</td><td>en PVC Gilson</td><td>F117930</td><td>Pour la préparation des dégradés Bain d’eau</td></tr><tr><td></td><td>VELP Scientifica</td><td>OCB</td><td>Équipement</td></tr></tbody></table>

isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Les mitochondries sont des organites essentiels impliqués dans nombreuses voies métaboliques chez les plantes, notamment la production de l’adénosine triphosphate (ATP) de l’oxydation des composés réduits tels que la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et la flavine adénine dinucléotide (FADH2). L’annotation complète du génome d’Arabidopsis thaliana a mis en place il comme plante modèle système le plus utilisé, et donc la nécessité de purifier les mitochondries des divers organes (feuilles, racines ou fleurs) est nécessaire pour utiliser pleinement les outils qui sont maintenant disponibles pour Arabidopsis étudier la biologie mitochondriale. Les mitochondries sont isolées par homogénéisation du tissu en utilisant une variété d’approches, suivie d’une série d’étapes de centrifugation différentielle produisant un granulé mitochondrial brut qui est ensuite purifiée à l’aide de gradient de densité colloïdal continue centrifugation. La matière colloïdale de densité est ensuite supprimée par plusieurs étapes de centrifugation. A partir de 100 g de tissus de la feuille fraîche, 2 à 3 mg de mitochondries peuvent être régulièrement obtenu. Respiratoires expériences sur ces mitochondries affichent les taux typiques de 100-250 nmol O2 min-1 mg de protéines mitochondriales total-1 (taux de NADH-dépendante) avec la possibilité d’utiliser divers substrats et inhibiteurs de déterminer quels substrats sont être oxydés et la capacité de l’alternative et cytochrome oxydases terminales. Ce protocole décrit une méthode d’isolement des mitochondries des feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant des gradients de densité colloïdal continue et une mesure efficace respiratoire des mitochondries végétales purifiée.

Utilisant ce protocole, nous avons été en mesure de détecter différentes protéines mitochondriales par SDS-PAGE et immunoblotting. Comme le montre la Figure 3 a, la protéine isolée du tissu de la culture de l’eau est suffisante pour détecter une faible bande (2 µg). Intensité du signal augmente proportionnellement aux montants chargés. Pour les mitochondries isolées des tissus cultivés sur des plaques (Figure 3 b), la réponse au ...

Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

L’objectif global de l’isolement des mitochondries végétales intactes et pures est d’étudier la respiration, la composition mitochondriale, la biogenèse et le métabolisme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie de l’énergie végétale, telles que l’importance des mitochondries et de la tolérance au stress, dans des conditions environnementales changeantes. Le principal avantage de cette technique est que des quantités suffisantes de mitochondries pures, intactes et fonctionnelles ont pu être isolées à partir de quantités relativement faibles de tissu végétal.Wenhui Liu et Jennifer Selinski, de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Le jour de l’isolement mitochondrial, laver le verseur à gradient et le tube péristaltique en PVC avec de l’eau désionisée pour préparer les gradients. Inclinez pour placer deux tubes à centrifuger de 50 mL sur de la glace, de sorte que la sortie du tube péristaltique touche la paroi des tubes.Tournez ensuite le levier noir vers le bas pour fermer la connexion entre les chambres intérieure et extérieure. Placez le verseur à gradient avec la barre d’agitation magnétique à l’intérieur de la chambre intérieure sur un agitateur magnétique. Ensuite, versez 35 ml de solution à gradient épais dans la chambre intérieure.Distribuer la moitié de la solution à gradient lourd à travers la pompe péristaltique, à raison de 300 mL par heure, dans deux tubes à centrifuger, maintenus sur de la glace. Versez ensuite 35 ml de solution à gradient de lumière dans la chambre extérieure. Immédiatement, tournez le levier noir à mi-course pour reprendre la connexion entre les chambres intérieure et extérieure, pour que les solutions se mélangent doucement.Expulsez tout le mélange de gradient des chambres, à raison de 60 mL par heure, pour former deux gradients continus de 0 % à 4,4 % PVP. Gardez toujours les pentes sur la glace avant utilisation. Il est important de ne pas surterrer le tissu végétal, sinon les mitochondries se décomposeront.Pour une seule préparation, coupez tout le tissu de la rosette d’au moins 80 plantes d’Arabidopsis âgées de quatre semaines, cultivées sur du sol. Ajoutez ensuite la moitié des tissus végétaux coupés dans un grand mortier et un pilon refroidis, contenant 75 ml de milieu de broyage. Utilisez ensuite un média de broyage pour humidifier quatre couches de matériau filtrant, avec une taille de pores de 20 à 25 m.À l’aide d’un entonnoir en plastique, filtrez l’homogénéité à travers les quatre couches de matériau filtrant et recueillez-la dans une fiole conique de 500 ml. Utilisez 75 ml supplémentaires de produit de broyage pour broyer l’autre moitié du tissu. Combinez ensuite l’ensemble de l’homogénat dans le matériau filtrant, afin de filtrer autant que possible.Utilisez 150 ml de produit de broyage pour broyer tout le tissu restant sur le matériau filtrant et filtrez dans une fiole conique de 500 ml. Répartissez l’homogénat filtré dans huit tubes à centrifuger en plastique pré-refroidis de 50 ml. Et centrifuger à 2 500 g à quatre degrés Celsius, dans un rotor à angle fixe, pendant cinq minutes.Après avoir versé le surnageant dans des tubes à centrifuger propres, centrifuger à nouveau à 17 500 g, à quatre degrés Celsius, pendant 20 minutes, dans un rotor à angle fixe. Laisser 3 mL de surnageant dans le tube. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, remettez doucement la pastille en suspension dans le surnageant restant.Ajoutez 10 ml de tampon de lavage à concentration unique dans chacun des tubes et regroupez les quatre tubes dans un seul tube à centrifuger, ce qui donne un total de deux tubes. Ajustez le volume à 50 ml avec un tampon de lavage à concentration unique et répétez les étapes de centrifugation. À l’aide d’une très petite quantité de tampon de lavage, dispersez la pastille avec le pinceau fin, puis utilisez un compte-gouttes pour regrouper la pastille mitochondriale brute dans un tube.Ensuite, superposez soigneusement la suspension mitochondriale à l’aide d’un compte-gouttes, sur deux gradients continus de 0 % à 4 % de PVP. Utilisez un tampon de lavage à concentration unique pour équilibrer le poids des tubes et effectuez un cycle de centrifugation à 40 000 g à quatre degrés Celsius, pendant 40 minutes. N’oubliez pas de fermer le frein.Aspirez prudemment les cinq centimètres supérieurs de solution au-dessus de la bande mitochondriale. Ensuite, répartissez la solution mitochondriale dans deux tubes propres et remplissez-les d’un tampon de lavage à concentration unique. Couvrez l’embouchure du tube avec un film de paraffine plastique et retournez-le plusieurs fois pour répartir uniformément le gradient de densité colloïdale et les mitochondries.Ensuite, centrifuger à 31 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, avec frein lent. Aspirez le surnageant et ajustez le volume du tube jusqu’à 50 ml avec un tampon de lavage à force unique. Retournez plusieurs fois pour bien mélanger.Centrifuger la solution à 31 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avec frein lent. Aspirez le surnageant, puis prélevez la pastille mitochondriale dans 500 l de tampon de lavage à concentration unique, à l’aide d’une pipette avec une pointe modifiée de 200 l. Avec le piston ouvert, ajoutez 970 l de fluide respiratoire saturé d’air dans la chambre de réaction.Ajoutez ensuite 150 g de protéine mitochondriale totale, à l’aide d’une pipette modifiée, et 500 M d’adénosine triphosphate dans la chambre de réaction, pour déterminer la respiration mitochondriale. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour remuer continuellement la suspension mitochondriale. Après avoir fermé le piston, cliquez sur Démarrer l’enregistrement pour enregistrer la consommation d’oxygène.Attendez une minute ou deux, pour vérifier si la consommation d’oxygène est linéaire, indiquant une consommation d’oxygène stable. Ensuite, ajoutez 5 mM de succinate et notez la consommation d’oxygène pendant environ deux minutes. Ajoutez 1 mM d’adénosine diphosphate et continuez à enregistrer le taux de consommation d’oxygène pendant encore deux minutes.Ensuite, ajoutez 1 mM de nicotinamide adénine dinucléotide d’hydrogène et continuez à enregistrer la consommation d’oxygène pendant environ quatre à huit minutes. Ajoutez ensuite des réactifs pour inhiber la voie du cytochrome C et continuez à enregistrer la consommation d’oxygène via une oxydase alternative, pendant environ deux minutes. Le KCN, le myxothiazol et l’antimycine A sont tous des poisons respiratoires.Il est important de suivre les consignes de sécurité dans les fiches techniques de la fiche signalétique. Veuillez noter que différents pays auront des législations différentes pour l’utilisation de ces inhibiteurs dans nos expériences. Ensuite, ajoutez 5 mM de dithiothréitol et 10 mM de pyruvate pour activer l’oxydase alternative.Et continuez à enregistrer pendant encore cinq à sept minutes. Enfin, ajoutez 500 mM de gallate de N-propyle et enregistrez pendant deux minutes. Un gradient représentatif, montrant la présence d’une fraction mitochondriale blanc verdâtre près du fond de la solution de gradient.Les thylakoïdes et autres contaminants présents au-dessus de la solution de gradient sont indiqués en bandes vert foncé. Traces représentatives de la consommation d’oxygène par les mitochondries, pour montrer l’intégrité de la membrane externe avant la mesure de la consommation d’oxygène. L’intégrité de la membrane externe était bien préservée et intacte à environ 90 %.Traces représentatives de la consommation d’oxygène par les mitochondries, après ajout de substrats, d’inhibiteurs et d’effecteurs. Les résultats montrent un cytochrome c compromis et une voie alternative de l’oxydase. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’analyser les mitochondries des plantes.

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Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries...

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.

Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

La comparaison du potentiel de membrane mitochondriale entre les échantillons fournit des informations précieuses sur l’état cellulaire. Les étapes détaillées de l’isolement des mitochondries et de l’évaluation de la réponse aux inhibiteurs et aux découpleurs à l’aide de la fluorescence sont décrites. La méthode et l’utilité de ce protocole sont illustrées par l’utilisation d’une culture cellulaire et d’un modèle animal de stress cellulaire.

Isolement et analyse fonctionnelle des mitochondries de cellules cultivées et de tissus de souris

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Ici, nous présentons une modification d’une méthode précédemment rapportée qui permet d’isoler des mitochondries purifiées de haute qualité à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris. Cette procédure aboutit à des mitochondries fortement couplées qui respirent avec une fonction élevée lors des tests respiratoires sur microplaques.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Ici, un échantillon de muscle quadriceps est prélevé sur un porc anesthésié et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Ensuite, les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV sont déterminées à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

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Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

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Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

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