Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

L’objectif global de ce protocole est de caractériser les processus de développement cérébral précoce des cellules précurseurs neurales humaines de manière rapide et reproductible, et de définir les effets de facteurs extracellulaires importants dans la régulation de ces processus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions importantes dans les domaines de la neuropsychiatrie et des troubles neurodéveloppementaux, telles que : toutes les personnes touchées ont-elles la même anomalie cellulaire ou, au contraire, chacune d’entre elles présente-t-elle un dysfonctionnement spécifique à une personne ? Le principal avantage de notre protocole est qu’il est rapide, hautement reproductible et facile à mettre en œuvre.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu des troubles neurodéveloppementaux, elle peut également être utilisée pour étudier les troubles neurodégénératifs et neuropsychiatriques tels que la maladie d’Alzheimer et la dépression. Une démonstration visuelle de certaines de ces méthodes est nécessaire, car certaines techniques impliquent de déplacer des cellules d’une parabole à une autre ou nécessitent des analyses morphologiques qui sont mieux communiquées par une démonstration visuelle. Pour soulever les cellules précurseurs neurales humaines, aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate 1X.

Aspirez la solution saline tamponnée au phosphate et ajoutez 500 microlitres de solution de détachement cellulaire 1X dans un puits contenant les cellules précurseurs neurales. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate maintenue à température ambiante pour laver et retirer les cellules.

Ensuite, transférez les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez à nouveau le puits avec un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate et transférez le lavage dans le tube. Ensuite, faites tourner les cellules à 300 G pendant cinq minutes pour former la pastille.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un à cinq millilitres de milieu DMEM F12 préchauffé. Plaquez 100 000 cellules dans des puits triples dans une plaque de 24 puits. Après 46 heures, ajoutez de la thymidine tritiée au milieu de culture et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, après avoir retiré le milieu, ajoutez 300 microlitres de trypsine EDTA préchauffée à 0,25 % et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour briser les cellules et libérer l’ADN. Ensuite, allumez le collecteur de cellules et allumez la pompe. Placez un papier filtre dans le récupérateur de cellules.

Continuez à collecter les tubes du collecteur de cellules dans un plateau vierge vide. Ensuite, appuyez sur prélavage pour mouiller le papier filtre. Placez les tubes collecteurs dans les puits d’échantillonnage et commencez.

Utilisez une source de lumière chaude pour sécher le papier filtre et disposez les flacons correspondants sur le plateau. Percez des chads de papier dans les flacons, puis ajoutez deux millilitres de cocktail à scintillation liquide dans chaque flacon. Incuber les flacons pendant une heure dans le compteur à scintillation avant d’utiliser la machine pour obtenir le nombre par minute de chaque échantillon qui reflète la synthèse active de l’ADN.

Ensemencez 500 000 cellules dans une boîte de culture de 35 millimètres. Ensuite, agitez le plat dans toutes les directions pour répartir uniformément les cellules. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 46 heures.

Ensuite, ajoutez deux microlitres par millilitre de cinq millimolaires d’EdU à la culture et incubez pendant deux heures. Ensuite, dissociez et granulez les cellules. À la pastille cellulaire, ajoutez trois millilitres de milieu d’expansion à 30 % avec ou sans facteurs de croissance ou médicaments.

Plaquez un millilitre de suspension cellulaire sur les plats pré-enrobés et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Pour étudier le nombre de cellules précurseurs neurales en culture, après deux jours, étiquetez et préparez des tubes de microcentrifugation. Ensuite, aspirez le milieu du puits et ajoutez 200 microlitres de solution de détachement de cellules 1X et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après le détachement cellulaire, ajoutez 300 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X dans chaque puits. À l’aide d’une pipette P1000, pipeter plusieurs fois la solution cellulaire et détacher les cellules de la plaque. Ensuite, transférez la solution cellulaire dans le tube de 1,5 millilitre préparé et retournez le tube deux à trois fois.

À l’aide d’une pipette, prélever 50 microlitres de cellules à mi-chemin dans le tube et les ajouter à la solution de bleu de trypan dans un tube de 0,5 millilitre. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour former la neurosphère, pipetez un millilitre de milieu à 100 % d’expansion dans une boîte de 35 millimètres sans aucun substrat de revêtement.

Ensuite, ajoutez un million de cellules précurseurs neurales dans chacune de ces plaques et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 à 96 heures. Pour préparer la plaque à la migration de la neurosphère, dissoudre les aliquotes de gel mimiques ECM dans six millilitres de milieu d’expansion à 30 %. Ajoutez un millilitre de gel mimétique ECM avec 30 % de milieu d’expansion dans un seul puits d’une plaque à six puits.

Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour plaquer les neurosphères, utilisez une pipette pour collecter les cellules dans le milieu à partir de la boîte de 35 millimètres et les transférer dans un tube conique. Ensuite, faites tourner le tube à 100 G pour granuler les neurosphères.

Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un à trois millilitres de milieu d’expansion préchauffé à 30 %. Ensuite, pipetez 200 microlitres des neurosphères remises en suspension dans la plaque à six puits contenant le gel mimétique ECM avec un milieu d’expansion à 30 % et secouez la plaque. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Aspirez le gel mimique ECM avec 30 % de milieu d’expansion, puis fixez les cellules pendant 30 minutes avec 4 % de paraformaldéhyde. Pour analyser les neurosphères, capturez des images à l’aide des paramètres de contraste de phase à un grossissement de 10X. Utilisez le logiciel NIH ImageJ pour mesurer la migration moyenne des neurosphères.

Sur ImageJ, utilisez l’outil de ligne à main levée pour tracer le contour externe de la neurosphère. Ensuite, utilisez la fonction de mesure pour calculer l’aire de trace et tracez la masse cellulaire interne de la sphère. Soustrayez la masse cellulaire interne de la surface totale de la neurosphère pour quantifier la migration moyenne.

La coloration immunocytochimique a été réalisée pour étudier l’expression des protéines du cytosquelette et des facteurs de transcription tels que SOX2, PAX6 et la nestine dans les cellules précurseurs neurales au passage trois. Ensuite, des images en contraste de phase ont été capturées pour identifier les cellules porteuses de neurites. D’après l’image, les cellules dont les processus sont égaux ou plus longs que deux corps cellulaires sont considérées comme porteuses de neurites, tandis que les cellules dont les processus sont plus courts que deux corps cellulaires ne sont pas considérées comme porteuses de neurites.

Pour confirmer la formation des neurosphères, des images en contraste de phase ont été capturées qui montrent que les neurosphères collectées au point de 72 heures ont une taille comprise entre 80 micromètres et 120 micromètres, et peuvent donc être utilisées pour le test de migration. Pour définir la capacité proliférative, des cellules précurseurs neurales ont été cultivées dans des conditions de contrôle ou de facteur de croissance des fibroblastes et colorées pour la présence d’EdU. Les images fluorescentes à contraste de phase montrent que les cellules traitées avec le facteur de croissance des fibroblastes ont une proportion plus élevée de cellules engagées dans la phase S, comme le montre la coloration EdU.

Ensuite, pour vérifier la croissance des neurites, les cellules ont été testées dans des conditions de contrôle et comparées à PACAP. Des images en contraste de phase ont été capturées et montrent une augmentation du nombre de cellules avec des neurites sous traitement PACAP. Ensuite, pour comprendre la migration de la neurosphère, les cellules ont été traitées avec des neuropeptides PACAP.

Les images en contraste de phase obtenues montrent une migration accrue de la neurosphère par rapport au contrôle. Notre protocole contient de nombreuses techniques et essais, chacun nécessitant des durées différentes. Une fois maîtrisé, la mise en place d’un test moyen peut prendre de deux à trois heures et de 30 minutes à trois heures d’analyse.

Lors de l’exécution de ces procédures, il est essentiel de s’assurer que vous utilisez des cellules précurseurs neurales de haute qualité, et que ces cellules sont complètement dissociées et uniformément distribuées dans toutes les conditions, à l’exception du test de la neurosphère. Suite à ces procédures, d’autres analyses peuvent être effectuées notamment le Western blot, la QRT-PCR, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique afin de caractériser les mécanismes sous-jacents. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.