Application de mesure de l’électrophysiologie pour étudier l’activité des transporteurs de l’Electro-neutre

La méthode des patchs géants combinée à des microélectrodes sélectives d’ions est une méthode polyvalente utilisée pour détecter et quantifier les flux d’ions. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer les flux de protons générés par l’activité du transporteur d’ions électro-neutres, l’échangeur sodium-hydrogène ou NHE, qui est exprimé sur la membrane cellulaire. L’échangeur sodium-hydrogène génère un gradient de protons à proximité immédiate de la membrane plasmique, indiqué ici par un anneau orange.

Ce gradient de protons à travers la membrane cellulaire est mesuré par l’enregistrement par patch clamp de cellule entière combiné à une technique qui utilise une microélectrode sélective de protons. La microélectrode sélective de protons est déplacée près de la surface de la cellule, où elle enregistre le flux de protons sortant des cellules, indiqué ici en position A.Et loin de la surface de la cellule, où elle enregistre la concentration de protons libres présents dans la solution indiquée par la position B.Et puis, de retour à la position A, près de la membrane cellulaire, dans un mouvement répétitif et oscillatoire. La différence de tension de A à B est enregistrée et dépend du représentant de l’activité NHE.

Les ions transporteurs tels que les protons à travers la membrane cellulaire affectent le processus essentiel à la vie. Par conséquent, les changements de pH sont étroitement régulés par un ensemble de molécules, y compris l’échangeur sodium-protons, un système d’exclusion des protons à membrane plasmique. La microélectrode à pH oscillant combinée au serrage par patch de cellule entière est une nouvelle approche pour étudier le flux de protons médié par l’activité de l’échangeur sodium-protons.

L’application de ces méthodes permet de surmonter certaines des principales limites des techniques généralement utilisées pour mesurer l’activité de l’échangeur sodium-protons, telles qu’une sensibilité modérée, une résolution temporelle et un autre bon contrôle de l’environnement intracellulaire. Je ferai une démonstration des méthodes avec mon collaborateur, le Dr Victor Babich. Le Dr Matthew Henry sera le narrateur.

Nous allons démontrer une application de cette méthode en mesurant l’activité de l’échangeur sodium-protons isoforme trois qui est un régulateur majeur de l’absorption du sel dans l’eau à travers l’intestin et l’épithilium rénal. Les microélectrodes sélectives de protons pour la mesure de la concentration de protons sont fabriquées à partir de tubes en verre borosilicaté standard. Les électrodes en verre borosilicaté d’un diamètre extérieur de 1,2 millimètre et sans filament sont tirées à l’aide d’un extracteur vertical, en utilisant un protocole conventionnel à double traction.

On obtient une pointe de pipette de deux à trois micromètres de diamètre. Les pipettes sont placées dans un porte-bocal avec la pointe de la pipette vers le haut. Ensuite, un mélange est préparé pour siliconer les pipettes.

Il est versé dans un bocal et le couvercle est bien fermé. Les pipettes sont incubées avec le mélange de siliconation pendant 24 à 48 heures. Soyez prudent, assurez-vous de préparer le mélange et de siliconer les pipettes à température ambiante dans une hotte chimique bien ventilée.

Remplissez la pipette avec la résine sélective d’ions appropriée et placez-la soigneusement verticalement dans un porte-bocal avec la pointe de la pipette vers le bas. Pour vous préparer au serrage par patch, commencez par tirer les pipettes de serrage par patch en verre borosilicate à paroi mince d’un diamètre extérieur de deux millimètres et d’un diamètre intérieur de 1,4 millimètre dans un extracteur vertical en utilisant le protocole conventionnel à double traction. À l’aide d’une microforge montée sur une platine d’un microscope inversé, on peut réaliser une pointe de pipette large.

Positionnez la pipette à proximité de l’épais fil de platine de la microforge. Allumez le chauffage à l’aide d’une pédale qui contrôle l’activation et la désactivation du courant. Chauffez le verre à bas point de fusion qui recouvre le milieu de l’épais fil de platine de la microforge, puis déplacez la pointe de la pipette près du verre souple fondu.

Le chauffage déplace légèrement le fil de platine vers le centre. Le fil de platine revient à sa position initiale et la pointe de la pipette se casse. Répétez la procédure jusqu’à ce que le diamètre de pointe souhaité soit obtenu et enfin, appliquez de la chaleur pour lisser la pointe.

Les pointes de pipette ont un diamètre de 10 micromètres après polissage avec la microforge. L’utilisation du fil de platine épais est un avantage dans la mesure où il y a peu d’expansion après la mise sous tension de l’électricité et moins de possibilité de surchauffe du fil et de la pipette avec un courant excessif. Une fois que les cellules sont dissociées à l’aide de la trypsine et que la trypsinisation est bloquée, les cellules sont maintenues sur un agitateur à bascule pour empêcher la formation de grumeaux.

Cela se fait jusqu’à deux heures après la trypsinisation. Le dispositif d’électrophysiologie se compose d’un régulateur de température pour réguler la température de la solution dans le système de perfusion. Toutes les expériences sont réalisées à environ 37 degrés Celsius.

Et un commutateur de filtre optique pour contrôler la roue à filtres pour l’imagerie de fluorescence. Un contrôleur de soupape de système de perfusion pour réguler l’ouverture et la fermeture des soupapes du système de perfusion. Et le régulateur de température pour réguler la température de la chambre d’enregistrement.

Un oscilloscope pour observer les formes d’onde et un amplificateur patch clamp. Un ordinateur exécutant ce logiciel Capmeter. Et un électromètre pour enregistrer le signal de microélectrode sélective d’ions.

Et un amplificateur différentiel pour amplifier le signal de l’électromètre. Le dispositif d’électrophysiologie est également équipé d’un microscope inversé avec contrôleur de platine, de deux micro-manipulateurs avec contrôleurs positionnés sur les sites gauche et droit du microscope, du système de perfusion avec réchauffeur de solution en ligne. Une fois la pipette à microélectrodes sélective d’ions montée sur le micromanipulateur, remplissez la pipette de serrage du patch avec la solution intracellulaire.

Assurez-vous que la solution atteint l’extrémité de la pipette. Il peut être nécessaire de tapoter doucement plusieurs fois pour éliminer les bulles dans la pointe de la pipette. Montez ensuite la pipette de serrage patch sur l’étage de tête de l’installation d’électrophysiologie.

Transférez doucement les cellules d’apparence saine dans la chambre d’enregistrement remplie d’un volume défini de solution de bain. Il est important de maintenir l’étage de tête à un angle de 45 degrés par rapport à l’axe horizontal. Cela garantit un angle d’entrée pour la pipette adapté à la formation d’un joint très résistant.

Pendant que la pipette à pince patch est abaissée dans la solution du bain, appliquez une petite quantité de pression positive sur la pipette pour réduire le risque de blocage de la pointe. Sélectionnez une cellule et approchez-la avec une petite quantité de pression positive. Arrêtez de déplacer la pipette patch clamp une fois que la pointe est proche de la cellule.

Abaissez la microélectrode sélective d’ions dans la solution de bain jusqu’à ce qu’elle ait le même plan focal que la pointe de la pipette patch clamp. Lorsque la pipette est positionnée au centre de la cellule, amorcez le scellement en appliquant une petite quantité de pression négative. Une étanchéité méga-ohm est obtenue en quelques secondes.

Assurez-vous que le potentiel de maintien est maintenu par l’amplificateur à zéro millivolts. Enfin, rompez la membrane cellulaire avec une série de courtes impulsions d’aspiration et démarrez l’enregistrement. En utilisant la méthode d’enregistrement par patch géant, il est possible de perfusionner rapidement des solutions dans la pipette en verre via un système de perfusion intrapipette pour modifier le contenu intracellulaire des ions, des lipides et des protéines.

Positionnez la pipette à microélectrodes sélectives d’ions près de la cellule maintenue par la pipette patch clamp et démarrez l’oscillation de la pipette à microélectrodes sélectives d’ions en la déplaçant vers et depuis la cellule. L’application de cette technique permet d’étudier la régulation moléculaire de l’échangeur sodium-hydrogène. Tirant parti de la méthode des patchs géants, la composition intracellulaire de l’ATP et des lipides a été modifiée par un système de perfusion intrapipette.

La perfusion intracellulaire de l’apyrase, qui hydrolyse l’ATP intracellulaire et diminue la teneur en phosphoinositide, a provoqué une diminution de 50 % de l’activité de l’isoforme trois du NHE. L’effet de l’apyrase sur l’activité de NHE3 n’a pas été inversé par la perfusion intracellulaire du phosphoinositide, PIP2. Cependant, elle a été inversée par la perfusion intracellulaire du phophoinositide, PIP3.

La mesure de l’activité NHE tire parti de la combinaison des méthodes de microélectrode sélective de protons et de patch clamping. Cela permet d’étudier la base moléculaire de la régulation différentielle de la NHE par les phosphoinositides et les cascades de signaux en aval. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’activité de l’échangeur sodium-protons à l’aide d’une microélectrode de pH oscillante combinée à un serrage de patch de toutes les cellules.

Et un exemple d’application possible des méthodes.