Name: Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des progéniteurs neuronaux du cervelet pour analyser les modifications épigénétiques H3K79me2 par immunoprécipitation de la chromatine. Cette méthode permet d'étudier le développement cérébral.

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Nous remercions Henriette Bertemes pour aider à l’établissement du protocole de culture CGN au sein du laboratoire. Ce livre de la méthode était soutenu par l’épigénétique financés par le DFG CRC992 médicale en finançant à la télévision. Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’équipe de galaxie de Freiburg : Pavankumar Videm, Björn Grüning et Prof. Rolf Backofen, bioinformatique, Université de Freiburg, en Allemagne, financé par Collaborative Research Centre 992 médical épigénétique (subvention DFG SFB/992/1 2012) et ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF subvention 031 A538A RBC (de. NBI)).

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes

Il y a deux façons principales pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine pour détecter l’occupation génomique des modifications d’histone, facteurs de transcription, lecteurs de code histone, écrivains ou gommes à effacer. On est la méthode native de la puce à l’aide de nucléase digérée, chromatine native pour l’immunoprécipitation, et l’autre est la méthode présentée à l’aide de la chromatine PFA-fixes et cisaillée, dans lequel les nucléosomes et autres protéines ADN-attaché covalente à l’ADN <sup class="xre...

Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »1. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes4ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale5. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,6). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes2.
Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris9. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux10. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires10. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés11. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination12. Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes10.
Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN13. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison16, dommages à l’ADN réponse17et l’empreinte génomique18. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés19 et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones20. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue14, 19,,21. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte22. La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine23. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation27. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de28,E10.529. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement30. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development31, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement32et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse33. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris32. Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues23. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td></td><td>Abcam ab8245</td><td>Category : Antibody Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Category : Antibody Abbreviation/Commentaire : Immunoblot dilution 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Catégorie :Anticorps Abbreviation/Commentaire : Anticorps ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Catégorie :Anticorps Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-rabbit-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>Catégorie : Anticorps Abbreviation/Commentaire : ChIP Ctrl Anticorps</td></tr><tr><td>Anti-tubuline alpha</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Catégorie : Anticorps Abbreviation/Commentaire : Dilution immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrine (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour le supplément CCM</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Category : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : Pour CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : Pour l’analyse de la chromatine cisaillée</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : Ultrasoniseur</td></tr><tr><td>Acide borique pH 8.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour la culture CPC</td></tr><tr><td>CFX Connect RT Système de détection</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Category : ChIP Analysis Abbreviation/Commentaire : Système de détection pour qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : Pour CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : Perles magnétiques, pour ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Catégorie : Inhibition de DOT1L Abréviation/Commentaire : Pour l’inhibition de DOT1L en culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Catégorie : ChIP Abbreviation/Commentaire : EDTA</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal 10 % (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CPC et</td></tr> du <tr><td>CGM Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Category : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CGNP</td></tr><tr><td>Glutathion (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Catégorie : ChIP Abbréviation/Commentaire : Pour la fixation cellulaire</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category : ChIP Analysis Abbreviation/Commentaire : DNA polymerase master mix pour qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Category : Cell culture Abbreviation/Commentaire : HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Category : Cell culture Abbreviation/Commentaire : Pour CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abréviation/Commentaire : Pour la culture CPC</td></tr><tr><td>Chlorure de lithium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Catégorie : ChIP Abbréviation/Commentaire : LiCl</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Catégorie : ChIP Abréviation/Commentaire : Fluorospectromètre pour quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit pour Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Category : ChIP Analysis Abbreviation/Commentaire : Kit pour la préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category : ChIP Analysis Abbreviation/Commentaire : Oligos pour la préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Catégorie : ChIP Abbreviation/Commentaire : Pour tampon ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : PFA, pour la fixation cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Neomycine 1 % (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Category : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : PSN, pour CCM et CGM</td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné</td><td></td><td>Life Technologies 10010023</td><td>Category : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : PBS, pour l’isolation CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Category : ChIP Analysis Abbreviation/Commentaire : Visualisation du colorant pour la quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement du CGNP</td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-ornithine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour la culture CPC</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : KCl, pour CGM</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Catégorie : ChIP Abbreviation/Commentaire : Pour ChIP</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Catégorie : ChIP Abbreviation/Commentaire : For ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : Kit pour la purification de l’ADN</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Catégorie : ChIP Abréviation/Commentaire : Pour ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Catégorie : Inhibition de DOT1L Abbréviation/Commentaire : Pour l’inhibition de DOT1L en culture cellulaire</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Catégorie : ChIP Abréviation/Commentaire : pour tampon d’élution</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : NaCl, pour tampon ChIP</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : For ChIP</td></tr><tr><td>Sodium dodécylsulfate</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Catégorie : ChIP Abbreviation/Commentaire : SDS, pour ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Category : Culture cellulaire Abbréviation/Commentaire : Pour l’isolement CGNP</td></tr><tr><td>Superoxyde dismutase (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Catégorie : Culture cellulaire Abréviation/Commentaire : Pour CCM</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Catégorie : ChIP Abréviation/Commentaire : TRIS, pour tampon ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Category : ChIP Abbreviation/Commentaire : Pour le tampon ChIP</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 % (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Category : Culture cellulaire Abbreviation/Commentaire : Pour l’isolement CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Catégorie : ChIP Abbréviation/Commentaire : Pour la préparation des billes</td></tr><tr><td>Autres appareils de laboratoire : Chambre de comptage Neubauer, Incubateur, Rotateur, Agitateur, Set de disection, Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM : Milieu</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire cortical</tr><tr><td>CGM : Milieu</td><td></td><td></td><td></td> de culture cellulaire CGNP</tr></tbody></table>

isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’histone 3 lysine 79 mbd

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Le développement du cerveau est un processus complexe, qui est contrôlé de manière temporo-spatiale par des gradients de morphogènes et différents programmes transcriptionnelles. En outre, des modifications épigénétiques chromatine, comme la méthylation des histones, ont un rôle important pour établir et maintenir des destins de cellule spécifique au sein de ce processus. La grande majorité de la méthylation des histones se produit sur la queue de l’histone flexible, qui est accessible aux modificateurs d’histone, gommes à effacer et histones lecteur. En revanche, la méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3 et est impliquée dans les différentes fonctions du développement. Méthylation de l’H3K79 est conservée évolutives et se trouvent dans un large éventail d’espèces de l’Homo sapiens à Saccharomyces cerevisiae. La modification se produit dans différentes populations cellulaires au sein d’organismes, y compris les progéniteurs neuraux. L’emplacement de la méthylation de H3K79 dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est difficile à évaluer. Ici, nous présentons des méthodes pour isoler et progénitrices corticale de la culture des cellules (CPC) de tissus embryonnaires cerveau cortical (E11.5-E14.5) ou les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux (CGNPs) de tissus de postnatal (P5-P7) et efficacement immunoprécipitation H3K79me2 pour la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de génome.

Régime général d’isolement progénitrices neurales, culture, méthodes d’analyse H3K79me2 puce et puce : La figure 1 montre un diagramme pour effectuer H3K79me2 puce de cellules progénitrices corticales à différents moments au cours du développement du cerveau embryonnaire ou de cellules souches de neurones granulaires cérébelleux en étapes postnatals. Dans un premier temps, le cerveau doit être isolé et le télencéphale (entre E11.5 et E14.5) o...

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

L’objectif général de cette procédure est d’analyser les modifications épigénétiques au cours du développement du cerveau, en particulier dans le cortex cérébral et le cervelet. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la façon dont les modifications des histones comme la méthylation de H3K79 peuvent affecter le développement de la stratification corticale et cérébelleuse. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier in vivo les modifications d’histones, spécifiques au locus ou à l’ensemble du génome, dans des régions cérébrales distinctes à des moments de développement spécifiques.Commençons par des cerveaux de P5 à P7 et des souris IRM. Retirez toutes les méninges et les vaisseaux sanguins. Transférez ensuite trois à cinq cervelous par puce dans des tubes de 15 millilitres.Laver le cervelet avec du glucose HBSS avant la centrifugation. Centrifugez les tubes pour recueillir le tissu. Après le lavage final, homogénéisez le cervelet en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois avec une pipette d’un millilitre jusqu’à ce que les fragments aient une taille de 0,5 à un millimètre cube.Retirez délicatement tout le liquide jusqu’à ce qu’il reste 2,5 millilitres. Ajoutez ensuite 0,05 % de trypsine dans le tube avec du glucose HBSS contenant le cervelet. Et incubez le tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Retournez le tissu toutes les une à trois minutes. Après l’incubation, arrêtez la digestion en ajoutant cinq millilitres de milieu de culture cellulaire CGNP, ou CGM, et récupérez le tissu par centrifugation comme précédemment. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre de CGM.Triturez le tissu avec une pointe de pipette d’un millilitre, en évitant la formation de bulles d’air. Ajoutez ensuite cinq millilitres de CGM et incubez le mélange pendant deux minutes sur de la glace pour déposer les restes de tissus. Une fois que le tissu s’est stabilisé, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres.Ajoutez ensuite deux millilitres de CGM au tissu résiduel et répétez la procédure de trituration avant de récolter le surnageant et de jeter les restes de tissu. Regroupez les surnageants de chaque tube de tissu de 15 millilitres et centrifugez pour recueillir les cellules cérébelleuses. Remettre le granulé en suspension dans 10 millilitres de CGM.Étant donné que les astrocytes adhèrent plus rapidement et plus fort à la poly-D-lysine que les CGNP, ajoutez jusqu’à quatre millilitres de suspension cellulaire dans les puits de plaques à 6 puits recouvertes de poly-D-lysine et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour éliminer les astrocytes. Agitez la plaque, recueillez le surnageant dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugez-le comme précédemment. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de CGM et comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer.Après quatre à six heures, les CGNP adhérents apparaissent ronds et proliférants. Ensemencez les cellules dans CGM sur des plaques recouvertes de poly-L-ornithine et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité relative. Après une journée in vitro, ou DIV1, la plupart des CGNP sont ronds et prolifèrent.Certains CGNP commenceront à se différencier et commenceront à développer des protubérances neuronales. Pour fixer les cellules cultivées, ajoutez jusqu’à un millilitre de PFA à 1 % directement dans les puits contenant des CGNP. Après une incubation de cinq minutes à 22 degrés Celsius, ajoutez 53 microlitres de glycine et lavez deux fois avec trois millilitres de PBS glacé.Utilisez un grattoir cellulaire pour récolter les cellules dans un millilitre de PBS. Transférez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre et centrifugez pendant cinq minutes à 1 000 g et quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 700 microlitres de tampon de lyse contenant un inhibiteur de protéase et incubez les échantillons pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Vortex les échantillons toutes les cinq minutes pendant ce temps. Après l’incubation, divisez les tubes d’échantillon pour vous assurer que le volume ne dépasse pas 400 microlitres par tube. Ensuite, sonicate pendant 10 minutes à puissance maximale pour cisailler la chromatine des cellules de lyse.Après 10 minutes, vortex les échantillons, puis répétez la sonication et le vortex deux fois de plus. Vérifiez la présence de noyaux restants dans le lysat à l’aide d’un microscope à contraste de phase ou d’un microscope fluorescent à l’aide de DAPI. Granulez les restes cellulaires en les centrifugeant pendant 10 minutes à 13 000 g et quatre degrés Celsius.Lorsque vous avez terminé, utilisez le surnageant pour l’étape de pré-nettoyage. Pour pré-effacer les échantillons, lavez d’abord 20 microlitres de billes magnétiques non conjuguées par échantillon dans du PBS Tween glacé. Retirez les lavages à l’aide d’un support magnétique.Ajoutez ensuite 600 microlitres de tampon de dilution et 20 microlitres de billes magnétiques lavées à chaque échantillon pour la pré-clarification et incubez pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur un rotateur. Après l’incubation, retirez les billes à l’aide d’un support magnétique. Ensuite, prélevez 5 % de chaque lysat comme échantillons d’entrée et congelez-les à moins 20 degrés Celsius.Le couplage d’anticorps peut être effectué pendant que les échantillons sont pré-approuvés. Lavez 45 microlitres de billes magnétiques de protéine A par puce avec du PBS Tween glacé, comme précédemment. Après le lavage final, ajoutez un millilitre de PBS glacé aux billes.Ajoutez ensuite trois microgrammes d’anticorps par aliquote de 45 microlitres de billes. Incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius sur un rotateur pour lier les anticorps aux billes. Une fois le temps d’incubation écoulé, remettre en suspension les billes couplées aux anticorps lavées dans un volume de billes de PBS glacé.Divisez chaque extrait pré-autorisé en deux tubes d’environ 643,5 microlitres. Ajoutez le même volume de tampon de dilution et de billes liées aux anticorps et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur. Le lendemain, lavez les billes avec des tampons à copeaux glacés de un à trois pendant 10 minutes chacun sur un rotateur à quatre degrés Celsius, puis effectuez trois lavages de cinq minutes avec un tampon TE.Ajouter le tampon d’élution et diluer pendant une heure à 1 400 tr/min dans un agitateur à température ambiante. Une fois l’heure écoulée, ajoutez 10 microgrammes de Rnase à chaque échantillon de puce et cinq microgrammes aux échantillons d’entrée. Incuber les échantillons sur l’agitateur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Enfin, ajoutez 100 microgrammes de protéinase K par échantillon de puce et 50 microgrammes par entrée. Incuber toute la nuit à 65 degrés Celsius à 1 400 tr/min. Les niveaux de diméthylation de H3K79 sont diminués après trois jours de culture de CPC et l’inhibition de DOT1L par SGC 0946.L’analyse de la puce a révélé que les gènes présentant des niveaux élevés de méthylation de l’histone-3-lysine-79 au départ étaient les plus sensibles au traitement par inhibiteur. Les gènes ayant une couverture de diméthylation H3K79 plus faible n’ont montré aucun changement significatif dans les niveaux de méthylation. Cette carte thermique montre que les niveaux de méthylation de l’histone-3-lysine-79 atteignent un pic autour du site de début de transcription et diminuent vers le site de fin de transcription.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine environ, si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine sur les modifications des histones dans des cellules cérébrales isolées.

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