Name: Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Découvrez la neuromodulation chimique de rétines de rat entières in vitro en utilisant le glutamate comme neurotransmetteur. Cette méthode biomimétique offre une alternative prometteuse à la stimulation électrique pour traiter les cécités liées à la dégénérescence des photorécepteurs.

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Le travail présenté dans le document a été pris en charge par la National Science Foundation, nouvelles frontières dans la recherche et le programme d’Innovation (NSF-EFRI) accorde nombre 0938072. Le contenu de ce document n’engagent que la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la NSF. Les auteurs souhaitent également remercier Dr Samsoon Inayat pour son travail, concevoir et tester l’installation expérimentale initiale pour la stimulation chimique et M. Ashwin Raghunathan pour son travail de conception, fabrication et évaluer le dispositif microfluidique multiport utilisé dans Cette étude.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode présentée ici montre un paradigme unique stimulation neurale, dans laquelle les neurones de la rétine sont stimulés chimiquement par injection de produits chimiques native neurotransmetteur dans le sous-sol de la rétine in vitro. Cette technique de stimulation chimique offre plusieurs avantages sur la technique de stimulation électrique conventionnelle, dont la sélectivité et une grande spécificité focale des neurones de la cible. Le protocole au-dessus de détails comment petits volume pneumatique des...

Photorécepteurs des affections dégénératives, comme la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, sont en tête des causes héréditaires de perte de vision et sont actuellement incurables1,2. Bien que ces maladies proviennent d’une variété de mutations génétiques spécifiques, maladies dégénératives photorécepteurs sont caractérisés en tant que groupe par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine, qui finit par provoquer la cécité. La perte des déclencheurs de photorécepteurs généralisées transformant tout au long de la rétine, mais survivre les neurones de la rétine, y compris les cellules bipolaires et CGR, restent intactes et relativement fonctionnel même à un stade avancé de photorécepteur dégénérescence3 ,4,5,6,7.
Les mécanismes et les pathologies de ces maladies ont été bien caractérisé3,4,5,6,7 , mais un traitement efficace demeure insaisissable. Durant les trois dernières décennies, les chercheurs dans le monde entier ont étudié une variété de traitements thérapeutiques pour restaurer la vision de personnes atteintes de maladies dégénératives photoréceptrices dont gene therapy8, cellules souches traitement9, rétinienne transplantation10et stimulation artificielle11,12 des neurones rétiniens survivants. Parmi ceux-ci, le plus cliniquement disponibles sont des prothèses rétiniennes, qui sont des dispositifs de neurostimulation artificiels qui ont traditionnellement utilisé un tableau des électrodes pour stimuler électriquement les CGR ou cellules bipolaires en modèles spécifiques dans le but de création artificielles perceptions visuelles dans les patients11. Prothèses électriques de génération actuelle, comme l’Argus II13 et les Alpha-IMS14 périphériques, ont obtenu l’approbation clinique et des études préliminaires ont indiqué qu’ils peuvent améliorer la qualité de vie des patients en rétablissant une mesure de la vision à l’aide de deux épirétinienne (avant de la rétine) et subretinal (l’arrière de la rétine) implantés dispositifs15,16. Groupes de recherche du monde entier travaillent sur l’avancement des prothèses rétiniennes au-delà du succès de ces dispositifs de première génération17,18,19,20 , mais ont été confrontés à difficultés de conception d’une prothèse électrique capable de restaurer la vision acuité élevée au-dessous du niveau de cécité légale aux patients. Des études récentes ont montré que parvenir à une résolution spatiale supérieure à celle activée par la génération actuelle électrique basé sur prothèses est difficile en raison de la limite d’injection de charge, qui nécessite l’utilisation de grandes électrodes pour stimuler en toute sécurité neurones de la rétine au détriment de la résolution spatiale, c'est-à-dire l’acuité visuelle de11,21. En outre, la stimulation électrique est en outre limitée parce qu’elle stimule généralement toutes les cellules voisines et par conséquent suscite des perceptions peu naturelle et source de confusion chez les patients, en grande partie parce que c’est un paradigme de stimulation par nature contre nature21. Néanmoins, les premiers succès de la stimulation électrique ont démontré que cette neurostimulation artificielle peut être un traitement efficace pour les maladies dégénératives de photorécepteurs. Cela nous amène à émettre l’hypothèse qu’un traitement encore plus efficace pourrait être réalisable en stimulant la rétine avec des neurotransmetteurs produits chimiques, les agents naturels de communication aux synapses chimiques. La méthode présentée dans cet article vise à explorer la faisabilité thérapeutique de la stimulation chimique, qui cherche à imiter le système naturel de communication synaptique entre les neurones de la rétine, comme une stimulation alternative électrique biomimétique pour une prothèse de rétine.
Traduction de la notion de stimulation chimique thérapeutique d’une prothèse de rétine chimique dépend chimiquement activation des neurones rétiniens cible avec de petites quantités de neurotransmetteurs indigènes, comme le glutamate, libéré par un microfluidique dispositif comprenant un large éventail de microports en réponse à des stimuli visuels. De cette façon, une prothèse de rétine chimique serait essentiellement une couche de photorécepteur artificielle biomimétique qui se traduit par des photons naturellement pour atteindre la rétine aux signaux chimiques. Étant donné que ces signaux chimiques utilise les mêmes neurotransmetteurs utilisés dans la signalisation rétinienne normale et stimuler les neurones de la rétine survivants d’un dégénéré de la rétine à travers les mêmes voies synaptiques utilisée par les voies de la vision normale, le visuel qui en résulte perception grâce à une prothèse de rétine chimique pourrait être plus naturelle et compréhensible par rapport à un évoquée à travers une prothèse électrique. En outre, depuis le microports à travers lequel les neurotransmetteurs sont libérés peuvent être fait extrêmement petites et rangées à haute densité, à la différence des électrodes, un potentiel chimique prothétique peut être capable d’atteindre plus de stimulation focal et plus spatiale résolution à une prothèse électrique. Ainsi, une prothèse de rétine chimique basé sur ces avantages potentiels, offre une alternative très prometteuse à prothèses électriques.
La stimulation chimique de la rétine, cependant, a été relativement peu explorée jusqu'à une date récente. Alors que la stimulation électrique de la rétine a été bien caractérisée au cours de décennies de travail par le biais de in vitro22,23, in vivo23,24et des études cliniques13 ,14, études sur la stimulation chimique ont été limités exclusivement à quelques in vitro travaux25,26,27,28. Iezzi et Finlayson26 et Inayat et al. 27 a démontré épirétinienne stimulation chimique de la rétine in vitro en utilisant une seule électrode et un tableau multiélectrodes (MEA), respectivement, d’enregistrer les réponses de glutamate évoquée par des neurones de la rétine. Plus récemment, Rountree et al. 28 a démontré la stimulation différentielle des voies marche rétiniennes à l’aide de glutamate du côté sous-rétinienne et un AME pour enregistrer les réponses neuronales de plusieurs sites sur la rétine.Bien que ces travaux ont établi préalablement la faisabilité de la stimulation chimique, plus amples études sont essentielles pour enquêter sur plusieurs aspects de cette approche au-delà de celles adressées jusqu'à25,26,27 , 28et d’affiner les paramètres de stimulation thérapeutique dans des modèles animaux in vitro et in vivo avant de traduire ce concept à une prothèse de rétine chimique tel que discuté ci-dessus. Cependant, actuellement, il n’y a aucune méthodologie établie pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine dans la littérature et les méthodes utilisées dans les travaux antérieurs n’ont pas été décrits en détail comme ce serait essentiel pour études réplicatifs. La raison d’être de cet article des méthodes est donc de fournir un cadre bien défini pour la conduite in vitro la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs intéressés dans la reproduction de nos précédentes études27, soit 28 , ou encore faire progresser ce concept naissant de la neurostimulation chimique.
Nous démontrons une méthode pour la réalisation in vitro la stimulation chimique des neurones de la rétine dans la wholemount de rétine de rat sauvage et un modèle de rat dégénérées de photorécepteurs qui imite étroitement la progression du photorécepteur dégénérative maladies chez les humains. La raison d’être de développer cette méthode de stimulation dans des modèles in vitro consiste à évaluer les gammes thérapeutiques divers paramètres de stimulation et d’étudier les caractéristiques de la réponse neuronale qui seraient impossibles ou difficiles à observer dans dans vivo modèles, surtout pendant les premières études axées sur l’évaluation de la faisabilité de cette approche. Nous montrons dans cette procédure, site unique et simultanées sur plusieurs sites des stimulations chimiques des rétines en livrant des petites quantités de glutamate 1 mM près de neurones rétiniens cible via micropipettes verre disponible dans le commerce de port unique et personnalisée dispositif de micro-usines de microfluidique multi-ports, respectivement. Alors que les stimulations fois site unique et multi-sites accomplir l’objectif fondamental d’étudier la faisabilité thérapeutique de neuromodulation chimique, chacun répond à un objectif distinct avec un avantage unique. La stimulation d’un site unique, qui peut être accomplie avec micropipettes verre tiré préalablement disponibles dans le commerce, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques directement dans le sous-sol de la rétine sur un seul site et sert à vérifier si RGC observable spike taux les réponses qui ressemblent à des réponses légers visuellement évoquées peuvent être déclenchés focalement sous le site de l’injection. En revanche, la stimulation multisite, qui exige un dispositif microfluidique multiport spécialement fabriquées, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques dans l’espace à de nombreux endroits sur la surface de la rétine et sert à étudier comment bien évoquée par le glutamate RCG profils de réponse correspondent aux modèles injection glutamate dans les études de stimulation modèle.

<table><tbody><tr><td>Réseau de microélectrodes, disposition perforée</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>60pMEA200/30iR-Ti-pr</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti</td></tr><tr><td>Amplificateur MEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv</td></tr><tr><td>Plaque de sol à perfusion inférieure pour pMEA</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MEA1060-Inv-(BC)-PGP</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp</td></tr><tr><td>Micromanipulateur motorisé 3 axes</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MP-285</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html</td></tr><tr><td>Système de contrôle de micromanipulateur</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MPC-200</td><td>https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html</td></tr><tr><td>Style Portique support de micromanipulateur avec glissière linéaire</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>MT-75/LS</td><td>https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html</td></tr><tr><td>Injecteur de pression multicanal programmable à 8 canaux</td><td>OEM : MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fournisseur : Harvard Apparatus UK</td><td>PM-8000 ou PM-8</td><td>OEM : http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fournisseur : https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail</td></tr><tr><td>Axopatch 200A Amplificateur de patch de serrage intégré</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200A</td><td>Axopatch 200A a été remplacé par un modèle plus récent Axopatch 200B : https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier</td></tr><tr><td>Patch clamp headstage</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV 201A</td><td>http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage</td></tr><tr><td>Kit de déchets sous vide</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VMK</td><td>http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/</td></tr> <tr><td>Porte-pipette</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>QSW-A10P</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915</td></tr><tr><td>Pré-tiré 10 &mu ; Micropipettes en verre de diamètre m</td> World <td>Precision Instruments, Sarasota, Floride</td><td>TIP10TW1</td><td>Stéréomicroscope https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/</td></tr> <tr><td>Zoom</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td>SMZ-745T</td><td></td></tr><tr><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 Support de perche de microscope avec double bille linéaire bras de roulement</td><td>Old School Industries, Inc., Dacono, CO</td><td>OS1010H-16BB</td><td>http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm</td></tr><tr><td>Microscope stéréo zoom avec C-LEDS Support LED hybride</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td>SMZ-445</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445</td></tr><tr><td>Système de microscope inversé</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420</td></tr><tr><td>Acide L-glutamique (glutamate)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S8761</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761</td></tr><tr><td>boîte de Pétri de 60 mm (10 mm de hauteur)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>FB0875713A</td><td>boîte de Pétri transparente de 60 mm ; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a</td></tr><tr><td>Jewelers #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>555227F</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/</td></tr> <tr><td>Lame de scalpel standard #24</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500247</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/</td></tr> <tr><td>Manche de scalpel #4</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>500237</td><td>https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/</td></tr> <tr><td>Vannas Tübingen Dissection Scissors</td><td>World Precision Instruments, Sarasota, FL</td><td>503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/</td><td></td></tr> <tr><td>Nylon mesh kit</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>NYL/MESH</td><td>https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173</td></tr><tr><td>Grille à tranches de harpe</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>HSG-5AD</td><td>http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/</td></tr> <tr><td>Ag/AgCl à électrodes de référence Pellet</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>P1060</td><td>http://www.multichannelsystems.com/products/p1060</td></tr><tr><td>Système de perfusion par gravité contrôlé par soupape à 4 canaux</td><td>ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>VC3-4xG</td><td>http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/</td></tr> <tr><td>Zyla 5.5 sCMOS caméra microscope</td><td>Andor Technology, Belfast, Royaume-Uni</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td>http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos</td></tr><tr><td>fil d’argent (50 &mu ; m de diamètre)</td><td>Fischer Scientific, Waltham, MA</td><td>AA44461G5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5</td></tr><tr><td>Tube de microalésage Tygon (1,6 mm de diamètre)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-06419-01</td><td></td><td>Porte-outil</td></tr><tr><td>inclinable https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 avec canule</td> <td>en acierALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY</td><td>TILTPORT</td><td>L’un d’entre eux a été utilisé pour la perfusion supérieure et l’aspiration ; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/</td></tr> <tr><td>Roscolux #26 Light Red Filter Sheet</td><td>Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT</td><td>R2611</td><td>Fabricant : http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Fournisseur : https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html</td></tr><tr><td>Smith & Lampe de poche Wesson Galaxy Red</td><td>Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA</td><td>4588</td><td>Fabricant : https://www.smith-wesson.com/ Fournisseur : http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588</td></tr><tr><td>MC_Rack Software</td><td>Multi Channel Systems, GmbH</td><td>MC_Rack</td><td>http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack</td></tr><tr><td>Labview Software</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>LabVIEW</td><td>http://www.ni.com/labview/</td></tr> <tr><td>NIS-Elements : Logiciel de recherche de base</td><td>Nikon, Tokyo, Japon</td><td>NIS-Elements BR</td><td>https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research</td></tr></tbody></table>

méthodologie pour la chimie biomimétique neuromodulation des rétines de rat avec le neurotransmetteur glutamate in vitro

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Maladies dégénératives photorécepteur causent la cécité irréparable par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine. Prothèses rétiniennes sont un traitement émergent pour les maladies dégénératives de photorécepteurs qui visent à restaurer la vision en stimulant artificiellement les neurones rétiniens survivants dans l’espoir de susciter une perception visuelle compréhensible chez les patients. Prothèses rétiniennes actuels ont fait preuve de succès dans le rétablissement de la vision limitée aux patients utilisant un tableau d’électrodes pour électriquement stimule la rétine mais font face à des obstacles physiques considérables pour restaurer l’acuité élevée, une vision naturelle aux patients. Neurostimulation chimique à l’aide de neurotransmetteurs natives est une stimulation alternative électrique biomimétique et pourrait contourner les limitations fondamentales associées à des prothèses rétiniennes à l’aide de neurostimulation électrique. Plus précisément, neurostimulation chimique a le potentiel de restaurer une vision plus naturelle avec acuités comparables ou supérieure aux patients par l’injection de très faibles quantités de neurotransmetteurs, les mêmes agents naturels de communication utilisés par la rétine produit chimique synapses, à une résolution beaucoup plus fine que les prothèses électriques actuels. Cependant, comme un paradigme de stimulation relativement inexploré, il n’y a aucun protocole pour parvenir à la stimulation chimique de la rétine en vitro. Le but de ce travail est de fournir un cadre détaillé pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs qui souhaitent étudier le potentiel de neuromodulation chimique de la rétine ou similaire des tissus neuraux in vitro. Dans ce travail, nous décrivons le montage expérimental et la méthodologie pour ganglionnaires rétiniennes cellulaire (RGC) spike réponses similaire à visual réactions légères en sauvage et wholemount photorécepteur-dégénéré rétine de rat en injectant contrôlée des volumes de le neurotransmetteur glutamate dans l’espace sous-rétinienne utilisant des micropipettes de verre et un dispositif microfluidique multiport personnalisé. Cette méthodologie et le protocole sont assez générales pour être adapté à la neuromodulation à l’aide d’autres neurotransmetteurs ou même d’autres tissus nerveux.

Ce protocole peut être utilisé pour stimuler chimiquement les rétines normales, sauvage ainsi que photorécepteur dégénéré rétines, malgré le remodelage cellulaire importante causée par la perte des photorécepteurs. Avant commencer expérimente chaque photorécepteur dégénéré ou sauvage rétines, le besoin de matériel (Figure 1 et Figure 2) enregistrement et stimulation à être peaufiné et le pMEA (Figure 5</stron...

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour étudier une forme de neurostimulation chimique de wholemount rat rétines in vitro avec le neurotransmetteur glutamate. Neurostimulation chimique est une alternative prometteuse à la neurostimulation électrique conventionnelle des neurones de la rétine pour traiter la cécité irréversible causée par des maladies dégénératives de photorécepteurs.

Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

L’objectif global de cette méthodologie est de permettre une nouvelle neuromodulation chimique des neurones rétiniens à l’aide de neurotransmetteurs, qui pourraient potentiellement remplacer la fonctionnalité des cellules rétiniennes défectueuses chez les patients atteints de cécité neurodégénérative pour restaurer la vision. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la vision artificielle. Par exemple, le glutamate, un neurotransmetteur rétinien primaire, peut-il être utilisé pour stimuler thérapeutiquement une rétine dégénérée par un photorécepteur ?Le principal avantage de notre technique est qu’elle est biomimétique, stimuler la rétine de cette façon offre le potentiel d’une acuité visuelle plus élevée et d’une vision plus naturaliste que ce qui est possible avec la stimulation électrique. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la cécité, due aux maladies dégénératives des photorécepteurs, car une intervention thérapeutique précoce d’une rétine dégénérée pourrait restaurer la sensibilité au glutamate dans les neurones rétiniens. Pour commencer cette procédure, placez les deux yeux énucléés dans une boîte de Pétri de 60 millimètres de diamètre avec une solution fraîche oxygénée de milieu d’Ames.À l’aide d’un stéréomicroscope de dissection, faites une petite incision dans la face cornéenne à l’aide d’un scalpel ou d’une paire de ciseaux tranchants. Ensuite, faites une incision à partir de cette petite incision jusqu’au bord de la cornée. Et étendez-le dans une section circonférentielle autour de tout le bord de la cornée.Ensuite, retirez la cornée détachée ainsi que le cristallin, l’humeur aqueuse translucide et l’humeur vitrée. Tout en tenant doucement l’œilleton à l’aide d’une pince, faites soigneusement deux petites incisions sur les côtés opposés de l’œilleton. Ensuite, utilisez deux paires de pinces pour écarter doucement l’œilleton à chacune des incisions.Et séparez la rétine de la sclère. Soulevez lentement toute la rétine de la sclérotique et de l’œilleton et coupez le nerf optique s’il est toujours attaché. Après cela, faites des coupes longitudinales dans la rétine pour obtenir des demi-sections ou des quarts.Ensuite, étalez doucement une section rétinienne sur un treillis en nylon, les cellules ganglionnaires étant tournées vers l’opposé du treillis. Placez le treillis et la rétine sur un réseau multiélectrodes perforé avec les cellules ganglionnaires en contact avec une surface PMEA. Et puis placez un poids sur le maillage pour maintenir la rétine en place.Dans cette procédure, sous un éclairage rouge tamisé, placez PMEA dans l’amplificateur MEA et fermez les loquets de l’amplificateur. Positionnez la sortie de perfusion supérieure à l’intérieur de la chambre PMEA et tournez la valve de perfusion supérieure pour atteindre un taux de perfusion d’environ trois millilitres par minute. Ensuite, positionnez l’entrée d’aspiration supérieure au niveau de perfusion souhaité.Assurez-vous qu’il fonctionne. Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition de données et cliquez sur le bouton de lecture pour commencer à recevoir des données. Assurez-vous que tous les canaux PMEA sont exempts de bruit et enregistrent des signaux neurologiques.Si ce n’est pas le cas, repositionnez le PMEA dans l’amplificateur pour obtenir un meilleur contact entre les broches de l’amplificateur et les contacts PMEA. Ensuite, assurez-vous que la ligne de perfusion inférieure est exempte de bulles d’air. Tournez la valve de perfusion inférieure pour vous assurer que la rétine est alimentée en oxygène et en nutriments.Ensuite, allumez la caméra haute vitesse fixée au microscope optique inversé et ouvrez le logiciel d’imagerie. Une fois que la perfusion inférieure est confirmée comme étant en écoulement, augmentez lentement l’aspiration par le bas en tournant manuellement le bouton de pression du vide sur le kit de déchets sous vide tout en observant la rétine à travers le microscope inversé. Une fois qu’une force d’aspiration est observée agir sur la rétine, cessez d’augmenter l’aspiration.Après vous être assuré que la rétine a été maintenue en place par l’aspiration inférieure, retirez le poids de la rétine à l’aide d’une pince et retirez délicatement le treillis en nylon en décollant soigneusement un coin de la rétine. Maintenez la perfusion pendant environ 30 minutes pour permettre à la rétine de se stabiliser après le traumatisme chirurgical. Dans cette étape, insérez soigneusement une micropipette pré-tirée de 10 micromètres de diamètre dans un porte-pipette standard contenant une électrode à fil de chlorure d’argent-argent de 50 micromètres de diamètre.Si vous utilisez plutôt un dispositif microfluidique multipoint, insérez la tige en acier inoxydable connectée à l’appareil dans un porte-pipette standard sans fil-électrode. Si vous utilisez une micropipette en verre, interfacez le support de pipette avec une pince de serrage et connectez la connexion inférieure de l’orifice de pression du porte-pipette à l’un des canaux du système d’injection sous pression. Ou, si vous utilisez le dispositif multiport, connectez les raccords Luer de l’orifice de pression de chacun des huit orifices d’injection, avec les canaux un à huit du système d’injection sous pression.Ensuite, allumez manuellement le système d’injection sous pression et activez le premier canal. Assurez-vous que le système est ventilé dans l’atmosphère et réglez la pression d’injection à 0,1 livre par pouce carré. Ensuite, allumez le micromanipulateur et calibrez-le en appuyant sur le bouton de calibrage du contrôleur du manipulateur.Positionnez le micromanipulateur de manière à ce que la pointe de la micropipette soit à environ 30 millimètres au-dessus de l’amplificateur MEA. Ensuite, remplissez une petite boîte de Pétri avec une solution de glutamate et placez-la sous le micromanipulateur. Abaissez la pointe de la micropipette dans la solution et remplissez la micropipette en verre ou le tube du dispositif multiport avec environ 20 millimètres de solution.Ensuite, soulevez la pointe de la micropipette, ou le dispositif, hors de la solution. Retirez la boîte de Pétri et placez le micromanipulateur au-dessus de la chambre PMEA. À l’aide d’un microscope stéréoscopique monté sur pied, alignez la pointe de la micropipette, ou les coins de l’appareil, avec une marque de référence gravée dans l’anneau de la chambre PMEA.Ensuite, enregistrez les positions du manipulateur dans la surface de contrôle à l’aide des boutons de mémorisation de référence A et de référence de mémoire B pour cartographier le système de coordonnées du manipulateur des électrodes PMEA. Ensuite, utilisez le logiciel de contrôle du manipulateur. Sélectionnez une électrode PMEA cible avec une activité spontanée robuste et cliquez sur le bouton de déplacement vers le canal pour aligner la micropipette en verre avec l’électrode cible.Si vous utilisez le dispositif multiport, alignez les microports du dispositif avec les électrodes PMEA cibles à activité spontanée robuste en utilisant le même processus. Si la mesure d’impédance est disponible, allumez l’amplificateur de patch clamp et lancez le logiciel de visualisation d’impédance en cliquant sur le bouton de démarrage pour visualiser l’impédance de l’électrode argent-chlorure d’argent à l’intérieur du porte-pipette. Tout en observant les signaux d’impédance en temps réel, abaissez lentement la micropipette, ou dispositif, jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec la surface rétinienne, comme l’indique une augmentation rapide du signal d’impédance.Pour la stimulation souterraine, abaissez la pipette de 40 micromètres pour les rétines S334 tera trois, ou de 70 micromètres pour les rétines de type sauvage. Effectuez quelques injections de courte durée à l’aide du système d’injection sous pression. Déterminer si les cellules proches de l’extrémité de la micropipette, ou des microports du dispositif, sont réceptives à la stimulation du glutamate en observant les signaux neuronaux.Maintenant, orientez la LED verte vers la surface supérieure de la rétine. Commencez l’enregistrement à l’aide du logiciel d’acquisition de données en tapant le nom du fichier et en cliquant sur le bouton d’enregistrement. Une fois l’enregistrement commencé, ouvrez le programme de contrôle du stimulus et chargez le fichier de stimulus par défaut en cliquant sur le bouton Lire le fichier de stimulus.Ensuite, cliquez sur le bouton Exécuter le fichier de stimulus pour lancer le fichier de stimulus par défaut. Une fois le fichier de stimulus terminé, arrêtez l’enregistrement pour sauvegarder le fichier en vue d’un tri des pointes et d’une analyse des données ultérieurs. Voici les enregistrements représentatifs de neuf électrodes PMEA, montrant les données des électrodes filtrées passe-haut lors d’une stimulation lumineuse visuelle avec une LED verte, où chaque rectangle montre les données neuronales d’une électrode unique.Chaque enregistrement d’électrode illustre les données collectées dans la première seconde après l’allumage de la LED verte. Les pointes ont été identifiées à l’aide d’une tension de seuil de moins 18 microvolts. La stimulation visuelle a provoqué une rafale de pointes dans toutes les électrodes, à l’exception de celle du centre supérieur, qui possédait une réponse inhibitrice à la lumière.Un graphique similaire pour les mêmes électrodes, montrant une activité neuronale spontanée sans stimulation visuelle ou injection. Bien que des rafales plus petites aient été présentes, les motifs des pointes étaient très différents de ceux enregistrés en réponse à la stimulation visuelle. Voici les enregistrements représentatifs du même sous-ensemble d’électrodes enregistrées immédiatement après une injection de glutamate à l’électrode centrale.Le glutamate injecté a provoqué une rafale de pointes dans l’électrode centrale qui était très similaire aux rafales de pointes visuellement évoquées. Toutes les autres électrodes n’ont pas été affectées par l’injection de glutamate, ce qui démontre la résolution spatiale fine de la technique de stimulation chimique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de surveiller la perfusion pour s’assurer que la rétine est continuellement alimentée en oxygène et en nutriments tout au long de l’expérience. Cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la vision artificielle et du développement de prothèses visuelles pour explorer la neuromodulation à base de produits chimiques pour traiter la cécité due aux maladies dégénératives des photorécepteurs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’accomplir la neuromodulation des neurones rétiniens à l’aide de neurotransmetteurs.

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Bioengineering

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L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

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La modification de l’équipement existant de réseau multiélectrodes ou de pince patch rend l’électrorétinogramme ex vivo plus largement accessible. Des méthodes améliorées pour enregistrer et maintenir les réponses lumineuses ex vivo facilitent l’étude du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans la rétine saine, des modèles animaux de maladies oculaires et des rétines de donneurs humains.

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Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro

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