Name: Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Apprenez l'approche du canal semicirculaire postérieur pour la livraison de gènes dans l'oreille interne chez les souris néonatales. Cette méthode chirurgicale fiable permet une perfusion complète et facilite la recherche en thérapie génique.

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Ce travail a été soutenu par des fonds provenant du NIDCD Division d’intra-muros recherche /NIH (DC000082-02 à W.W.C.), ainsi que des DC000081 à base d’imagerie avancées. Nous sommes reconnaissants pour le personnel d’animalerie NIDCD pour prendre soin de nos animaux.

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut National sur la surdité et d’autres troubles de la Communication (NIDCD ASP1378-15) et animalier.
1. préparation et installation de procédure
<ol><li>Stériliser tous les instruments à l’oxyde d’éthylène dans le début de l’expérience. Entre les animaux, nettoyer les instruments utilisant la stérilisation de la perle.</li>
	<li>Chargez la solution contenant la thérapie génique virale dans une micropipette sur le micro-injecteur. Le vecteur viral utilisé dans cette étude était AAV2/8-whirlin (1 x 1013 copies de génome par millilitre, voir la table des matières). Remarque : En général, 1.1 volume total µL est chargé dans une micropipette.</li>
</ol>2. anesthésie
Remarque : La souche de souris utilisée dans cette étude est la souris de danseur. Les mutants homozygotes (Whrnwi/wi) et même portée hétérozygote (Whrn+ / wi) ont été utilisés.
<ol><li>Placer la mère dans une cage séparée (séparé de la litière).</li>
	<li>Placez la cage contenant de la litière (P0 - chiots P5) sur une bouillote recirculation (préréglée à 37,5 ° C) pour garder les souris chaude.</li>
	<li>Découper la partie de pouce d’un gant en latex et placez un chiot dedans.</li>
	<li>Placez le chiot au pouce gant en latex dans un seau de glace pendant environ 2 min.</li>
	<li>Placez le chiot anesthésié sur un pack de grande place commerciale gel en plastique avec de la gaze 4 "x 4" entre le chiot et de la surface de la meute.</li>
	<li>Remplissez un gant en latex lourds avec de la glace pilée, puis le gant de glace autour du chiot.</li>
	<li>Vérifier si le chiot est suffisamment anesthésié par une absence totale de réponse à divers stimuli (y compris une pincée de pied ferme). Laissez le chiot sur la banquise pendant la durée de l’intervention (environ 5-10 min). Remarque : Nous recommandons de laisser les bébés phoques sur la banquise pendant pas plus de 15 min pendant la chirurgie.</li>
</ol>3. abord chirurgical (Figure 1)
<ol><li>Nettoyer la peau derrière l’oreille avec une lingette d’iode et un imbibé d’alcool une fois que l’animal est anesthésié.</li>
	<li>Faire une incision postauricular ~ 2 mm derrière l’oreille à l’aide de micro-ciseaux et diviser le muscle sternocléidomastoïdien avec micro-ciseaux.</li>
	<li>Identifier le nerf facial et la bulle tympanique. La bulle tympanique est cartilagineux et semi-transparents à cet âge et il se trouve vers le nerf facial. L’artère stapédiens transparaît à travers la bulle tympanique à cet âge, qui est un point de repère utile.</li>
	<li>Suivez le nerf facial supérieurement et postérieurement pour localiser le canal postérieur de semi-circulaires (PSCC). Retirer les fibres musculaires et des tissus mous, recouvrant le canal semicirculaire postérieur à l’aide de micro-ciseaux. Remarque : Le PSCC est cartilagineux à cet âge.</li>
	<li>Pénétrer le PSCC à l’aide d’une micropipette de verre (~ 10 μm de diamètre) sur la micro-injecteur.</li>
	<li>Injecter la thérapie génique virale dans l’oreille interne. Remarque : En règle générale, un total de 20 injections de 49 nL de la thérapie génique sont livrés dans le canal de semi-circulaires postérieur plus de ~ 40 s (volume total ~ 1 µL). Le titre viral utilisé a été de 1 x 1013 génome copies / mL.</li>
	<li>Refermer l’incision de la peau à l’aide d’une suture de polyglactin 5-0.</li>
</ol>4. postopératoire soins
<ol><li>Placez le chiot sur un coussin chauffant pour rétablir une température corporelle normale au cours de l’anesthésie avec constante stimulation/roulant manuel avec des doigts humains gantés.</li>
	<li>Une fois que le chiot est éveillé, il remettre dans sa cage maison.</li>
	<li>Caressent chaque chiot avec un coton tige qui a été exposé à la literie maison cage. Remarque : Le but de ce est que les souris sentir comme ils le faisaient avant l’opération, ce qui augmente la probabilité de la mère re-accepter son post-chirurgie de la litière. Si possible, urine de la mère peut être collecté et frotté sur les chiots à l’aide d’un coton-tige pour réduire davantage le risque de rejet.</li>
	<li>Appliquez l’huile minérale au nez de la mère pour désensibiliser sa8et réintroduire la mère dans la cage.</li>
</ol>

<ol><li>Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for sensorineural hearing loss.</a> Ear Hear. 36, 1-7 (2015).</li>
<li>Askew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmc+gene+therapy+restores+auditory+function+in+deaf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice.</a> Sci Transl Med. 7, 295(2015).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75, 283-293 (2012).</li>
<li>Pan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+restores+auditory+and+vestibular+function+in+a+mouse+model+of+Usher+syndrome+type+1c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c.</a> Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).</li>
<li>Isgrig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Balance+and+Auditory+Functions+in+a+Mouse+Model+of+Usher+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome.</a> Mol Ther. 25, 780-791 (2017).</li>
<li>Lentz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+hearing+and+vestibular+function+by+antisense+oligonucleotides+in+a+mouse+model+of+human+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness.</a> Nat Med. 19, 345-350 (2013).</li>
<li>Shibata, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+Prevents+Autosomal-Dominant+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss.</a> Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).</li>
<li>Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+care+and+use+of+mammals+in+neuroscience+and+behavioral+research%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research.</a> Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).</li>
<li>Chien, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Restores+Hair+Cell+Stereocilia+Morphology+in+Inner+Ears+of+Deaf+Whirler+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice.</a> Mol Ther. 24, 17-25 (2016).</li>
<li>Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lipopolysaccharide+compromises+the+blood-labyrinth+barrier+and+increases+entry+of+serum+fluorescein+into+the+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).</li>
<li>Okada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+targeting+mouse+vestibule+using+adenovirus+and+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors.</a> Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).</li>
<li>Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy+with+ancestral+AAV+in+adult+mice%3A+complete+transduction+of+inner+hair+cells+without+cochlear+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction.</a> Sci Rep. 7, 45524(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation pertinente à faire.

Plusieurs approches chirurgicales ont été décrites pour accéder aux rongeurs des oreilles internes. Cochleostomy et approches de la fenêtre ronde sont utilisés couramment pour accéder à la cochlée, tandis que le postérieur canal semicirculaire et approches du sac endolymphatique sont généralement utilisés pour accéder les organes vestibulaires1. Dans une étude récente, nous avons montré que canal semicirculaire postérieur des injections de thérapie génique virale a donné lieu à un rendement élevé ...

Thérapie génique oreille interne est un champ connaissent un développement rapide de l’enquête. Il a été appliqué dans divers modèles animaux d’ototoxicité combattre trauma de bruit et de perte auditive héréditaire1. Plusieurs études récentes ont montré une récupération fonctionnelle de l’audition et équilibre des fonctions chez des souris mutantes après oreille interne gene therapy livraison2,3,4,5,6, 7. un des principaux facteurs pour déterminer le succès de la thérapie génique oreille interne est l’approche chirurgicale utilisée pour accéder à l’oreille interne. Idéalement, l’approche chirurgicale serait facile à réaliser, les repères anatomiques serait cohérente et facile à identifier, et la transduction résultante de types de cellules ciblées serait élevée.
Dans une étude récente, nous avons montré que, lorsque la thérapie génique virale a été injectée par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur de la souris mutante danseur (un modèle de perte auditive et de dysfonctionnement vestibulaire), transduction efficace des cellules sensorielles de cheveux a été observée dans le vestibulaire organes ainsi que dans la cochlée5. La grande efficacité de la transduction des cellules ciliées sensorielles conduit à une amélioration des fonctions auditives et vestibulaires chez ces souris mutantes.
Dans cet article, nous décrivons en détail l’approche postérieure canal semicirculaire pour accéder à l’oreille interne de souris néonatales.

<table><tbody><tr><td>Microscope opératoire</td> Microscope ORL <td>Zeiss</td><td></td><td>OPMI Pico. D’autres microscopes de dissection fonctionneraient également.</td></tr><tr><td>Micro-forcepts</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10, 11295-51</td><td>#5 et #55 Dumont</td></tr><tr><td>Micro-ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter2000 microinjecteur</td><td>World Precision Instruments Coussin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chauffant</td><td>Mastex</td><td>Modèle 500/600</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl sutures</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV8-whirlin</td><td>Vector Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td>Verre borosilicaté</td></tr></tbody></table>

approche postérieure canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Thérapie génique oreille interne offre très prometteur comme traitement potentiel pour la perte d’audition et des vertiges. Un des déterminants essentiels de la réussite de la thérapie génique oreille interne est de trouver une méthode de livraison qui se traduit par l’efficacité de transduction cohérente de types cellulaires ciblés tout en minimisant la perte d’audition. Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode viable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne. L’identification facile anatomique du canal semicirculaire postérieur, ainsi qu’une manipulation minimale de l’OS temporal requis, faire cette chirurgie approcher une option attrayante pour la livraison de gène oreille interne.

Injection de AAV8-whirlin de thérapie génique chez la souris néonatales danseur à travers le canal semicirculaire postérieur a entraîné whirlin expression (vert) dans les cellules de cheveux utriculaire (Figure 2), avec l’efficacité globale de l’infection de 53,1 % (SD 38.1, n = 28)5 . Transduite cellules ciliées avait allongé stéréocils (rouge) par rapport aux cellules ciliées controlatérale oreilles non injectés (5,35 µm ± 2.11 vs 3,...

Dans cette étude, nous décrivons l’approche postérieure canal semicirculaire comme une méthode fiable pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales. Nous montrons que la livraison de gène par l’intermédiaire du canal semicirculaire postérieur est capable de perfuse l’ensemble oreille interne.

Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

L’objectif global de cette procédure est d’accéder à l’oreille interne de la souris pour l’administration de gènes. Cette méthode peut aider à administrer une thérapie génique à l’oreille interne de la souris de manière efficace. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est fiable et facile à apprendre.Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal en raison de la petite taille de l’oreille interne de la souris. Cependant, avec de la pratique, la plupart des gens peuvent effectuer une dissection chirurgicale en dix minutes. Commencez la procédure avec des instruments stériles et allumez le stérilisateur à billes pour nettoyer les instruments entre les animaux.Chargez le virus thérapeutique dans une micropipette de dix microns de diamètre attachée à un micro-injecteur. Le vecteur viral utilisé dans nos expériences est AAV28-whirlin avec un titre de un fois dix à 13 copies du génome par millilitre. Pour cette vidéo, un colorant bleu de méthylène a été utilisé pour faciliter la visualisation.Nettoyez la peau derrière l’oreille avec trois gommages à la bétadine suivis d’une lingette imbibée d’alcool. Ensuite, utilisez des micro-ciseaux pour faire un post-auriculaire à environ deux millimètres derrière l’oreille et diviser les tissus mous sous-jacents. Identifiez le nerf facial et la bulle.Le muscle sterno-cléido-mastoïdien est perpendiculaire au nerf facial. L’artère stapédiale peut être vue à travers la bulle qui est un point de repère utile. Suivez le nerf facial vers le haut et vers l’arrière pour localiser le canal semi-circulaire postérieur.Utilisez les micro-ciseaux pour retirer les fibres musculaires et les tissus mous recouvrant le canal semi-circulaire postérieur. Ensuite, pénétrez dans le canal semi-circulaire postérieur avec la micropipette en verre chargée sur le micro-injecteur et injectez le colorant dans l’oreille interne. En règle générale, un total de 20 injections de 49 nanolitres sont administrées dans le canal semi-circulaire postérieur en 40 secondes pour un volume total d’environ un microlitre.Retirez la pipette immédiatement après l’administration du dernier volume. Ensuite, fermez l’incision cutanée à l’aide d’une suture polyglactine 5-0. L’injection d’AAV8-whirlin dans des souris whirlin néonatales, comme le montre cette vidéo, a entraîné une expression de whirlin affichée en vert dans les cellules ciliées utriculaires.Les cellules ciliées transduites avaient des stéréocils allongés indiqués en rouge par rapport aux cellules ciliées des oreilles controlatérales non injectées. L’injection canalaire semi-circulaire postérieure de l’AAV8-whirlin a également entraîné la transduction des cellules ciliées cochléaires chez les souris whirler. Les cellules ciliées transduites exprimaient un tourbillon aux extrémités des stéréocils et présentaient des stéréocils allongés par rapport aux cellules ciliées des oreilles controlatérales non injectées.Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’ABI et le test stéréo peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que si l’administration de gènes de l’oreille interne a un effet sur les fonctions auditives et vestibulaires. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’administration des gènes de l’oreille interne pour explorer les défauts de l’administration des gènes dans l’oreille interne de la souris.

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Source : Kozin, E. D., et.al. Visualisation directe du noyau cochléaire dorsal murin pour la stimulation optogénétique de la voie auditive. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre le transfert de gènes médié par le virus dans le noyau cochléaire dorsal (DCN) de souris pour permettre la stimulation auditive induite par la lumière. Un vecteur viral codant pour l’opsine, un canal ionique sensible à la lumière, est injecté dans le DCN à la suite d’une craniotomie et d’une aspiration cérébelleuse...

Transfert de gènes médié par un virus dans le noyau cochléaire dorsal de souris pour une stimulation auditive induite par la lumière

Cette vidéo présente la canalostomie, une procédure qui permet l’administration locale d’un médicament dans l’oreille interne d’une souris par le canal semi-circulaire avec des dommages minimes à l’audition et à la fonction vestibulaire. Cette méthode permet d'inoculer des vecteurs viraux, des produits pharmaceutiques et de petites molécules dans l'oreille interne de la souris.

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Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

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