Pré conditionnement les voies respiratoires des souris à la bléomycine augmente l’efficacité de la prise de greffe orthotopique Lung Cancer Cell

L’objectif global de cette procédure est d’augmenter l’efficacité de la transplantation de cellules cancéreuses du poumon initiatrices de tumeurs dans les voies respiratoires des souris. Cette méthode peut aider à établir de nouveaux modèles précliniques afin de répondre à des questions clés en biologie du cancer, notamment les causes de la résistance aux médicaments et la relation entre la fibrose et le cancer du poumon. Le principal avantage de cette technique est qu’elle augmente l’efficacité de la transplantation de cellules initiatrices de tumeurs dans les poumons d’une variété de souches de souris.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie, car elle nous permet de modéliser une plus grande variété de sous-types de cancer du poumon humain, connus pour avoir différentes réponses cliniques au traitement. Pour ce protocole, les souris doivent d’abord être injectées avec de la bléomycine. Ensuite, après 14 jours, les cellules tumorales sont injectées.

La procédure pour les deux injections est très similaire et décrite ici. Deux heures avant l’injection, décongelez le stock de bléomycine sur de la glace et diluez-le à la concentration de travail. Gardez-le sur de la glace.

Pour un bolus cellulaire, faites préparer une suspension cellulaire comme décrit dans le protocole textuel. Le temps de procédure pour chaque souris est d’environ 10 minutes au total. Assurez-vous de confirmer l’anesthésie appropriée à l’aide d’un pincement des orteils et d’appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux.

À ce moment-là, si la souris a les poils foncés, rasez toute la zone des côtes ventralement et dorsalement afin qu’elle puisse être imagée correctement. Ensuite, placez la souris sur la plateforme d’intubation en la fixant par ses dents de devant, le dos contre la plateforme. Si un bolus cellulaire doit être injecté, le remettre en suspension maintenant avec une trituration douce.

Illuminez maintenant la partie supérieure de la poitrine, ouvrez la bouche et tirez doucement la langue à l’aide d’une pince plate. Préparez un cathéter IV pour la trachée en retirant l’aiguille, puis positionnez-le sur l’ouverture trachéale. Ensuite, insérez le cathéter dans la trachée jusqu’à ce que le haut du cathéter soit près des dents de devant et éclairez l’intérieur du cathéter pour confirmer son emplacement.

Ensuite, versez les 50 microlitres de bléomycine fraîchement préparée, ou suspension cellulaire, directement dans le cathéter. Attendez quelques secondes que tout le volume descende dans le cathéter. Ensuite, retirez le cathéter et jetez-le dans de l’eau de Javel à 10 %.

Si la souris n’inhale pas le liquide, surveillez attentivement sa respiration et ajustez la position du cathéter. Si la souris cesse de respirer, retirez immédiatement le cathéter et laissez-la respirer avant de réinsérer le cathéter. Après avoir retiré le cathéter, continuez à effectuer la procédure pour avoir cinq souris traitées, toujours anesthésiées et prêtes à être photographiées.

Pour la récupération, placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chauffant approuvé par l’IACUC dans une cage de récupération et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Deux ou trois minutes après l’injection des cellules, injectez 100 microlitres de luciférine par voie rétro-orbitaire, à l’aide d’une aiguille à insuline. Alterner l’œil utilisé pour l’injection à chaque séance d’imagerie.

Après avoir attendu au moins deux minutes, placez jusqu’à cinq souris dans un imageur de bioluminescence animale, en position couchée sternale et acquérez une image dorsale à l’aide des paramètres de luminescence. Sous le panneau de configuration, ajustez les paramètres de résolution et de sensibilité, pour mesurer la luminescence des cellules. Pour la plupart des applications, commencez par trois minutes, réglez le binning sur moyen, réglez le f/stop sur un, réglez le champ de vision sur d et réglez la hauteur du sujet sur 1,5.

Si l’injection a réussi, un signal est détecté dans la partie supérieure de la poitrine dans un poumon ou les deux poumons. Si les cellules sont regroupées à l’entrée de la trachée, l’injection a échoué. Après avoir pris l’image dorsale, retournez les souris et acquérez une image ventrale et ajustez le réglage si nécessaire.

Après l’imagerie, procédez aux soins postopératoires tels que décrits dans le protocole textuel. Ensuite, répétez ce protocole d’imagerie trois jours après la greffe et une fois par semaine par la suite. Pour analyser les images, utilisez un logiciel d’analyse de bioluminescence.

Tout d’abord, chargez toutes les images appropriées de la série. Cette section est détaillée à un seul logiciel. Ensuite, pour chaque souris, dans la première image de la série, créez une région carrée d’intérêt et positionnez-la sur la zone supérieure de la poitrine couvrant toute la région pulmonaire.

Ensuite, à l’aide d’un clic droit, accédez à la fonction copier toutes les régions d’intérêt et utilisez cet outil pour appliquer les mêmes régions d’intérêt à chaque image du groupe. Ensuite, dans chaque image, ajustez les positions des carrés pour couvrir le haut de la poitrine de chaque souris. Faites-le pour les vues ventrale et dorsale.

Maintenant, dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de l’image, sélectionnez la fonction photons. Sélectionnez ensuite l’option de mesure. Les données des régions d’intérêt sont ensuite affichées dans un tableau de sortie sous forme de flux total.

Analysez ces données au besoin. Lorsqu’elles étaient immunodéprimées, les souris athymiques ont été traitées avec de la bléomycine. Avant la greffe en bolus cellulaire, une fibrose transitoire a été observée au jour 14 chez les souris traitées à la bléomycine, mais pas chez les souris traitées par véhicule.

Ensuite, des cellules de la lignée cellulaire établie du cancer du poumon humain, H2030, ont été administrées par voie intratrachéale dans les poumons de ces souris. Après 35 jours, les souris traitées à la bléomycine présentaient une charge tumorale pulmonaire élevée. Cependant, chez les animaux traités par véhicule, aucune tumeur n’a été détectée.

La charge tumorale pulmonaire a été confirmée par histologie. Les poumons prétraités avec véhicule ne présentaient aucun signe de nodules tumoraux, tandis que les poumons prétraités à la bléomycine présentaient de gros nodules tumoraux. Après la transplantation d’une lignée cellulaire métastatique H2030 BrM 3, à 39 à 57 jours, la bioluminescence était trop intense pour l’imagerie, de sorte que les métastases ont été analysées dans des organes distants ex vivo.

De petites lésions ont pu être détectées dans divers tissus, ce qui suggère que cette méthode est prometteuse pour étudier les maladies spontanément disséminées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes par cage de cinq souris sans imagerie et en 20 minutes par cage en imageant également les souris. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer de l’insertion correcte du cathéter et de surveiller la respiration de l’animal.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que des études pharmacologiques ou la chimie aminoacétique des tissus récoltés peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont les tumeurs greffées réagissent aux médicaments ou la caractérisation des interactions stromales tumorales spécifiques aux poumons. Après son développement, cette technique pourra être appliquée à différentes souches de souris et modèles tumoraux, y compris des xénogreffes dérivées de patients dans un cadre physiologiquement pertinent. N’oubliez pas que travailler avec de la bléomycine peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la manipulation dans une hotte à risque biologique et l’élimination appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.