Établir un modèle de souris d’une neuropathie Pure petites fibres avec l’agoniste Ultrapotent de Transient Receptor potentiels Vanilloid Type 1

L’objectif global de cette procédure d’administration de neurotoxines spécifiques sensorielles pour les souris est d’établir un modèle de neuropathie sensorielle chez les petits animaux. Cette technique aide à exposer les lois des petites fibres sensorielles des lésions dans la neuropathie sensorielle. Son principal avantage est qu’il est rapide et facile.

Ces souris peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuropathique sensoriel, telles que quelle voie est une contribution cruciale pour les grandes fibres sensorielles. Pour commencer, mettez un équipement de protection individuelle et prenez les précautions appropriées lors de la préparation de la solution mère de résinifératoxine, ou RTX. Diluez une aliquote de 600 microlitres dans une solution saline pour l’expérience et divisez le reste en 12 aliquotes de microlitres pour le stockage.

Pour les souris d’essai, utilisez des souris ICR mâles adultes de huit semaines, pesant entre 35 et 40 grammes. Administrer une dose unique de solution RTX par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de micro-injection. Ensuite, injectez un deuxième groupe de souris avec un volume égal de véhicule pour servir de contrôle.

Après avoir fait toutes les injections, logez les souris dans leurs cages et assurez-vous qu’elles ont un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Après sept jours, commencez à effectuer des tests comportementaux une fois par semaine. Effectuez les deux tests le même jour dans une salle d’essai calme, dans un environnement stable.

Commencez par mesurer les latences thermiques des animaux avec le test de la plaque chauffante. Réglez une plaque chauffante en métal à 52 degrés Celsius. Ensuite, placez délicatement un animal dans une cage en plexiglas transparent sur la plaque chauffante.

Démarrez une minuterie dès que les pattes arrière de l’animal touchent la cage chaude. Si l’animal commence à trembler, à se lécher les pattes arrière ou à sauter, retirez-le et notez combien de temps il a résisté à la plaque chauffante au dixième de seconde près. Si l’animal ne montre aucune réponse sur la plaque chauffante, arrêtez la séance après 25 secondes pour éviter d’éventuelles lésions tissulaires.

Effectuez trois essais par animal, avec un temps de repos de 30 minutes entre les essais. Plus tard, utilisez le temps moyen des trois tests comme score final de l’animal. Ensuite, mesurez le seuil de sensation mécanique de l’animal.

Mettez l’animal dans une cage ronde transparente, avec un treillis métallique en guise de sol. Après l’acclimatation, appliquez les différents calibres de filaments de poils de von Frey sur la région plantaire de la patte arrière, en utilisant la méthode de haut en bas. Pour la première stimulation, appliquez un filament de force moyenne pendant 5 à 8 secondes.

Après chaque stimulation, attendez deux minutes, puis appliquez la force suivante en fonction de la réponse précédente de l’animal. Si la patte arrière s’est retirée, utilisez le filament de calibre inférieur suivant. Et si la patte arrière ne s’est pas retirée, utilisez le filament suivant plus grand.

Continuez ce processus jusqu’à ce que la souris ait été piquée six fois. Ensuite, calculez le seuil mécanique à l’aide d’une formule établie. Chaque jour de test, effectuez trois essais sur chaque patte arrière.

Exprimer la moyenne de ces six seuils mécaniques comme seuil mécanique moyen de chaque animal. Pour l’euthanasie, utilisez 5 % d’isoflurane, suivi d’une perfusion intracardiaque. Ensuite, retirez les premiers coussinets des deux pattes arrière et fixez-les dans 4 pour cent de PFA pendant six heures.

Après la fixation, transférez-les dans un tampon de phosphate de 0,1 molaire à 4 degrés Celsius. Il s’agit d’une solution de stockage à long terme. Avant la cryosection, faites tremper les coussinets plantaires dans 30 % de saccharose dans du PBS pendant la nuit.

Le lendemain, à l’aide d’un cryostat, faites des tranches de tissu de 30 microns en coupant verticalement à la surface plantaire. Étiquetez les sections des coussinets de pied de manière séquentielle, puis stockez-les dans une solution anti-feeze à moins 20 degrés Celsius. Lors de l’échantillonnage des sections, sélectionnez une section sur trois et transférez-la sur une lame de verre à couche pour la faire sécher à l’air.

Ensuite, couvrez chaque côté avec une plaque de recouvrement et traitez-les avec une procédure d’immunocoloration standard. Tout d’abord, trempez les sections des coussinets de pied avec 1 % de peroxyde d’hydrogène dans du méthanol pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les mouchoirs trois fois à l’aide d’un tampon Tris de 0,5 molaire à température ambiante.

Ensuite, incubez les tissus dans une solution en bloc pendant une heure. Ensuite, incubez les sections avec un anti-sérum contre le marqueur pan-axonal pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les sections avec le tampon Tris trois fois, puis incubez les sections dans des IgG anti-lapin biotinylées à température ambiante pendant une heure.

Plus tard, utilisez trois lavages avec un tampon Tris pour éliminer les anticorps non liés. Ensuite, incubez les tissus avec le complexe de biotine avidine à température ambiante pendant 45 minutes. Pour tacher le produit de réaction, appliquez brièvement la solution DAB pendant 45 secondes, puis lavez les sections des coussinets de pied à l’eau distillée et faites-les sécher à l’air libre avant le montage.

Après avoir retiré les coussinets de l’animal euthanasié, disséquez les quatrième et cinquième DRG lombaires. Ensuite, post-fixez les tissus DRG disséqués pendant deux heures dans quatre pour cent de PFA à température ambiante. Ensuite, cryoprotégez les tissus DRG avec 30 % de saccharose dans du PBS pendant la nuit.

Le lendemain, coupez-les en tronçons de huit microns. Placez-les sur des diapositives et étiquetez-les. Stockez ces sections à moins 80 degrés Celsius.

Utilisez la même méthode que celle utilisée pour les sections de coussinets plantaires, sauf lors de l’étiquetage, incluez ATF-3, un marqueur de blessure, et peripherin, un marqueur neuronal de petit diamètre dans l’antisérum, et exécutez cette réaction pendant la nuit. Après avoir lavé les sections, incubez-les avec l’anti-séruma secondaire approprié. Ensuite, après une autre série de lavages, montez les sections pour la quantification.

Ce protocole décrit un nouveau modèle murin de neuropathie à la résinifératoxine, qui affecte spécifiquement les neurones de petit diamètre, y compris la dégénérescence IENF associée à des troubles sensoriels. La dose de 50 microgrammes par kilogramme a été jugée critique et une dose plus élevée était souvent mortelle. Sept jours après l’injection de RTX, les animaux présentaient une hypoalgésie thermique et une allodynie mécanique.

À la dose critique, il y avait une dégénérescence de l’IENF et une induction marquée de l’ATF-3. Les neurones lésés étaient des neurones de petit diamètre positifs à la phérine. En revanche, la faible dose de RTX n’a pas établi de neuropathie des petites fibres et n’a montré aucun changement dans l’innervation.

La faible dose n’a pas non plus montré d’induction d’ATF-3, un marqueur de lésion neuronale. Ainsi, la dose critique de 50 microgrammes de RTX par kilogramme est suggérée pour l’application de la méthode décrite. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un modèle de neuropathie sensorielle pure.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la neuropathie sensorielle de petite taille, à sa contribution de produit de la blessure des petits nerfs sensoriels, dans le développement de la douleur neuropathique. N’oubliez pas que le RTX est neurotoxique et dangereux et peut agir comme un irritant pour les yeux, les muqueuses, les voies respiratoires supérieures. Évitez l’inhalation et portez des lunettes de laboratoire et un manteau lors de la manipulation du RTX.

Rincer abondamment à l’eau en cas de contact avec la peau et après manipulation.