Synthèse et analyse de spectrométrie de masse des Oligo-peptoids

Un protocole est décrit pour la synthèse manuelle des oligo-peptoids suivie par le séquençage par spectrométrie de masse.

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment synthétiser manuellement des oligo-peptoïdes et comment analyser leur séquence de monomères en utilisant des techniques de spectrométrie de masse. La méthode peut aider les débutants à répondre à des questions clés dans un domaine peptoïde, telles que comment fabriquer des peptoïdes et comment caractériser leur séquence de monomères. Le principal avantage de cette technique est que les peptoïdes contenant des résidus de monomères spéciaux peuvent être synthétisés et analysés dans le laboratoire de chimie analytique standard.

Même si cette méthode se concentre sur les oligo-peptoïdes, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les peptides et les oligo-nucléotides. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal, car il est difficile d’obtenir des conditions optimales de spectrométrie de masse sans démonstration visuelle. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu caractériser les caractéristiques structurales des peptoïdes par des méthodes de spectrométrie de masse en tandem.

Pesez d’abord 84 milligrammes de résine Rink amide et ajoutez-la dans un récipient de réaction en phase solide en polypropylène de 10 millilitres. Insérez ensuite un piston dans le récipient. Ensuite, ajoutez deux millilitres de TMF dans la cuve de réaction et bouchez la cuve avec un capuchon à pression.

Agitez le récipient sur un agitateur à température ambiante à un angle de mouvement d’environ 12 degrés et 385 oscillations par minute pendant 30 minutes. Après avoir retiré le bouchon, égouttez la solution dans un récipient à déchets en poussant le piston de la cuve de réaction. Ajoutez deux millilitres de 20 % de pipéridine dans du DMF dans le récipient et bouchez le récipient.

Après avoir agité le récipient pendant deux minutes, égouttez la solution dans le récipient à déchets. Répétez la procédure, ajoutez deux millilitres de solution de DMF à 20 % de Pep dans le récipient et bouchez le récipient. Agitez sur le shaker pendant 12 minutes et égouttez la solution dans le récipient à déchets.

Après avoir lavé la résine, effectuez une réaction de bromo-acétylation, en mélangeant un millilitre d’acide bromoacétique 0,8 molaire dans du DMF et un millilitre de DIC 0,8 molaire dans du DMF dans un bécher. Transférez le mélange dans le récipient de réaction contenant la résine et bouchez le récipient. Agitez le récipient sur l’agitateur à température ambiante pendant 20 minutes.

Après l’agitation, égouttez la solution dans le récipient à déchets. Après avoir lavé la résine, effectuez une réaction de déplacement mais en ajoutant un millilitre d’une molaire de 2 méthoxyéthylamine dans du DMF dans le récipient. Après avoir bouché le récipient, agitez-le à température ambiante pendant 60 minutes.

Égouttez ensuite la solution dans le récipient à déchets. Une fois les cycles d’ajout de monomères terminés, mélangez 92 microlitres d’anhydride acétique, 43,5 microlitres de DIPEA et deux millilitres de DMF dans un bécher pour faire le cocktail d’acétylation. Ajoutez le cocktail d’acétylation dans le récipient contenant la résine.

Après avoir bouché le récipient, agitez-le à température ambiante pendant 60 minutes. Lorsque vous avez terminé, égouttez la solution dans le récipient à déchets. Après avoir lavé la résine avec du DCM, mélangez 3,8 millilitres de TFA, 100 microlitres de triisopropylsilane et 100 microlitres d’eau de qualité HPLC dans un bécher pour faire le cocktail de clivage.

Ajoutez immédiatement le cocktail de décolleté dans le récipient contenant la résine. Après avoir agité la cuve à température ambiante pendant deux heures, retirez le capuchon et recueillez la solution de filtrat dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez un millilitre de TFA dans le récipient et bouchonnez-le.

Après avoir agité pendant une minute, recueillir la solution de filtrat dans le même tube de centrifugation. Ensuite, évaporez le TFA avec un léger jet d’azote gazeux jusqu’à ce qu’il reste environ un millilitre de solution visqueuse. Ajoutez 15 millilitres d’éther diéthylique à la solution visqueuse et bouchez le tube à centrifuger.

Incuber le mélange dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant au moins deux heures pour obtenir un précipité solide blanc. Après l’incubation, tout en gardant le tube de centrifugation froid, granulez le solide à l’aide d’une centrifugeuse à 4427 fois G pendant 10 minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez le capuchon du tube et décantez soigneusement l’éther diéthylique dans un bécher.

Après avoir lavé le solide avec de l’éther diéthylique, séchez-le avec un léger jet d’azote gazeux. Ensuite, ajoutez 10 millilitres d’eau de qualité HPLC pour dissoudre le solide séché. Passez la solution à travers un filtre à seringue en nylon d’une taille d’orifice de 0,45 micron et collectez le filtrat dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 millilitres pré-pesé.

Congelez la solution peptoïde en tournant le tube de centrifugation dans un gobelet en polystyrène expansé à double empilement de 12 onces, contenant de l’azote liquide. Ensuite, lyophilisez la solution congelée pendant la nuit pour obtenir le peptoïde solide. Après avoir préparé la solution d’échantillon peptoïde pour l’analyse MS, éliminer toutes les particules insolubles possibles dans la solution diluée, en effectuant une centrifugation à 4427 fois G pendant trois minutes.

Transférez environ 700 microlitres de la partie supérieure de la solution dans un autre tube à centrifuger de 1,5 millilitre pour obtenir la solution de travail PEPTOÏDE MS avec une concentration d’environ 10 à moins cinq molaires. Une fois que les paramètres de l’instrument MS ont été réglés, ajoutez environ 300 microlitres de la solution de travail PEPTOÏDE MS dans une seringue d’un millilitre. Et connectez la seringue à l’entrée ESI à l’aide d’un tube capillaire en polyétheréthercétone.

Placez ensuite la seringue sous la pompe à seringue et réglez le débit à 10 microlitres par minute pour infuser la solution d’échantillon dans l’entrée ESI. Activez la tension de l’aiguille ESI pour activer le processus ESI, puis allumez le détecteur. Réglez l’affichage en mode profil et la plage du rapport de charge principal ou M/Z de 100 à 1500.

Affichez le spectre de masse du profil affiché dans la fenêtre du profil. Dans la fenêtre de méthode, utilisez deux minutes comme temps d’exécution. Ouvrez ensuite la fenêtre d’enregistrement, remplissez un nom de fichier propr et commencez à enregistrer le spectre.

Optimiser l’intensité du pic peptoïde protéiné à M/Z 1265. Réglez la plage M/Z de 1150 à 1350 et ajustez la tension capillaire tout en affichant l’intensité de crête en millivolts affichée dans la fenêtre de profil. Passez maintenant l’instrument en mode MSMS dans la fenêtre de méthode, utilisez 1265 comme première masse Q1 et laissez la dernière masse Q1 vide.

Utilisez 100 comme première masse Q3 et 1400 comme dernière masse Q3. Allumez ensuite le gaz CID. Ensuite, réglez l’énergie de collision à 45 volts.

Et la pression des gaz de collision à 1,5 millitorr. Visualisez le spectre de masse du profil affiché dans la fenêtre de profil en observant le pic d’ions peptidique à M/Z 1265 et les pics avec des valeurs M/Z inférieures qui représentent les ions fragment de l’ion peptoïde précurseur. Ajustez maintenant l’énergie de collision et la pression du gaz de collision pour optimiser l’affichage du spectre de fragmentation.

Dans la fenêtre de méthode, utilisez deux minutes comme temps d’exécution. Ouvrez ensuite la fenêtre d’enregistrement, remplissez un nom de fichier approprié et commencez à enregistrer le spectre. La structure du peptoïde nonamère synthétisé avec une acétylation n terminale est illustrée ici.

Le schéma de fragmentation prédit pour le peptoïde est illustré ici, où le proton dans le cercle pointillé indique le proton mobile qui induirait la fragmentation peptoïde pendant l’expérience CID. Si la fragmentation se produit à toutes les liaisons amides disponibles, un total de huit fragments n-terminaux et huit fragments C-terminaux se formeront. À titre d’exemple, les structures et les valeurs de charge principale correspondantes de l’ion B4 et de l’ion Y5 sont illustrées ici.

Les valeurs de charge principale calculées de tous les ions de fragment de V1 à V8 et de Y1 à Y8 sont répertoriées ici. Le spectre de masse complet de balayage de l’ion peptoïde protéiné montre un pic à M/Z 1265 correspondant à l’espèce protéinée et un pic à M/Z 1287 correspondant à l’adaptation de l’ion sodium du peptoïde. Les deux pics à M/Z 633 et 644 correspondent respectivement à des peptoïdes sodiés doublement protéinés et protéinés mixtes.

Le spectre MSMS peptoïde protéiné montre un pic à M/Z 1265 correspondant à l’espèce protéinée et culmine à des valeurs de masse à charge plus faibles correspondant aux ions fragment de l’ion peptoïde. Une fois maîtrisée, la technique de synthèse peut être réalisée en un à deux jours et la technique de spectrométrie de masse peut être réalisée en une à deux heures, si elles sont réalisées correctement. Lors de la tentative de spectrométrie de masse, il est important de vérifier les performances de l’instrument.

Si nécessaire, on peut effectuer un auto-tune de l’instrument. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la modélisation Milk-in peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les confirmations possibles qu’un peptoïde pourrait adapter. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les techniques avancées de spectrométrie de masse et la caractérisation structurelle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse manuelle de peptoïdes et de l’analyse d’une séquence de monomères à l’aide de techniques de spectrométrie de masse. N’oubliez pas que travailler avec des produits chimiques peut être extrêmement dangereux et qu’un équipement de protection individuelle doit toujours être utilisé lors de cette procédure.