Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Ce protocole illustre les étapes consécutives importantes nécessaires pour évaluer la pertinence de la surveillance des paramètres de vitalité et des processus de réparation de l’ADN dans la relance des spores de Bacillus subtilis après traitement par plasma basse pression par suivi réparation de l’ADN marquées fluorescence protéines par microscopie confocale résolue dans le temps et la microscopie électronique à balayage.

L’objectif global de cet ensemble de méthodes consécutives est de visualiser et de surveiller les paramètres de vitalité dans la réparation de l’ADN chez les spores de Bacillus subtilis après un traitement au plasma à basse pression à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence résolue en temps et de la microscopie électronique à balayage. Notre méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inactivation microbienne et de la stérilisation. Il nous aide à analyser l’effet néfaste du traitement au plasma à basse pression sur des indicateurs biologiques tels que les spores de Bacillus subtilis.

Le principal avantage de notre technique est que nous combinons plusieurs méthodes de détermination de vue, de microscopie électronique à balayage et de surveillance de la réparation de l’ADN à l’aide de la microscopie à fluorescence à résultat temporel afin de vérifier l’effet néfaste du traitement au plasma à basse pression. Pour effectuer la production de spores, transférez une culture nocturne de cinq millilitres de la souche respective de B. subtilis complétée par des antibiotiques appropriés dans 200 millilitres de milieu de sporulation liquide à double concentration et cultivez-la avec une aération vigoureuse à 37 degrés Celsius pendant au moins 72 heures ou plus jusqu’à ce que plus de 95 % de la culture ait été sporéée. Récolter les spores dans des tubes de 15 millilitres par centrifugation à 3000 G pendant 15 minutes et purifier les échantillons à l’aide de H2O distillé stérile en plusieurs lavages.

Vérifiez la pureté et l’état de germination par miscroscopie de contraste facial et assurez-vous que les suspensions de spores sont composées de plus de 99 % de spores brillantes en phase et sont exemptes de cellules végétatives, de spores germées et de débris cellulaires, sinon d’autres expériences de microscopie peuvent être perturbées. Déterminer le titre de spores en plaquant 50 microlitres de dilutions en série dix fois sur de la gélose LB pour calculer les UFC et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la détermination de l’UFC, ajuster l’échantillon à 10 à 9 spores par millilitre en concentrant ou en utilisant de l’eau stérile pour diluer les échantillons.

Placez un support d’échantillon sous la forme de lames microscopiques stérilisées ou de lamelles rondes de 25 millimètres à l’intérieur de l’unité de pulvérisation d’aérosol à commande électrique, dans l’alignement de la buse. Transférez la culture de spores à l’entrée du liquide de la buse et lancez la pulvérisation à 0,15 seconde avec une pression de 1,3 bar. La suspension de spores pulvérisée forme un film mince sur la lame microscopique qui sèche rapidement en quelques secondes pour former une monocouche de spores uniformément répartie.

Conservez les supports d’échantillons traités dans un récipient stérile à température ambiante. Pour nettoyer et réchauffer toutes les surfaces du système plasma, lancez le système à cinq pascals avec du plasma Argon à 500 watts pendant cinq minutes. Le prétraitement réduit l’adhérence des molécules de l’air ambiant telles que l’azote, l’oxygène et l’eau lors de la ventilation de la chambre.

Après avoir ventilé la chambre, placez soigneusement les échantillons sur des supports en verre au centre de la cuve du réacteur. Fermez la chambre et évacuez-la. Ensuite, utilisez le gaz de processus souhaité pour remplir la chambre et régulez la pression dans le système à cinq pascals.

Ensuite, démarrez le processus de plasma. Après le temps de traitement défini, coupez l’alimentation électrique et l’alimentation en gaz et ventilez soigneusement le système pour éviter de souffler les échantillons du porte-échantillon. Après la ventilation, prélevez les échantillons et conservez-les dans un récipient stérile.

Pour les témoins non traités au plasma, exposer les échantillons au vide uniquement en présence du gaz de procédé équivalent au temps de plasma appliqué le plus long. Préparez une solution d’acétate de polyvinyle à 10 % ou de PVA autoclavée et utilisez-en 500 microlitres pour couvrir soigneusement les supports d’échantillons. Après les avoir laissés sécher à l’air libre pendant quatre heures, utilisez une pince stérile pour enlever la couche de PVA séchée qui contient maintenant l’échantillon de spores et transférez-la dans un tube de réaction de 2 millilitres.

Ajoutez un millilitre d’eau stérile dans le tube et agitez-le pour dissoudre la couche de PVA afin de récupérer plus de 95 % des spores capables de germer. Utilisez de l’eau stérile pour diluer l’échantillon en série de un à 10 dans une plaque à 96 puits. Après avoir plaqué 50 microlitres de chaque dilution sur de la gélose LB et incubé à 37 degrés Celsius pendant la nuit, comptez le nombre de colonies et déterminez les UFC par millilitre.

Pour les expériences de germination, préparez un tampon gélosé d’un millimètre d’épaisseur en faisant bouillir 700 microlitres de milieu et en le pipetant dans une boîte de microscopie stérile. Après 10 minutes, utilisez un scalpel stérile pour découper une gélose de huit millimètres sur huit millimètres sur un millimètre LB, et transférez soigneusement la gélose sur les monocouches de spores qui reposent sur des lamelles de verre de 25 millimètres déjà montées dans une chambre d’imagerie. La méthode de la gélose put combine deux fonctions spécifiques.

Il stabilise les échantillons dans le plan optique pendant la microscopie laser et limite le mouvement latéral des cellules. En plus de l’utiliser pour des essais de germination, cette méthode peut être appliquée à d’autres micro-organismes ainsi qu’aux cellules eucaryotes. Après avoir recouvert l’échantillon d’agar, transférez rapidement la lamelle en verre dans une chambre d’imagerie.

Maintenez l’échantillon à 37 degrés Celsius sur une platine chauffée pendant tout le processus d’imagerie. Utilisez au moins trois répétitions biologiques pour chaque condition. Après l’imagerie des échantillons par balayage laser confocal automatisé et microscopie à champ clair, enregistrez des séries en accéléré avec une puissance laser de 2,6 % et réglez l’ouverture confocale sur cinq unités aer et une fréquence d’échantillonnage d’une image toutes les 30 secondes de zéro à cinq heures selon l’expérience.

L’application de fortes doses de lumière monochromatique peut inhiber complètement la germination des spores pendant la microscopie laser. Par conséquent, utilisez l’intensité du laser et des intervalles plus longs pour obtenir des images uniques. En cas d’agrégation de spores, de distribution de spores multicouches ou de contamination par des particules de poussière, un blocage du traitement au plasma ou un ombrage peut se produire et permettre la germination des spores ombrées.

Pour effectuer la microscopie électronique à balayage, une fois que les monocouches de spores ont été codées par pulvérisation avec de l’or et du palladium, imagez les échantillons avec le MEB à émission de champ fonctionnant à une tension d’accélération de cinq kilovolts, y compris un détecteur d’électrons secondaires dans l’eau intérieure, pour révéler le contraste de la topographie. Comme le montre ce graphique, le traitement plasmatique des spores de B. subtilis entraîne une diminution de la survie avec l’augmentation de la durée du traitement plasmatique. Ces images MEB révèlent des structures longitudinales caractéristiques en forme de crêtes, qui sont constamment visibles dans toutes les spores traitées et non traitées.

Le traitement au plasma jusqu’à 30 secondes n’induit aucun changement significatif de la morphologie de la surface des spores par rapport aux témoins. L’augmentation de la durée du traitement au plasma conduit à une surface plus granulaire et de petites fissures et fissures peuvent être observées dans les spores traitées pendant 120 ou 240 secondes. Dans ces expériences de microscopie confocale à balayage laser résolues dans le temps, presque toutes les spores traitées sous vide comme contrôle germent et développent une morphologie cellulaire en forme de bâtonnet avec une longueur plutôt uniforme de cellules individuelles.

En revanche, les spores traitées pendant 15 secondes avec du plasma présentent déjà une capacité de germination réduite de moins de 75 plus ou moins quatre pour cent. De plus, les cellules se développent soit en bâtonnets très longs, soit restent petites et se collent dans l’enveloppe des spores. Après 30 secondes de traitement au plasma, seulement 25 plus ou moins six pour cent des spores germent et les cellules végétatives sont nettement retardées dans leur croissance et varient en longueur.

Lors de cette procédure, il est important de confirmer la qualité des monocouches de spores à l’aide de la microscopie à contraste de phase afin de s’assurer qu’il n’y a pas de spores qui se chevauchent ou qui germent. Après son développement, la méthode de la gélose pour la stabilisation d’image a ouvert la voie aux chercheurs en stérilisation du plasma et en microscopie à cellules vivantes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une meilleure compréhension de la préparation des monocouches de spores sur des lames de verre, de la détermination de l’utilisation à l’aide de traitements au plasma pour l’inactivation des spores et de la microscopie électronique à cellules vivantes et à balayage.

Contrairement à d’autres méthodes de décontamination, par exemple l’oxyde d’éthylène ou les rayons gamma, la stérilisation au plasma est une approche efficace et sûre pour réduire un certain nombre de micro-organismes indésirables sur presque tous les types de surfaces.