Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

L’objectif global de cette procédure est de générer une mosaïque génétique dans le cortex cérébral de la souris en induisant une recombinaison Cre-Lox par électroporation in utero. Cette méthode de génération de mosaïques génétiques peut aider à répondre à des questions clés en neurobiologie. Par exemple, déterminer si un gène est nécessaire pour un phénotype neuronal donné de manière autonome cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est que le système de recombinaison Cre-Lox efficace est combiné à une technique tout aussi efficace de délivrance de gènes par électroporation utérine. Bien que cette méthode soit axée sur le ciblage des neurones corticaux des couches deux à trois, elle peut être utilisée pour cibler les neurones dans d’autres couches corticales profondes. Lorsque nous avons essayé de faire des mosaïques génétiques dans notre tissu cérébral, nous avons rencontré plusieurs problèmes pour faire survivre nos animaux de laboratoire après la naissance, nous avons donc introduit plusieurs simplifications et raffinements à notre technique.

Préparez une pipette avec un cône très long et une pointe très fine, typique des pipettes pour l’injection de cellules souches embryonnaires ou le transfert nucléaire, en insérant d’abord le capillaire en verre dans l’extracteur de pipette. Après avoir fixé les pinces, activez le programme de protocole de traction, créant un cône sur le capillaire en verre. Assurez-vous que la longueur du cône est comprise entre 10 et 15 mm à l’aide d’un microscope à lumière composée.

Ensuite, pour casser l’extrémité de la pipette, centrez une brosse monocouche sur un bécher de 50 ml et étirez-la tendue d’une main. De l’autre main, poussez la pipette tirée, côté cône vers le bas, perpendiculairement au centre de la lingette, provoquant une rupture nette de la lingette. Vérifiez la taille de l’ouverture à l’aide d’un microscope optique composé.

Ensuite, calibrez la pipette en aspirant 1 mcL de bleu de trypan à 0,4 % et de PBS dans une pipette partiellement remplie et graduez la pipette avec des repères de 1 mcL en fonction de la hauteur de 1 mcL dans la pipette. Utilisez la pipette calibrée pour graduer les autres pipettes tirées avant de les jeter. Placez les pipettes dans le porte-pipette à l’abri de la poussière et d’autres particules.

Après avoir anesthésié profondément une souris enceinte à E-15.5, testez le réflexe de redressement en inclinant doucement la chambre d’induction et en notant la réponse de la souris. Si le réflexe de redressement est absent, transférez la souris dans la zone de préparation chirurgicale et administrez de l’isoflurane inhalé à travers un cône nasal pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie. Utilisez une pince pour tester le réflexe de la pédale afin de vérifier l’anesthésie.

Surveillez la fréquence respiratoire à l’effort, en recherchant une respiration profonde et régulière et que les muqueuses sont de couleur rose et humides. Appliquez suffisamment de pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour les couvrir complètement et les protéger contre le dessèchement. Massez la crème dépilatoire sur la région abdominale à l’aide de cotons-tiges jusqu’à ce que la fourrure abdominale se dissolve.

Nettoyez soigneusement tout résidu restant et la crème dépilatoire avec de l’éthanol à 70 % et des cotons-tiges. Appliquez une solution de gommage à base d’iode sur la région abdominale dans un mouvement circulaire.

Utilisez ensuite un champ chirurgical pour isoler la zone chirurgicale et maintenir des conditions stériles. Après avoir pratiqué une incision ventrale de 2 cm sur la ligne médiane de la peau, trouvez la ligne blanche pour visualiser la ligne médiane du droit de l’abdomen. Tirez le muscle vers le haut et loin de l’abdomen et faites une incision médiane de 2 cm pour exposer la cavité abdominale à l’aide de techniques aseptiques.

À l’aide d’une pointe de micropipette stérile de 10 mcL, versez du carprofène dans la cavité abdominale pour l’analgésie. Ensuite, pincez une pince à moustiques Hartmann sur le bord gauche de l’incision du droit de l’abdomen. Posez la pince sur la boîte de Pétri renversée à gauche de l’incision, en gardant le côté gauche de l’incision ouvert.

Après avoir serré le côté droit de l’incision de la même manière, placez une éponge de gaze autour de la zone de l’incision. À l’aide d’une pince à anneau sans vis de fin de course attachée, tirez sur l’utérus entre deux embryons voisins sans écraser ni blesser aucun tissu. Commencez à retirer tous les embryons par l’incision, en les posant sur l’éponge de gaze.

Connectez une pipette calibrée à l’ensemble du tube de l’aspirateur et injectez exactement 1 mcL de solution d’ADN préparée à travers la paroi utérine dans un ventricule latéral de chaque embryon. Utilisez le pouce et l’index pour manipuler les embryons, ce qui permet aux embryons d’être poussés doucement contre la paroi utérine lors de l’injection. Les ventricules latéraux apparaissent comme deux taches plus foncées sur le télencéphale dorsal de l’embryon.

Confirmez la réussite de l’injection en observant que le bleu de Trypan remplit le ventricule latéral. Après avoir injecté tous les embryons, placez la cathode d’électrodes de type pince à épiler sur l’utérus, directement sur le cortex médial et caudal pour cibler le cortex visuel. Placez l’anode juste en dessous et en avant de la tête de l’embryon.

Avec la pédale, déclenchez la délivrance d’impulsions de 550 ms de 50 volts séparées par un intervalle de 950 ms. Après avoir électroporé tous les embryons, renvoyez l’utérus dans la cavité abdominale dans la même orientation que celle dans laquelle il a été trouvé. Utilisez une solution saline pour lubrifier l’utérus tout en le guidant manuellement et extrêmement doucement, en prenant soin de ne pas déplacer les embryons de leur position dans l’utérus.

Fermez les muscles abdominaux avec des sutures résorbables. Utilisez un simple point interrompu, en attachant les extrémités avec un nœud de chirurgien. Fermez la couche cutanée avec des sutures résorbables.

Appliquez une petite quantité d’adhésif tissulaire pour sceller la plaie. Appliquez de l’adhésif tissulaire sur les nœuds pour éviter qu’ils ne se détachent. À l’aide d’une micropipette, vous pouvez retirer tout tissu adhésif entourant la plaie qui peut être aspiré.

Une fois que l’adhésif du tissu est sec, retirez l’animal de l’isoflurane et laissez la femelle se rétablir seule dans une cage chaude. Continuez à surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie et qu’elle se comporte normalement. Une fois retirée, remettez la femelle dans la cage avec le mâle.

Placez le crâne sur une surface plane avec des lingettes de travail monocouches humidifiées avec 1-x PBS. À l’aide d’une pince à épiler, retirez d’abord l’os occipital. Ensuite, retirez soigneusement les os pariétaux, en retirant la pince à épiler et en l’éloignant de la surface du cerveau.

Retirez soigneusement toutes les méninges pour éviter d’endommager le cortex. Calez l’arrière de la pince à épiler sous le cerveau le long du crâne pour sectionner les nerfs crâniens et retirer le cerveau. À l’aide d’une lame de rasoir à un seul tranchant, faites une coupe coronale d’environ 0,5 mm rostrale à bregma, et une autre coupe coronale d’environ 0,5 mm caudale au tissu d’intérêt.

Le bloc tissulaire est maintenant prêt pour la section. L’injection de 1 mcL de 2 mg/mL de GFP Cre entraîne une distribution clairsemée de cellules marquées, dont certaines peuvent être brillantes. Parce que le tissu est sectionné à 100 microns, la plupart des arborescences dendritiques sont préservées.

Lorsque l’électroporation in utero est effectuée au 15e jour embryonnaire, le marquage se produit sur les couches corticales deux et trois. Les épines dendritiques peuvent être observées à de forts grossissements. L’injection de 1,5 mcL de 2 mg/mL de GFP Cre entraîne un marquage très dense, qui peut être sous-optimal car il est difficile de suivre la source des neurites et des épines dendritiques.

Cependant, en sélectionnant une cellule brillante à la périphérie de la zone marquée, il est toujours possible d’imager un neurone et ses processus. Alternativement, l’injection de constructions SuperNova entraîne une distribution clairsemée de neurones de couche deux-trois qui sont très clairement marqués. Une fois maîtrisée, la chirurgie d’électroporation in utero prendra moins de 30 minutes si elle est effectuée correctement.

Tout en essayant cette procédure avec d’autres constructions d’ADN, il est important de se rappeler d’essayer différentes concentrations et volumes, cela aidera à obtenir la rareté souhaitée du marquage nécessaire à l’analyse de la mosaïque. Nos résultats représentatifs ont utilisé soit une seule construction, soit une construction SuperNova récemment inventée. Dans ce dernier, nous avons constaté que nous pouvions obtenir un excellent marquage clairsemé, tout en maximisant la luminosité des neurones.

Cette technique pourrait être adaptée pour créer du tissu cérébral en mosaïque d’autres manières. Par exemple, l’édition de gènes CRISPR et Cas9 peut être combinée à l’électroporation in utero, ou la recombinaison Cre-Lox peut être associée à l’injection intraventriculaire de vecteurs viraux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de plusieurs techniques simplifiées et raffinées utilisées pour obtenir une mosaïque génétique clairsemée, afin que vous puissiez combiner la recombinaison Cre-Lox et l’électroporation in utero.

Nous vous souhaitons la meilleure des chances.