Un test Simple Immunofluorescence sur les cellules pour détecter des auto-anticorps contre le récepteur N-méthyl-D-Aspartate (NMDA) dans le sang

L’objectif global de ce test est de détecter les auto-anticorps dirigés contre le récepteur NMDA dans le sang de patients suspectés d’encéphalite auto-immune. La mesure aide à répondre aux questions clés du diagnostic différentiel des patients présentant des symptômes neuropsychiatriques aigus. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une mesure de dépistage simple et fiable.

Commencez cette procédure en préparant des plaques de culture enrobées de gélatine. Aliquote 200 microlitres d’une solution de gélatine à 2 % dans chaque puits d’une plaque de culture à 48 puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après 30 minutes, aspirez la solution de gélatine des puits.

Ensemencer dans chaque puits 5 fois 10 à la 4ème cellule HEK293 dans 200 microlitres de milieu de culture cellulaire, contenant 10 % de FBS. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié alimenté à 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu de culture usagé dans chaque puits par 200 microlitres de milieu de culture frais, contenant 10 % de FBS.

En augmentant la mise à l’échelle en fonction du nombre total de puits dans l’expérience, préparez la solution A en mélangeant le plasmide NR1-GFP avec un milieu de culture. Préparez la solution B en mélangeant le réactif de transfection avec le milieu de culture. Préparez la solution C en mélangeant la solution A et la solution B et en incubant le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 minutes.

Ensuite, aliquote 40 microlitres de solution C dans chaque puits contenant les cellules HEK293. Faites tourner doucement la plaque et incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié alimenté à 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Vérifiez l’expression de la protéine recombinante NR1-GFP dans les cellules hôtes au microscope fluorescent avec un grossissement de 40 à 200 fois, avant de passer au test d’immunofluorescence cellulaire.

Pour commencer ce test, aspirez d’abord le milieu usé des puits de la plaque de culture, puis lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBS trois fois. Ajoutez 200 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Aspirez la solution de paraformaldéhyde des puits et lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBS trois fois.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de lait écrémé à 10 % dans une solution PBST dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante en secouant doucement pendant une heure. Aspirez le lait écrémé à 10 % dans la solution PBST des puits et lavez les puits avec 200 microlitres de PBST une fois. Incuber les puits avec du plasma dilué de un à 100 dans du PBST comme anticorps primaire, en agitant doucement à température ambiante pendant une heure.

Au bout d’une heure, aspirez le plasma dilué des puits et lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBST trois fois. Dans chaque puits, ajoutez 200 microlitres d’IgG anti-humains de chèvre, conjugués à Alexa Fluor 594 et incubez la plaque de culture à température ambiante en secouant doucement pendant une heure. Ensuite, aspirez les IgG anti-humaines de chèvre conjuguées à la solution Alexa Fluor 594 et lavez chaque puits avec 200 microlitres de PBST trois fois.

Après le troisième lavage PBST, ajoutez 100 microlitres de solution de glycérol, contenant du DAPI, dans chaque puits. Observez et imagez les cellules au microscope fluorescent à l’aide du bon filtre pour chaque colorant et d’un oculaire 10 fois avec des objectifs 4, 10 fois et 20 fois. Ces images représentatives, prises 24 à 30 heures après la transfection, montrent des cellules HEK293 qui expriment NR1-GFP.

Environ 30 % des cellules avaient le signal vert sous le microscope fluorescent. Dans les images Alexa Fluor 594 correspondantes, le signal rouge dans le panneau B indique la liaison des auto-anticorps du récepteur anti-NMDA au NR1 exprimé dans les cellules HEK293. Le faible signal rouge dans le panneau E indique le bruit de fond des images Alexa Fluor 594.

Les cellules exprimant NR1-GFP ont été utilisées pour dépister la présence d’auto-anticorps anti-récepteurs NMDA dans un échantillon de plasma humain. Dans ces images fusionnées, la couleur jaune indique la colocalisation des auto-anticorps NR1-GFP et anti-récepteur NMDA. Les flèches indiquent des exemples de cellules avec une colocalisation importante.

Un échantillon de plasma qui montre un chevauchement supérieur à 30 % des signaux vert et rouge sera interprété comme positif dans ce cas. Dans l’image fusionnée du témoin négatif, il y a peu de chevauchement des signaux vert et rouge, ce qui confirme la liaison spécifique des auto-anticorps du récepteur anti-NMDA à la NR1-GFP dans le test. Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous essayez cette technique, il est important de se rappeler qu’il ne s’agit que d’une mesure de dépistage. À la suite de ces procédures, d’autres mesures telles que l’analyse par transfert Western et l’analyse tissulaire peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la spécificité des cas positifs. Après son développement, la technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la psychiatrie pour explorer le diagnostic différentiel des patients souffrant d’une urgence aiguë de santé mentale.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le test de dépistage des auto-anticorps contre le récepteur NMDA dans le sang.