Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein

L’objectif global de cette procédure de laboratoire est de définir, quantifier et comparer simultanément l’hétérogénéité génétique intratumorale de HER2 dans une grande série de cancers du sein traités de manière hétérogène au moyen d’une hybridation in situ d’argent à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des choix clés de traduction et de recherche sur le cancer du sein, tels que l’étude de l’hétérogénéité de l’amplification du gène HER2, une grande cohorte de cas récupérés dans les archives de pathologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une schizoanalyse HER2 à haut débit dans différentes zones topographiques de cancers du sein multiples et traités de manière hétérogène.

En général, les personnes novices en matière d’hybridation in situ auront des difficultés car les études rétrospectives nécessitent généralement l’analyse d’échantillons d’archives qui ont subi différentes procédures de fixation, de traitement et de stockage. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons décidé de reclasser tous les cancers du sein de notre base de données institutionnelle depuis 2003. Giulia Ercoli, une technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.

Commencer ce protocole par la sélection des patients et des échantillons de tissus, comme décrit dans le protocole textuel. Créez et ouvrez un nouveau fichier de tableur, incorporant les enregistrements des différentes zones de chaque cas. Incluez des colonnes distinctes pour l’ID du cas, l’ID du bloc, l’ID de la zone, le type de tissu, la topographie, la morphologie, l’état des biomarqueurs et toutes les autres caractéristiques immunohistochimiques disponibles.

Créez un projet TMA. Définissez les blocs de destinataires PMA en accédant à fichier, nouveau, bloc. Cliquez sur le premier champ à remplir et saisissez les dimensions du bloc de paraffine.

Ensuite, créez un projet de matrice de tissus en accédant à fichier, nouveau, matrice de tissus. Cliquez sur l’icône d’importation, puis choisissez le fichier modèle du bloc de destinataire précédemment créé. Cliquez sur suivant.

Choisissez ensuite un millimètre comme taille de spot en cliquant sur le bouton rond. Choisissez 500 microns comme espacement des points, c’est-à-dire l’espace entre deux centres de points voisins. Cliquez ensuite sur l’icône de la calculatrice pour calculer le nombre total de spots créés, qui devrait être de 231.

Cliquez ensuite sur le bouton définir pour créer des grilles et des sous-grilles. Supprimez les colonnes huit et 15 ainsi que le cathéter central. Maintenez trois points de la première ligne pour l’orientation.

La carte finale devrait englober un nombre total de 183 endroits. Définissez la liste des types de tissus en accédant à fichier, nouveau, liste des types de tissus. Définissez ensuite le projet en accédant à fichier, nouveau, projet booster.

Préparez ensuite les blocs d’accepteur. Remplissez les moules métalliques nettoyés avec de la paraffine élastique à 65 degrés Celsius. Laissez refroidir les blocs de paraffine à la température du film pendant la nuit à l’intérieur des moules métalliques.

Le lendemain, extrayez les blocs de paraffine des moules métalliques. Construisez le TMA à l’aide d’un arrayer automatisé ou semi-automatisé en allumant d’abord le arrayer, puis en insérant les blocs d’acceptation sur le carrousel arrayer. Définissez la position de départ sur chaque bloc récepteur à l’aide des touches fléchées pour déplacer la lumière laser et l’aligner avec le bord supérieur gauche sur la paraffine du bloc récepteur.

Cliquez sur suivant et répétez l’opération pour l’alignement vertical. Cliquez à nouveau sur Suivant pour créer automatiquement un trou dans la coordonnée précédemment définie du bloc récepteur. Videz le poinçon.

Positionnez le bloc donneur pour l’échantillonnage et retirez une carotte de tissu de la zone d’intérêt précédemment annotée. Insérez le noyau de tissu du donneur dans le trou du bloc receveur. Retirez ensuite le bloc donneur du arrayer.

Répétez ces étapes jusqu’à ce que l’AMT soit terminée. Placez le côté tissu du bloc TMA nouvellement généré sur une lame vierge stérile et placez-les dans le four du laboratoire à 45 degrés Celsius pendant cinq minutes. Appuyez doucement sur le bloc sur la lame pendant cinq secondes pour aplatir les noyaux de tissus.

Répétez l’opération une fois pour un total de deux fois. Ensuite, couvrez la surface du tissu TMA avec une fine couche de paraffine élastique à 65 degrés Celsius. Laissez le bloc TMA à température ambiante pendant deux heures.

Enfin, transférez le bloc TMA à quatre degrés Celsius pendant 24 heures avant d’effectuer les analyses histochimiques et immunohistochimiques décrites dans le protocole textuel. Placez les lames TMA à analyser à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Démarrez ensuite l’instrument et le logiciel de l’immunomarqueur.

Dans la vue d’accueil, cliquez sur le bouton Protocoles, puis sur Créer/Modifier des protocoles. Sélectionnez la procédure de cocktail ISH double pour modifier le modèle de base. Marquez la cuisson dans la liste des cases et réglez la température à 63 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Signalez ensuite la déparaffinisation. Flag suivant conditionnement des cellules dans la liste des boîtes. Signalez ensuite le conditionnement cellulaire CC2 et réglez la température à 86 degrés Celsius et le temps d’incubation à quatre minutes.

Flag CC2 léger pendant huit minutes, standard pendant 12 minutes et prolongé pendant huit minutes. Marquez ISH-Protease trois dans la liste des cases et réglez le temps d’incubation à 16 minutes. Sélectionnez le dinitrophényle HER2 et la digoxigénine du chromosome 17 de la sonde.

Incuber pendant 16 minutes, puis régler la dénaturation pendant 20 minutes à 80 degrés Celsius. Réglez le temps d’incubation de la sonde à six heures. Réglez ensuite le temps d’incubation du multimère SISH à 32 minutes.

Réglez le chromate d’argent et le temps d’incubation à quatre minutes. Réglez ensuite le temps d’incubation du multimère rouge à 24 minutes. Réglez le chromate rouge et le temps d’incubation à huit minutes.

Signalez ensuite la contre-coloration dans la liste des cases, sélectionnez l’hématoxyline deux et réglez le temps d’incubation à huit minutes. Marquez la contre-coloration dans la liste des cases, sélectionnez le réactif de bleuissement et réglez le temps d’incubation à quatre minutes. Enfin, effectuez une schizoanalyse pour HER2.

Évaluer l’amplification du gène HER2 comme positive si le rapport de la sonde d’énumération du chromosome HER2 17 est supérieur ou égal à 2,0 et qu’un nombre moyen de copies de HER2 est supérieur ou égal à 4,0 signaux par cellule. Évaluer comme négatif si le rapport de la sonde de dénombrement du chromosome HER2 17 est inférieur à 2,0 avec un nombre moyen de copies HER2 inférieur à 4,0 signaux par cellule. Voici des micrographies représentatives montrant l’analyse d’hybridation in situ de l’argent d’un cancer du sein hétérogène HER2.

Dans cet exemple paradigmatique, deux zones distinctes de cancer du sein invasif de haut grade sans type particulier montrent des résultats différents en termes d’amplification du gène HER2, visualisée par des points noirs, par rapport à la sonde de dénombrement centromérique 17, visualisée par des points rouges. En particulier, une zone appartenant au noyau tumoral et montrant un motif de coloration irrégulier de la cytokératine sept était amplifiée HER2, tandis qu’un seul point devant le front invasif présentait un motif HER2 de type sauvage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une schizoanalyse lisible de réseaux marqués de tissus incorporant plusieurs cancers du sein traités de manière hétérogène.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours ouvrés à compter de la sélection du cas. Bien que cette méthode soit optimisée pour le cancer du sein, elle peut être transposée à d’autres types de cancer dans lesquels l’hétérogénéité HER2 est d’une importance cruciale, comme le cancer gastrique. Les implications de cette technique s’étendent à la simple évaluation de HER2, car elle est conçue pour la cartographie complète de plusieurs zones topographiques dans de grandes séries de cancers du sein.

Lors de cette procédure, il est important d’éviter toute fissure sur le bloc TMA. Même une fissure minime dans la paraffine déduit la qualité, la reproductibilité et la clarté globale de l’hybridation in situ. Suite à cette procédure, une imagerie par spectrométrie de masse MALDI peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires sur la protéomique du cancer du sein, notamment en termes d’hétérogénéité intra et inter-tumorale.

N’oubliez pas que travailler avec des poinçons TMA et de la cire de paraffine chaude peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants en nitrile jetables doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.