Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

L’objectif global de ce système d’expression protéique induit par le choc thermique est d’évaluer l’activité anti-apoptotique des protéines dans deux protéines potentiellement antagonistes fonctionnellement dans les cellules d’insectes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les fonctions et les activités des protéines candidates en biotechnologie et en protéomique, telles que leurs activités anti-apoptotiques et leurs interactions protéiques. Le principal avantage de cette technique est que le moment de l’expression des gènes est contrôlé par l’induction d’un choc thermique.

Cette méthode peut donc fournir un aperçu de l’état fonctionnel des protéines. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que l’expression des protéines de mammifères. Les cellules d’insectes Spodoptera frugiperda, ou Sf9, utilisées dans ce protocole sont cultivées dans un milieu de culture cellulaire dans des flacons de culture cellulaire de 25 centimètres carrés à 28 degrés Celsius.

Agitez le ballon de culture cellulaire pour détacher les cellules du ballon. Vérifiez ensuite au microscope optique qu’environ 80 % des cellules sont détachées. Transférez 50 % de la suspension cellulaire dans un nouveau flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés et laissez les cellules se fixer à température ambiante pendant 15 minutes.

Après 15 minutes, remplacez le milieu par cinq millilitres de milieu de culture frais et cultivez-le dans un incubateur à 28 degrés Celsius. En fonction de la croissance cellulaire, passez les cellules tous les deux à trois jours. Avant de récolter les cellules Sf9, il est important de vérifier les cellules au microscope optique pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination par des bactéries ou d’autres micro-organismes.

Pour récolter les cellules Sf9, secouez le ballon de culture pour détacher les cellules, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. À l’aide d’une pipette P10, transférez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un hémacytomètre et comptez le nombre de cellules au microscope optique. Plaquez trois fois 10 à la cinquième cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et laissez à température ambiante pendant 15 minutes.

Après 15 minutes, remplacez le milieu par 0,5 millilitre de milieu de placage. Préparez le régent de transfection cellulaire. Pour chaque transfection, diluez huit microlitres de réactif de transfection cellulaire avec 100 microlitres de milieu de culture cellulaire sans sérum, et mélangez pendant une seconde.

Dans cette étude, trois troncatures différentes du gène baculoviral, inhibiteur de l’apoptose 3, ou IAP3, seront exprimées sous le contrôle du promoteur du choc thermique 70 de la drosophile, de l’IAP3 pleine longueur, d’une troncature dépourvue du domaine RING et d’une troncature dépourvue du domaine BIR. Ajoutez deux microgrammes de chaque ADN plasmidique dans 100 microlitres de milieu de culture cellulaire sans sérum et mélangez par vortex pendant une seconde. Préparez également un contrôle positif.

Combinez l’ADN plasmidique dilué et le réactif de transfection cellulaire dilué, et mélangez par vortex. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. À l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 210 microlitres de chaque mélange de réactifs de transfection d’ADN goutte à goutte sur les cellules.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant cinq heures. Après cinq heures, remplacez le milieu de placage par 0,5 millilitre de milieu de culture cellulaire, puis scellez la plaque à 24 puits avec du ruban adhésif. Incuber à 28 degrés.

Le lendemain, un choc thermique permet d’induire l’expression des protéines en faisant flotter la plaque dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, remettez la plaque à 24 puits dans l’incubateur à 28 degrés Celsius. L’expression de la protéine est ensuite confirmée par Western blot comme décrit dans le protocole textuel.

Pour examiner l’apoptose cellulaire induite par les gènes, préparez d’abord les cellules Sf9 comme démontré précédemment. Ensuite, transfectez les cellules de la même manière que précédemment, mais incluez un microgramme d’un plasmide contenant un gène inducteur d’apoptose dans chaque réaction de transfection. Incuber à 28 degrés Celsius pendant cinq heures, remplacer le milieu et incuber pendant 16 heures.

Électrocutez les cellules transfectées à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius pendant cinq heures avant d’effectuer le test de viabilité cellulaire. Pour l’apoptose cellulaire induite par des produits chimiques, plaquez une fois 10 aux six cellules Sf9 dans chaque puits d’une plaque à six puits.

Laisser à température ambiante pendant 15 minutes, puis remplacer le milieu par un millilitre de milieu de placage. Transfectez les cellules avec quatre microgrammes de chaque ADN plasmidique. Après cinq heures, remplacez le milieu de placage par un millilitre de milieu de culture cellulaire et incubez les cellules à 28 degrés Celsius pendant 16 heures.

Puis choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incuber les cellules à 28 degrés Celsius pendant cinq heures après le choc thermique. Traitez ensuite les cellules transfectées avec de l’actinomycine D pour induire l’apoptose.

Incuber à 28 degrés Celsius pendant 16 heures avant d’effectuer le test de viabilité cellulaire. Commencez cette procédure en lavant les cellules traitées. Retirez le milieu de chaque puits, ajoutez un millilitre de PBS et laissez reposer une minute.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS de cette manière. Remettez les cellules en suspension dans chaque puits avec un millilitre de PBS contenant 04 % de bleu de trypan et colorez à température ambiante pendant trois minutes. Transférez la suspension cellulaire dans un tube microfuge de 1,5 millilitre.

Transférez 10 microlitres de suspension de cellules colorées au bleu de trypan dans un hémacytomètre et comptez les cellules intactes viables au microscope optique. Enfin, effectuez l’analyse statistique décrite dans le protocole texte. La totalité de la suspension et les deux troncatures d’IAP3 de Lymantria xylina MNPV ont été surexprimées dans les cellules Sf9, et le Western blot a été effectué sur les lysats cellulaires pour confirmer l’expression de la protéine.

La protéine anti-apoptotique Ac-P35 a été incluse comme témoin positif. Toutes les protéines ont pu être détectées dans les cellules transfectées une heure ou cinq heures après le choc thermique, avec une expression plus élevée à cinq heures. Ce système peut être adapté pour évaluer l’activité anti-apoptotique.

Pour l’apoptose cellulaire induite par les gènes, l’inducteur de l’apoptose Drosophila Reaper a été co-transfecté avec les constructions plasmidiques du gène cible dans les cellules Sf9, qui ont ensuite été choquées thermiquement pour activer l’expression génique. Par rapport au vecteur Drosophila Reaper, le témoin positif a montré une activité anti-apoptotique élevée, atteignant jusqu’à 80 % du taux de viabilité. Les autres constructions ont montré divers effets sur l’activité anti-apoptotique.

Pour l’apoptose cellulaire induite par des produits chimiques, une seule construction a été transfectée dans les cellules Sf9, et l’actinomycine D a été ajoutée cinq heures après le choc thermique. Par rapport au contrôle positif ou au contrôle négatif, les autres constructions ont montré divers effets sur l’activité anti-apoptotique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois jours si elle est bien exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de respecter les règles de fonctionnement de la culture cellulaire en flux laminaire et de vérifier l’état des cellules avec diligence. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la co-immunoprécipitation, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme s’il existe une interaction entre les deux protéines co-exprimées dans les cellules d’insectes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biotechnologie pour explorer les fonctions des protéines chez les animaux ou les micro-organismes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce système pour exprimer des protéines étrangères ou évaluer des protéines potentiellement antagonistes fonctionnellement dans les cellules d’insectes. N’oubliez pas que travailler avec certains produits chimiques, comme l’actinomycine D, peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de cette procédure.