Name: Un modèle murin de la chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction Cognitive postopératoire et régénération des tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez un modèle murin de chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction cognitive postopératoire et la régénération tissulaire chez la souris âgée par parabiose.

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Nous remercions Kathy Gage, BS (département d’anesthésiologie, centre de médecine de Duke University, Durham, Caroline du Nord) pour l’aide à la rédaction. NT reconnaît le soutien d’une subvention de l’Innovation de rêve de Duke anesthésiologie et NIH/NIA R01 AG057525-01.

Toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par l’animalier institutionnel & utilisation Comité (IACUC) à l’Université Duke.
1. des animaux
<ol><li>Garder la souris dans un environnement climatisé avec cycles de lumière/obscurité de 12 h et à un accès satisfaisant à l’eau et de nourriture standard. Maison de même pas plus de 5 portée par cage et éviter les conditions qui pourraient encourager les combats.</li>
	<li>Utilisez souris C57BL6/J les femelles à l’âge (jeune) de 3 mois ou 18 mois d’âge (vieux).</li>
	<li>Pour parabiose, acclimater 2 souris ensemble pour au moins deux semaines avant la chirurgie. Les souris sont sauvage C57BL6/J ou eGFP +.</li>
	<li>Vérifier la condition corporelle et l’aspect global de souris tous les jours.</li>
</ol>2. préopératoire Setup pour parabiose et chirurgie orthopédique
<ol><li>Peser les 2 souris.</li>
	<li>Administrer une anesthésie générale via un système d’anesthésie à un constante O2 débit de 0,2 L/min. utilisation 5 % isoflurane pour l’induction dans une chambre à induction. NOTE : La profondeur de l’anesthésie peut être confirmée à l’aide d’une pincée d’orteil.</li>
	<li>Placez les souris sur un coussin chauffant en position couchée. Utiliser une sonde rectale pour surveiller la température du corps tout au long de l’intervention chirurgicale.</li>
	<li>Pour maintenir l’anesthésie, abaisser la concentration inhalée d’isoflurane à 2,0 % à 0,2 L/min grâce à un masque facial. Moniteur pour assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie.</li>
	<li>Surveiller les paramètres physiologiques (rythme respiratoire, saturation en oxygène et le coeur battement) non invasive utilisant un pulse oxymètre (facultatif).</li>
</ol>3. parabiose chirurgie (protocole 1 a)
<ol><li>Administrer les analgésiques (buprénorphine, SR/slow release, 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée) après l’induction et avant toute manipulation chirurgicale. Injecter la bupivacaïne (0,25 %) aux flancs juste avant l’ouverture. Appliquer du lubrifiant oculaire. Remarque : Le protocole parabiose peut être effectué indépendamment de la fracture du tibia.</li>
	<li>Pour tout le corps interne suturer, utiliser le matériel de suture polydioxanone 4-0. Pour tous la suture externe, utiliser le matériel de suture en polypropylène de 4-0.</li>
	<li>Chacun des 2 souris suivant une ligne contiguë du coude, le flanc et le genou sur le côté pour être rejoint raser. Désinfecter avec de l’iode + gommage de peau alcool 70 % plus 3 en alternant les cycles en prévision de l’incision. Utilisaient des instruments stérilisés à l’autoclave et de maintenir un champ stérile. NOTE : Placez la souris sauvage vers la droite de la souris eGFP et préparer le flanc gauche de la souris sauvage et le flanc droit de la souris eGFP chirurgicaux (Figure 1).</li>
	<li>Sur chaque souris, utilisez un ciseau à pratiquer une incision de la peau le long du flanc, allant proximale du genou à proximale par rapport au coude et sans déranger les muscles sous la peau.</li>
	<li>Rejoignez les triceps des animaux avec 2 sutures interrompus.</li>
	<li>Rejoignez les parois du corps le long des flancs par une suture en cours d’exécution, continue de 7-9 passes.</li>
	<li>Rejoignez les quadriceps de l’animal avec 2 sutures interrompus.</li>
	<li>Fermer la peau des 2 parabionts avec sutures interrompus.</li>
	<li>Laissez les souris se réveiller dans l’air ambiant.</li>
	<li>Pour assurer le succès de ce protocole, la santé des paires doit être maintenue : surveiller les paires par jour ; effectuer le conditon, marquant deux fois par semaine ; et peser les paires deux fois par semaine. Remarque : Chaque paire est logé individuellement. Remarque : Si vous utilisez régulièrement buprénorphine (c’est à dire pas SR/slow release) puis administrer 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée dans 1 mL de solution saline par souris deux fois par jour pendant 3 jours.</li>
	<li>Permettre à 4 semaines de temps de récupération pour assurer la circulation partagée entre parabionts si vous effectuez une chirurgie de fracture du tibia.</li>
</ol>4. tibial Fracture chirurgie (protocole 1 b)
<ol><li>Administrer les analgésiques (buprénorphine, 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée) après l’induction et avant toute manipulation chirurgicale. Injecter la bupivacaïne (0,25 %) sur le site chirurgical proximal du genou juste avant l’ouverture. Appliquer du lubrifiant oculaire.</li>
	<li>Raser la face médiale du membre postérieur droit de la souris pour exposer la zone chirurgicale et désinfecter avec iode + gommage de peau alcool 70 % sur 3 en alternance de cycles. Maintenir un champ opératoire stérile tout au long de la procédure. Pour limiter la contamination ; utiliser des instruments stérilisés à l’autoclave et gants ; compléter la chirurgie sous un microscope à dissection (facultatif) ; et utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température du corps. Remarque : Si le protocole est effectué sur parabionts, seulement 1 souris est rompue à la paire (du tibia droit le droit de la souris). Voir Figure 1 b pour un diagramme schématique de la fracture sur parabionts.</li>
	<li>Utilisez les ciseaux pour faire une incision de la peau le long de la face médiale du membre postérieur droit proximal du genou jusqu'à la mi-diaphyse du tibia sur le droit de la souris.</li>
	<li>Exposer le mi-diaphyse du tibia et localiser visuellement la diaphyse. Fléchir le genou et visualiser le plateau tibial en utilisant le ligament patellaire-fémorale comme point de repère.</li>
	<li>Visualiser le tendon rotulien ; Percer manuellement en faisant rouler le pouce et l’index un trou de 0,5 mm dans le canal intramédullaire à l’aide d’une aiguille de calibre 25. Remarque : Le trou percé traversera parallèle le long du tibia, dans le plateau tibial.</li>
	<li>Insérer une broche en acier inoxydable de 0,38 mm dans le trou de 15 mm dans la cavité médullaire jusqu'à ce que la résistance est ressentie et couper à ras avec le plateau tibial, à l’aide d’un coupe-fil (voir supplémentaire 1 vidéo pour une reconstruction 3D).</li>
	<li>À l’aide de ciseaux de Bonn droites, fracture du mi-diaphyse du tibia (diaphyse). Voir Figure 1 pour un diagramme schématique de la fracture.</li>
	<li>Visuellement observer l’emplacement de la fracture et les tissus adjacents d’inspecter pour la stabilisation de la hausse de la fracture.</li>
	<li>Fermer avec des agrafes par voie cutanée.</li>
	<li>Placez les souris sur coussinets chauffants pour récupérer avant leur retour à une cage propre maison. Injecter 1 mL préchauffé (37 ° C) soluté physiologique par voie sous-cutanée dans chacune des souris pour remplacer les liquides.</li>
	<li>Vérifier la souris tous les jours des signes de boiterie, une infection ou un saignement. Remarque : Si vous utilisez régulièrement buprénorphine (c’est à dire pas SR/slow release) puis administrer 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée dans 1 mL de solution saline par jour pendant 3 jours.</li>
</ol>

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<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+plasma+proteins+revitalize+hippocampal+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice.</a> Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les fractures sont un problème clinique fréquent et demeurent des principales causes de morbidité, particulièrement chez les personnes âgées en pleine croissance. Ici, nous introduisons un protocole étape par étape pour un modèle murin de fracture du tibia pour étudier les mécanismes responsables de la neuro-inflammation postopératoire et les troubles cognitifs. Ce modèle peut être associé à la chirurgie pour étudier les interactions neuro-immunitaires, régénération des tissus et autres processus de signalisation parabiose. Comprendre ces mécanismes fournira des cibles stratégiques afin de minimiser les risques de complications postopératoires et optimiser les résultats.
Plusieurs modèles orthopédiques ont été développés pour étudier la réparation osseuse dans les rongeurs,25. Nous avons adopté et modifié cette procédure de fracture du tibia, initialement décrite par Harry et al. 8, pour étudier les effets de la chirurgie orthopédique sur le fonctionnement du cerveau. Nous avons également utilisé ce modèle de fracture en combinaison avec notre modèle parabiose pour étudier les facteurs qui sont responsables de la cicatrisation osseuse et la régénération des tissus de la fonction de l’âge. Lorsque faites sous anesthésie générale volatile, cette procédure de fracture du tibia nécessite seulement environ 15 min par animal, résultats à zéro à la mortalité minimum (en fonction de l’âge de la souris et les susceptibilités génétiques sous-jacents) et récapitule commune insultes, associées à la fracture des os longs et traumatisme chirurgical orthopédique. Ainsi, ce modèle est idéal pour interroger les voies biologiques et effectuer des évaluations longitudinales. Toutefois, il est essentiel que l’ostéotomie et épinglage sont reproductibles, et qu’un dommage aux tissus mous est conforme. Lésions des tissus mous peuvent être modulées, par exemple en dénudant le périoste et en pinçant les muscles environnants pour rendre la chirurgie plus traumatisante. Modèles de fracture traumatique induite par un traumatisme contondant non fixe ou flexion trois points ne fournirait pas cette cohérence ou l’exactitude. Ces procédures se traduisent souvent par la nouvelle blessure, ce qui conduit à une réponse inflammatoire prolongée. À l’inverse, les modèles de fracture comportant une fixation rigide ont une inflammation plus modérée, ce qui ne pas entièrement récapituler les dommages associés à la chirurgie orthopédique26,27.
Autres modèles en utilisant l’épinglage en alliage de titane ont été développés pour arthroplastie humaine étroitement mimique et peuvent être plus pertinents d’interroger l’instabilité de la prothèse, ostéolyse et complications liées à la prothèse en souris28,29 . Modèles de forage comme celle présentée ici, fournir une stabilisation suffisante, et souris peuvent être testés dans des paradigmes comportements sans déficits importants qui pourraient confondre des tâches telles que peur conditionné ou ouvert champ locomotion/anxiété essais6 ,7,11,15,19,20. Cependant, déformations rotationnels peuvent se produire si la fixation n’est pas verrouillée correctement. Certains modèles utilisent un fixateur externe, ce qui assure une stabilisation supérieure mais est difficile à mettre en œuvre dans un tibia de souris, bien qu’il puisse être appliqué avec succès dans un fémur de souris27.
Des déficiences cognitives, y compris le délire et la dysfonction cognitive postopératoire, sont des complications fréquentes après chirurgie orthopédique pour réparation de fracture, en particulier dans les patients âgés et fragiles,30. Ce modèle de souris cliniquement pertinente de la chirurgie de fracture du tibia illustre que cette cytokine systémique postopératoire release6,7,17, réduite la barrière hémato - encéphalique fonction15,19 et modifié des microglies morphologie16,22, contribuent à l’altération de la mémoire et peut représenter des caractéristiques essentielles des complications neurologiques postopératoires chez beaucoup de patients après une chirurgie orthopédique. Il est important de noter que les autres interventions chirurgicales ont été utilisés pour modéliser la dysfonction cognitive postopératoire chez les souris. Il s’agit d’abdominale31,32,33 et chirurgie vasculaire34 , ainsi que traumatisme superficiel35,,36. La technique parabiose s’applique à l’ensemble de ces modèles, qui partagent des points de terminaison semblables, y compris l’inflammation, l’activation gliale et des déficits comportementaux, qui pourraient être véhiculés par des mécanismes communs.
Études qui incluent parabiose ont révélé de nouveaux rôles pour la circulation des facteurs qui affectent la fonction cognitive, neuro-inflammation et rajeunissement des tissus animaux âgés37,38,39,40 ,41,,42. Nous avons montré que parabiose peut être combiné avec succès avec le modèle de fracture du tibia décrit ici pour interroger les voies régénératrices et étudier des mécanismes faisant intervenir des facteurs véhiculés par le sang que l’influence de guérison et de fracture réparer12. Ici, nous avons démontré que la capacité de réparation de fracture d’un animal âgé peut être rajeunie quand l’animal âgé est anastomosée à un jeune animal. Ce revirement d’âge a été enraciné dans la greffe de cellules hématopoïétiques sur le site de la fracture. Fait intéressant, ce rajeunissement aussi permettrait de réaliser des transplantation de jeunes de la moelle osseuse des souris âgées. À cet égard, greffe de moelle osseuse peut être considéré comme une approche plus directe et plus simple à parabiose. Cependant, parabiose est un modèle plus robuste pour étudier la fonction des cellules circulantes et facteurs. Nous attendons qu’une combinaison de modèles de chirurgie orthopédique et de parabiose jouera un rôle important en répondant à des questions cruciales en soins périopératoires et biologie du vieillissement.
En résumé, nous introduisons un protocole étape par étape pour un modèle murin de fracture du tibia pour étudier les mécanismes responsables de la neuro-inflammation postopératoire et les troubles cognitifs après des interventions chirurgicales orthopédiques. Ce modèle peut être associé à une procédure parabiose pour étudier les interactions neuro-immunitaires, régénération des tissus et autres voies. Définir ces mécanismes fournira des cibles stratégiques afin de minimiser les risques de complications postopératoires et optimiser les résultats.

La chirurgie a transformé le système de santé médicaux et contribue en permanence à une technologie de pointe, amélioration de la sécurité et maintenue la qualité de vie. Malheureusement, la chirurgie induit également des réponses physiopathologiques qui peuvent conduire à des complications postopératoires, notamment des infections de plaies et déficiences neurologiques voire de mortalité, en particulier dans les patients âgés de1,2. Chirurgie orthopédique est effectuée régulièrement, surtout chez les aînés, pour améliorer la qualité de vie et de réparer les blessures osseuses fréquentes. Cependant, jusqu'à 50 % des patients de chirurgie orthopédique qui sont de 65 ans et plus vieux expérience déficiences neurologiques telles que la démence postopératoire. Cela constamment est en corrélation avec un pronostic sombre, c'est-à-dire, 5 fois un risque accru de mortalité à 6 mois, déclin fonctionnel persistant, augmenté fois par patiente, une augmentation de durée d’hospitalisation et des taux plus élevés de placement en soins infirmiers de soins infirmiers 3 , 4 , 5. certains facteurs de risque, y compris un âge avancé, ont été identifiés, mais on en sait peu sur les mécanismes responsables de déficiences neurologiques après la chirurgie.
Étant donné que les fractures sont très fréquents chez les personnes âgées, nous avons établi un modèle murin de fracture du tibia pour déterminer l’impact du traumatisme périphérique sur récupération post-opératoire, y compris la neuroinflammation et cerveau santé (fonctions cognitives)6, 7. ce modèle, initialement décrit par Harry et al. 8, se compose d’enclouage intramédullaire et fracture du tibia sous anesthésie générale et une analgésie et imite ainsi les blessures de la peau, les traumatismes musculaires, et OS réparation associée communes fractures d’os long et réparer chez les êtres humains. Après cette procédure, souris montrent des changements dans les marqueurs inflammatoires semblables aux changements observés dans les humains9,10, ainsi qu’activation microgliale dans l’hippocampe, qui est associée à des déficits de mémoire déclarative et neuroplasticité hippocampique6,7,11. Nous avons précédemment associé ce modèle de fracture parabiose. Parabiose est un modèle chirurgical dans lequel 2 souris sont anastomosés et partagent donc un système circulatoire. Ce modèle a permis une percée dans la compréhension des effets régulateurs des cellules circulantes et des facteurs humoraux sur la fonction des organes dans le cadre de l’âge et la maladie12,13,14. En utilisant cette approche, nous avons récemment découvert les facteurs systémiques associés avec une fracture de la fonction de l’âge12de guérison.
Ici, nous introduisons un protocole qui combine le modèle de la fracture du tibia avec parabiose étude os-à-cerveau âge-dépendante mécanismes, qui sont rapportent à la neuro-immunologie et la médecine régénérative. Protocole 1 a décrit la procédure parabiose et les détails du protocole 1 b de la procédure de fracture du tibia (Figure 1 a). Ce peuvent être effectuées indépendamment ou en combinaison, selon la nature de l’interrogatoire.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>D’autres agents volatils ou anesthésie injectable peuvent également être utilisés</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496- 6757-1</td><td>Facultatif et selon les recommandations individuelles du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Solution à 70 % pour le traitement antiseptique de peau et nettoyage</td></tr><tr><td>10 % povidone iode</td><td>Dynarex</td><td></td><td>Pour le traitement antiseptique de la peau</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Low Flow&nbsp ; Système d’anesthésie</td></tr><tr><td>MouseSTAT</td><td>Kent Scientific</td><td>PS1161</td><td>Oxymètre de pouls & Cardiofréquencemètre</td></tr><tr><td>Rasoir</td><td>Wahl</td><td>9854L</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel - #11</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Adson</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11006-12</td><td>Nécessaire pour décaper le périoste</td></tr><tr><td>Iris Pince</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11066-07</td><td>Utile (1x2 dents) pour causer des traumatismes musculaires/tissus mous localisés</td></tr><tr><td>Ciseaux de Bonn (droits)</td><td>Outils de sciences fines</td><td>14084-08</td><td>Bon pour l’ostéotomie, note à changer régulièrement au fur et à mesure que cela devient émoussé</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils de sciences fines</td><td>14058-09</td><td>Ciseaux tranchants pour couper les sutures</td></tr><tr><td>22G x 3.5 In Quincke&nbsp ; Aiguille vertébrale</td><td>BD</td><td>405181</td><td>Utiliser une tige intérieure pour épingler</td></tr><tr><td>Porte-aiguilles</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Look</td><td>1079B</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>&nbsp ; stock n° 000664</td><td></td></tr><tr><td>eGFP+ (exprimant la protéine fluorescente verte améliorée de manière ubiquitaire)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>&nbsp ; N° de stock 003291</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle murin de la chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction cognitive postopératoire et régénération des tissus

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

La chirurgie est couramment utilisée pour améliorer et maintenir la qualité de vie. Malheureusement, chez des patients vulnérables comme les personnes âgées, complications peuvent se produire et diminuent de façon importante l’issue. En effet, après chirurgie orthopédique systématique pour réparer une fracture, jusqu'à 50 % chez les personnes âgées souffrent de complications neurologiques comme délire. En outre, la capacité de guérir et de régénérer les tissus après la chirurgie diminue avec l’âge et peut influer sur la qualité de la réparation de la fracture et même osseuse intégration des implants. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes qui animent ces changements de fonction de l’âge pourrait fournir des cibles stratégiques pour minimiser le risque de ces complications et optimiser les résultats. Ici, nous présentons un modèle murin cliniquement pertinente de la fracture du tibia. L’évolution postopératoire chez ces souris imite certains des incapacités cognitives couramment observées après une chirurgie orthopédique systématique chez l’homme. En bref, une incision est effectuée dans le membre postérieur droit dans des conditions rigoureusement aseptiques. Les muscles sont dissociées, et une broche en acier inoxydable de 0,38 mm est insérée dans la crête supérieure du tibia, à l’intérieur du canal intramédullaire. Ostéotomie est ensuite effectuée, et la plaie est agrafée. Nous avons utilisé ce modèle pour étudier les effets du traumatisme chirurgical sur la neuro-inflammation postopératoire et les changements de comportement. En appliquant ce modèle de fracture en combinaison avec parabiose, un modèle chirurgical dans lequel 2 souris sont anastomosés, nous avons étudié les cellules et facteurs sécrétés systémiquement rajeunissent régénération de tissus et de la fonction orgue après une blessure. En suivant notre protocole étape par étape, ces modèles peuvent être reproduits de haute fidélité et peuvent être adaptés pour interroger plusieurs voies biologiques qui sont altérées par traumatisme chirurgical.

Après que ostéotomies transversales ont été soigneusement effectuées dans des conditions stériles avec insertion stable des épingles et suture appropriée, les souris ont montré aucun signe de boiterie, une infection ou saignement à la jambe gauche après la chirurgie. Orthopédique de guérison a été évaluée à l’aide de l’analyse radiographique et histomorphométrie après safranine-O coloration (Figure 2). Radiographies des tibias fracturés midshaft indiquent plus dépôt de tissus dans les cals de fracture des souris jeunes que chez les cals de fracture des souris âgées. Callosités de fracture étaient détartrées et incorporées à la paraffine en préparation pour l’analyse histologique. Sections ont été colorées avec la safranine-O et les dépôts de tissus a été quantifiée à l’aide d’histomorphométrie analyse. Callosités fracture de jeunes souris contenaient plus les os et les tissus moins fibreuses que les callosités de la fracture de souris âgées.
Fracture du tibia induit une inflammation systémique et central6,7,11,15,16. En effet, les niveaux périphériques des cytokines pro-inflammatoires et profils moléculaires associés à risque (DAMPs) sont rapidement élevées après chirurgie orthopédique, aussi bien dans les souris et les humains7,17,18. Ceci contribue à l’activation des cellules microgliales du cerveau par l’intermédiaire de plusieurs mécanismes de signalisation impliquant les voies neuronales, cellulaire et humorale7,15,19,20, 21. Après la chirurgie, la dysfonction endothéliale, ouverture de la barrière hémato - encéphalique et périphérique macrophage infiltration contribuent à aiguë neuroinflammation hippocampe dans les types sauvages et Ccr2DP / + Cx3cr1GFP / + souris adultes15 , 19et ont été associés à des déficits de mémoire subséquent qui ressemblent à des humain délire et dysfonction cognitive postopératoire15,19,22. Cette réponse thérapeutiques est exacerbée chez les animaux âgés, avec des changements significatifs dans la morphologie des microglies, tel que détecté par immunomarquage IBA-1 (Figure 3).
Utilisant le modèle de fracture du tibia décrit ici, nous avons également constaté la neurogenèse hippocampique transitoirement altérée, comme en témoigne une réduction doublecortin (DCX) immunomarquage dans le gyrus denté20. Des mesures électrophysiologiques de la potentialisation à long terme (LTP), un substitut pour la fonction de mémoire, a révélé une perturbation dépendante du temps dans la neuroplasticité postopératoire11. Souris après chirurgie affichent aussi une déficience en fonction de la mémoire de l’hippocampe-dépendantes, par exemple à l’aide de peur conditionné évaluation comportementale (Figure 4). Dans le conditionnement de la peur, les souris sont placés dans une chambre et exposés à un signal auditif suivi d’un stimulus aversif (c.-à-d., choc). Trois jours après la chirurgie tibiale, souris sont testés dans la salle de conditionnement, cette fois sans aucune stimulation auditive ou aversion, et comportement de congélation est enregistré comme un indice de mémoire (pour un protocole détaillé voir23).
Un âge avancé est un facteur de risque critique pour le déclin de la mémoire. Pourtant, comme nous vieillissons, la capacité de réparation tissulaire et régénération diminue aussi bien que ces mécanismes restent mal compris. Ainsi, nous avons utilisé les protocoles décrits dans les présentes pour effectuer hétérochronique parabiose (appariement des animaux jeunes ou âgés) et évalué fracture de guérison dans la souris âgée (pour un parabiose détaillé protocole voir24). Partage de sang entre les paires de parabiotic a été confirmé et constaté qu’elle égale12. Exposition à une réparation osseuse de jeune circulation améliorée avec union antérieure, augmente de déposition osseuse et diminue la fibrose (Figure 5)12. Ce rajeunissement de la régénération osseuse est produite indépendamment des ostéoblastes endogènes de l’ostéocalcine positifs (Figure 5, brun, cellules), mais plutôt s’est appuyé sur des cellules CD45 positives qui ont migré de la jeune parabiont (cellules de laFigure 5, bleu) . Ces résultats indiquent que les cellules hématopoïétiques CD45 séropositifs sécrètent un créneau jeune et en bonne santé, qui est en mesure de signaler aux cellules âgées ostéoblastique incitant à devenir plus actifs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg"> Figure 1 : représentation schématique de la chirurgie de fracture du tibia et de parabiose. Chronologie (A) pour la parabiose et de fracture du tibia (protocole 1 a) ou de fracture du tibia seul (protocole 1 b). (B) tibias de souris de 20 mois par paires parabiotic isochrones ou hétérochronique fracturées (jambe droite de la souris de droite est rompue, comme marqués d’un X). Gris souris représentent des souris de type sauvage alors que la souris vertes dépeignent eGFP souris. (C) le diagramme schématique du modèle de la fracture du tibia avec enclouage intramédullaire et Mid-tige fracturation. Voir aussi supplémentaire 1 vidéo pour une reconstruction 3D du membre postérieur et enclouage du tibia. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg"> Figure 2 : fracture du tibia de guérison au sein des modèles de souris jeunes et moins jeunes. Tibias de jeunes ou moins jeunes souris ont été fracturés et callosités de fracture étaient étudiées 21 jours post lésion. (A) l’imagerie radiographique et une coloration histologiques (safranine-O) ont été utilisées pour évaluer la fracture fracture callosités 21 jours post. La coloration montre tissus collagènes en bleu et protéoglycanes (contenus dans le cartilage) en rouge. Les lignes pointillées indiquent l’emplacement approximatif de la Cal de fracture. (B) histomorphométrie a été utilisée pour évaluer la quantité d’os, du cartilage et tissu fibreux déposés au sein de la fracture fracture Cal 21 jours post. Données sont exprimées en moyenne ± 95 % intervalle de confiance, * P &lt; 0,05, statistiquement significative (ANOVA à, test de Dunnett), barres d’échelle représentent 2 mm, et les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope, l’objectif de 1,25 x. n = 9 pour chaque échantillon. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg"> Figure 3 : chirurgie induite par l’activation de la fonction de l’âge des microglies dans l’hippocampe. Chirurgie de fracture du tibia induit plue neuroinflammation hippocampe chez les souris âgées (20 mois) par rapport aux souris C57BL6/J 4 mois. Cerveau-section coloration avec le marqueur microgliales IBA-1 montre plus positive des cellules et des modifications morphologiques chirurgie regroupe 24 h après la chirurgie. Des images ont été obtenues avec un microscope à épifluorescence avec un grossissement de 100 x. ; barre d’échelle représente 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg"> Figure 4 : Impaired neurogenèse, potentialisation à long terme et la fonction de mémoire après une chirurgie de fracture du tibia. DCX (A), un marqueur quantitatif de la neurogenèse, est significativement réduite dans le gyrus denté hippocampe à 24 h après la chirurgie. Des images ont été obtenues avec un objectif de microscope confocal à balayage laser avec un grossissement de 10 x ; l’échelle bar représente 10 µm. électrophysiologie (B) dans des tranches d’hippocampe de contrôles ou souris 24h après la chirurgie. Potentialisation à long terme (LTP) a été induite par la stimulation haute fréquence (HFS) et enregistré plus de 1 h. potentiels postsynaptiques excitateurs de champ (fEPSPs) ont été enregistrées de CA1 stratum radiatum à l’aide d’une pipette d’enregistrement extracellulaire remplie régulièrement liquide céphalorachidien artificiel. Après 24 h après la chirurgie, induction de LTP est remarquablement réduite par rapport aux souris témoins. Données sont exprimées en moyenne ± s.e.m. n = 3, * p &lt; 0,05 1-way ANOVA. (C) Hippocampal dépendant fonction mémoire (défini comme % de gel à l’aide de la trace peur conditionné) est altérée chez les souris après chirurgie par rapport aux témoins et les animaux exposés à l’anesthésie seulement. Données sont exprimées en moyenne ± s.e.m. n = 9-10, * p &lt; 0,05 1-way ANOVA. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg"> Figure 5 : chirurgie parabiose mène au rajeunissement de prise de greffe de guérison, le sang-partage et donateurs-cellule fracture. Isochrone et hétérochronique parabiose jumelages ont été établies et la souris âgée dans chaque paire a été fracturée et évaluée pour la guérison osseuse. Fracture (A) les callosités ont été étudiées à l’aide de l’imagerie radiographique. Les lignes pointillées indiquent l’emplacement approximatif de la Cal de fracture. (B) greffe de cellules eGFP + a été confirmée dans la moelle osseuse. Immunohistochimie (C) de la Cal de fracture a été utilisé pour identifier les cellules du donneur eGFP+ (bleus) et les cellules ostéoblastique ostéocalcine+ (bruns) de la parabiont. Barres d’échelle représentent 50 µm et images ont été obtenues à l’aide d’un objectif 40 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo supplémentaire 1 : Reconstruction 3D du membre postérieur et enclouage du tibia. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole décrit un modèle de souris de chirurgie orthopédique qui a été utilisée pour étudier les mécanismes de la neuro-inflammation postopératoire et les changements de comportement et lorsqu’il est combiné avec parabiose, pour étudier la régénération des tissus au cours du vieillissement.

Un modèle murin de la chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction Cognitive postopératoire et régénération des tissus

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

L’objectif global de ces méthodes chirurgicales est d’observer les effets du traumatisme sur le dysfonctionnement multi-organes, en particulier la parabiose sera utilisée pour l’anastomose d’une souris jeune et d’une souris âgée ensemble, ce qui entraînera un apport sanguin partagé. L’une des souris de ce modèle sera ensuite fracturée pour observer les effets régénératifs et l’effet sur la fonction cognitive en relation avec le système partagé de la souris jeune et de la souris âgée. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés liées au domaine de l’immunologie, du vieillissement, de la régénération tissulaire et de la fonction cognitive.Le principal avantage de la procédure orthopédique est l’applicabilité clinique de ces résultats aux complications courantes après une intervention chirurgicale, par exemple le délire et le dysfonctionnement cognitif postopératoire. Avant l’expérience, gardez les souris dans un environnement climatisé avec des cycles de lumière et d’obscurité de 12 heures et un accès approprié à de la nourriture et de l’eau standard. N’hébergez pas plus de cinq compagnons de portée par cage et évitez les conditions qui pourraient encourager les bagarres.Utilisez une souris femelle à l’âge de trois mois et une souris âgée à l’âge de 17 mois. Pour la parabiose, acclimatez deux souris ensemble pendant au moins deux semaines avant la chirurgie. Vérifiez quotidiennement l’état corporel et l’apparence générale des souris.Pour vous préparer à la chirurgie, pesez les deux souris. Après avoir administré une anesthésie générale, placez les souris sur un coussin chauffant en position couchée. Enfin, maintenez le niveau d’anesthésie correct pour chaque souris.Ensuite, rasez chacune des deux souris le long d’une ligne continue à partir du coude, du flanc et du genou du côté à joindre. Désinfectez avec un gommage de la peau à l’iode et à 70 % d’alcool sur trois cycles alternés en préparation de l’incision. Commencez par administrer l’analgésie après l’induction et avant la manipulation chirurgicale.Injectez 0,25 % de bupivacaïne sur les flancs juste avant l’ouverture. Sur chaque souris, utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée le long du flanc allant de la proximale au genou à juste la proximale du coude et sans perturber les muscles sous la peau. Joignez les triceps des animaux avec deux sutures interrompues.Joignez ensuite les parois du corps le long des flancs avec une suture continue de sept à neuf passes. Ensuite, joignez les quadriceps de l’animal avec deux sutures interrompues et fermez la peau des deux parabiontes avec des sutures interrompues. Complétez les sutures interrompues avec la souris en position couchée.Laissez les souris se réveiller à l’air ambiant. Hébergez chaque paire individuellement et assurez-vous de surveiller les paires quotidiennement en effectuant une évaluation de l’état corporel deux fois par semaine et en pesant les paires deux fois par semaine. Enfin, prévoyez quatre semaines de temps de récupération pour assurer une circulation partagée entre les parabiontes si vous effectuez une chirurgie de fracture tibiale.Ensuite, rasez la face médiale du membre postérieur droit de la souris pour exposer la zone chirurgicale et désinfectez avec un gommage cutané à l’iode et à 70 % d’alcool sur trois cycles alternés. Commencez par administrer l’analgésie après l’induction et avant la manipulation chirurgicale. Injectez 0,25 % de bupivacaïne sur le site chirurgical proximal du genou juste avant l’ouverture.Maintenir un champ chirurgical stérile tout au long de l’intervention à l’aide d’instruments autoclavés. Faites une incision à l’aide de ciseaux à proximité du genou le long de la face médiale du membre postérieur droit jusqu’au milieu de la tige du tibia sur la souris gauche. Exposez le milieu de la tige du tibia et localisez visuellement la diaphyse.Fléchissez le genou et visualisez le plateau tibial en utilisant le ligament fémoro-patellaire comme point de repère. Visualisez le tendon rotulien. Ensuite, percez manuellement un trou dans le canal intramédullaire à l’aide d’une aiguille de calibre 25 en utilisant un mouvement de roulement du doigt et du pouce.Ensuite, insérez une goupille en acier inoxydable de 0,38 millimètre à travers le trou d’environ 15 millimètres dans la cavité médullaire jusqu’à ce que la résistance se fasse sentir et coupez la chair avec le plateau tibial à l’aide d’un coupe-fil. Ensuite, utilisez des ciseaux à liaison droite pour fracturer le milieu de la tige tibiale. Observez visuellement le site de la fracture et les tissus adjacents pour vérifier la stabilisation du site de la fracture.Fermez ensuite la peau à l’aide d’agrafes cutanées. Enfin, injectez un millilitre de solution saline normale préchauffée à 37 degrés Celsius par voie sous-cutanée dans chaque souris pour remplacer le liquide. Placez les souris sur des coussinets chauffants pour récupérer avant de les remettre dans une cage domestique propre.Vérifiez quotidiennement les souris pour détecter des signes de boiterie, d’infection ou de saignement. Les radiographies du tibia fracturé au milieu de la diaphyse ont indiqué plus de dépôts de tissu dans les callosités fracturées des jeunes souris que dans les callosités fracturées des souris âgées. De plus, les callosités fracturées des jeunes souris contenaient plus d’os et moins de tissu fibreux que les callosités fracturées des souris âgées.La chirurgie de la fracture du tibia a induit une plus grande neuroinflammation de l’hippocampe chez les souris âgées de 20 mois par rapport aux souris de quatre mois. De plus, les souris après une intervention chirurgicale présentent également des déficiences de la fonction de mémoire dépendante de l’hippocampe, par exemple en utilisant l’évaluation comportementale du conditionnement de la peur. L’exposition à une circulation jeune a amélioré la réparation osseuse avec une union plus précoce, une augmentation des dépôts osseux et une diminution de la fibrose.Ce rajeunissement de la régénération osseuse s’est produit indépendamment des ostéoblastes endogènes positifs à l’ostéocalcine, mais s’est plutôt appuyé sur des cellules CD45 positives qui ont migré à partir du jeune parabionte. Une fois maîtrisée, la technique de parabiose peut être réalisée en 1 heure et demie et le modèle de fracture tibiale peut être réalisé en 15 minutes. Si nécessaire, les deux procédures peuvent également être effectuées indépendamment l’une de l’autre.Lors de la tentative de procédure de fracture du tibia, il est important de maintenir un champ chirurgical stérilisé et d’assurer un bon placement de la goupille et une ostéotomie appropriée. Enfin, n’oubliez pas de surveiller attentivement les souris tout au long de la durée de l’étude. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le modèle de parabiose et la chirurgie de la fracture tibiale.

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Nous décrivons un protocole pour la déstabilisation du ménisque médial (DMM) de modèle chez la souris, un outil efficace pour l'arthrose (OA) de recherche. De plus, nous avons démontré que la carence de progranulincan exaggerate développement de l'OA et de la progression à l'aide de ce modèle, ce qui indique que progranulin joue un rôle protecteur dans la pathogenèse de l'arthrose.

Mise en place d&#39;un modèle chirurgicalement induite chez la souris pour étudier le rôle de protection de progranuline dans l&#39;arthrose

Bien que les modèles murins soient des outils inestimables pour l’ingénierie des tissus osseux, les modèles de défauts osseux longs sont rares. Ce besoin a motivé le développement du protocole actuel qui utilise une plaque de verrouillage avec quatre vis et un gabarit dédié pour réaliser et stabiliser un défaut reproductible, fémoral, de taille critique avec une faible morbidité.

Mise en place d&#39;un segmentaire fémoral Critical-size Defect modèle chez la souris Stabilisé par Plate ostéosynthèse

Cet article décrit une méthode permettant de générer une lésion par compression de la moelle épinière (LME) reproductible chez la souris néonatale. Le modèle fournit une plate-forme avantageuse pour étudier les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée.

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Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être utiles pour concevoir de nouveaux tissus à partir des propres cellules d’un patient. Nous présentons un protocole pour l’isolement d’une sous-population de cellules stromales (ASC) humaines dérivées du tissu adipeux avec un potentiel ostéogénique accru, suivi de l’application des cellules dans un test de cicatrisation calvaire in vivo.

Isolement rapide de BMPR-IB + Adipose-Derived cellules stromales pour utilisation dans un calvarial Defect Modèle de guérison

Nous avons effectué une occlusion unilatérale de l’artère carotide jour postnatal 7-10 CD-1 chiots pour créer un modèle de (HI) hypoxique-ischémique neonatal de souris et ont étudié les effets des lésions cérébrales HI. Nous avons étudié les fonctions neurocomportementales chez ces souris par rapport à des souris normales non exploités.

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Nous présentons un souris tibial distraction ostéogénèse modèle développé à l’aide d’un distracteur sur mesure. L’utilisation d’une souris comme une cible d’analyse est avantageuse pour faire avancer la recherche.

Un modèle murin d’ostéogenèse Distraction

Le protocole actuel établit une méthode rigoureuse et reproductible pour la quantification des changements articulaires morphologiques qui accompagnent l’arthrose. L’application de ce protocole peut être utile en surveillant la progression de la maladie et en évaluant les interventions thérapeutiques dans l’arthrose.

Évaluation histomorphométrique normalisée de l’arthrose dans un modèle chirurgical de souris

Nous avons simulé une chirurgie clinique pour établir un protocole d’anastomose directe des nerfs bilatéraux du plexus brachial par voie préspinale chez la souris, contribuant ainsi à l’étude des mécanismes neuronaux sous-jacents à la rééducation lors du transfert nerveux croisé après des lésions du système nerveux central et périphérique.

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Voici un nouveau dispositif automatisé de contusion des lésions de la moelle épinière pour les souris, qui peut produire avec précision des modèles de contusion des lésions de la moelle épinière à des degrés divers.

Impacteur automatisé pour un modèle de lésion contusive de la moelle épinière chez la souris

La méthode de l’aiguille de la sténose asymétrique bilatérale de l’artère carotide commune est proposée pour créer un modèle murin de déficience cognitive vasculaire et de démence. Elle donne des résultats à plus long terme par rapport aux modèles précédemment établis et est compatible avec l’IRM en direct. La représentation visuelle démontrant la procédure fournit des conseils pour maîtriser la chirurgie.

Un modèle murin de déficience cognitive vasculaire et de démence basé sur la sténose bilatérale asymétrique de l’artère carotide commune guidée par aiguille

Découvrez un modèle murin de chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction cognitive postopératoire et la régénération tissulaire chez la souris âgée par parabiose.

Un modèle murin de la chirurgie orthopédique pour étudier la dysfonction Cognitive postopératoire et régénération des tissus

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