Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

L’objectif global de cette procédure est de créer un modèle animal d’atrophie géographique aux grands yeux afin de transplanter des cellules épithéliales de pigment rétinien dérivé de l’embryon humain dans l’œil et d’évaluer l’intégration des cellules du donneur à l’aide de la tomographie par cohérence optique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que le traitement à base de cellules souches pour les maladies dégénératives. Le principal avantage de ce cadre chirurgical est la source illimitée de cellules saines et le cadre chirurgical pour l’injection sous-rétinienne, qui présente de nombreuses similitudes avec une procédure destinée au patient.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge par l’ostentation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines. Notre technicienne animalière, Monica Aronsson, maintient le lapin en position afin que nous puissions visualiser et imager la rétine avec la tomographie par cohérence optique. Après avoir anesthésié un lapin selon le protocole textuel, placez le lapin sous le microscope chirurgical avec la tête face au chirurgien.

Ensuite, utilisez un écarteur de paupière pour retirer les paupières et un chiffon stérile pour retirer la membrane nictitans. Pour la microchirurgie, utilisez une technique de pars plana transvitréen de calibre 25 à deux ports ou à trois ports en option avec des trocarts non soupapes pour l’insertion d’instruments microchirurgicaux. L’appareil de vitrectomie multifonction dispose de ports pour connecter une canule de perfusion, un endoéclairage, un vitrector et un endolaser.

Pour les injections sous-rétiniennes, seule l’endoillumination est obligatoire, ce qui rend une configuration à deux ports suffisante. À l’aide d’une pince à caillot pour saisir et déplacer la conjonctive, surlignez le site d’insertion. Insérez par voie transsclérale l’un des deux trocarts supérieurs, à un à deux millimètres du limbe, à un angle parallèle de trente à quarante-cinq degrés.

Procédez à l’insertion du trocart au milieu de la pointe. Ensuite, tournez le trocart de quatre-vingt-dix degrés et avancez-le dans l’œil, en visant le pôle postérieur. Cela empêchera les fuites postopératoires de cette sclérotomie et diminuera également le risque d’endophtalmie.

Répétez l’opération avec le deuxième trocart supérieur. Lors de l’insertion du trocart, il est important d’être à un à deux millimètres du limbe pour tunneliser l’insertion et viser le pôle postérieur afin de minimiser le risque d’infection, de saignement vitréen, de décollement de la rétine et de notre toucher de lentille. Appliquez des larmes synthétiques sous forme de gel contractuel sur la cornée, puis positionnez une lentille de contact plate à usage unique sur la cornée pour visualiser la rétine.

Ensuite, déposez cinq cents microlitres d’iodate de sodium dans une seringue d’un millilitre reliée à un tube d’extension actionné par un assistant et à une canule poly-emboutée de calibre 38 opérée par le chirurgien. Insérez la sonde d’endoéclairage à travers le trocart supérieur gauche. Ensuite, insérez la canule d’injection à travers le trocart supérieur droit et avancez la canule à travers l’espace vitré vers la rétine, en visant la zone juste en dessous de la tête du nerf optique.

Laissez l’extrémité de la canule toucher lentement la rétine jusqu’à ce qu’un blanchiment focal soit visible. Ne laissez pas la canule pénétrer dans la rétine car cela pourrait provoquer une hémorragie. Maintenant, en pénétrant la rétine avec l’aiguille, injectez cinquante microlitres d’iodate de sodium par voie sous-rétinienne sur une période de cinq secondes.

Comme il existe un plan de clivage naturel entre la rétine et la choroïde sous-jacente, une bulle semi-transparente clairement visible devrait se former progressivement au cours de l’injection. Pendant l’injection, rétractez lentement l’aiguille, mais assurez-vous que l’extrémité est maintenue à l’intérieur de la bulle pour minimiser le reflux. Après avoir retiré l’endoéclairage et la canule d’injection, utilisez une pince à caillot pour retirer les trocarts.

Ensuite, utilisez l’embout, ou l’extrémité émoussée de la pince, pour appliquer une légère pression pendant trente secondes sur la sclérotomie sans suture douce. Pendant la convalescence, occupez-vous de l’animal selon le protocole textuel et attendez sept jours pour la transplantation. Sept jours après l’injection d’iodate de sodium et après l’administration de triamcinolone intravitréenne, selon le protocole de texte, retirez le milieu de différenciation cellulaire d’une monocouche hESC-RPE de vingt-quatre puits confluents et utilisez cinq cents microlitres de PBS sans calcium ni magnésium pour laver chaque puits.

Après avoir essayé les cellules, inclinez la plaque et retirez soigneusement la trypsine pour permettre aux cellules de rester attachées à la plaque. Collectez les cellules dans huit cents microlitres de milieu de différenciation frais préchauffé à trente-sept degrés Celsius en pipetant doucement, voire en grattant si nécessaire, pour obtenir une suspension de cellule unique. À l’aide du point zéro deux pour cent de bleu trypan, comptez les cellules dans une chambre d’hémocytomètre selon les instructions du fabricant.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de milieu de différenciation à la suspension cellulaire et centrifugez les cellules à trois cents fois g, à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans du PBS fraîchement filtré et stérilisé à une concentration finale de mille cellules par microlitre. Aliquote la suspension cellulaire précédente en aliquotes de six cents microlitres et conserve-les sur de la glace jusqu’à et pendant l’opération.

Après avoir anesthésié le lapin et dilaté les pupilles selon le protocole textuel, placez le lapin avec la tête face au chirurgien. Utilisez l’écarteur de couvercle pour retirer les paupières et un chiffon stérile pour retirer la membrane nictitans. Pour la microchirurgie, utilisez une technique de pars plana transvitréen à deux ports ou à trois ports en option de calibre 25 avec des trocarts placés dans les mêmes positions, comme démontré précédemment dans cette vidéo.

Si les sclérotomies précédentes sont visibles, effectuez l’insertion du trocart juste à côté de ces sites d’insertion, mais pas à travers ceux-ci, pour minimiser le risque de fuite postopératoire. Appliquez des larmes synthétiques sur l’œil comme précédemment et placez une lentille de contact plate à usage unique sur la solution sur la cornée pour visualiser la rétine. Après avoir correctement positionné l’embout et visé le centre de la zone prétraitée à l’iodate de sodium, qui se distingue par un réflexe d’endoillumination métallique caractéristique, injectez par voie sous-rétinienne cinquante microlitres d’une suspension hESC-RPE doucement mélangée.

La rétine neurosensorielle devrait se séparer facilement, créant une bulle clairement visible. Pendant l’injection, rétractez lentement l’aiguille mais assurez-vous que l’embout est maintenu à l’intérieur de la bulle pour minimiser le reflux. Après avoir retiré l’endoéclairage et la canule d’injection, utilisez une pince à caillot pour retirer les trocarts et utilisez l’extrémité émoussée de la pince pour appliquer une légère pression pendant trente secondes comme auparavant.

À l’aide d’un appareil de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral, ou SD-OCT, avec le logiciel qui l’accompagne, pour obtenir des B-scans en coupe transversale des animaux traités, conformément aux instructions du fabricant. Placez l’animal anesthésié et dilaté dans un support réglable pour obtenir un chemin dégagé entre la source lumineuse de l’instrument et la rétine du lapin. Pour éviter le flou de l’image, gardez la cornée humide en rinçant avec une solution saline topique toutes les trente à soixante secondes.

Obtenez au moins trois scintigraphies OCT avec des images d’ophtalmoscopie laser à balayage confocal infrarouge simultané ou des images de référence de réflectance SLO confocales représentant la partie supérieure, centrale et inférieure de la zone injectée. Obtenez plusieurs couleurs laser simultanées d’images du fond d’œil en face avec une réflectance laser confocale SLO bleu, vert, infrarouge et multicolore. Capturez des images d’autofluorescence en lumière bleue à l’aide de la capacité laser à lumière bleue de l’appareil SD-OCT.

Des images in vivo représentatives de BAF, IR-cSLO et SD-OCT d’une rétine de lapin albinos normale sont présentées ici. Un agrandissement de l’image SD-OCT illustre les différentes couches rétiniennes avec leurs niveaux distinctifs de réflexion de la lumière capturés par l’instrument SD-OCT. Comme le montre cette image SD-OCT, prise trois mois après l’injection de cinquante microlitres d’une solution millimolaire d’iodate de sodium, une bulle est créée qui résout et dégénère progressivement la rétine externe.

On peut observer un amincissement des couches neurorétiniennes les plus externes dans les zones SD-OCT et hypo-BAF, correspondant à la perte d’EPR, recréant ainsi un phénotype de type GA. Lors de l’identification de la zone endommagée, cinquante mille cellules hESC-RPE ont été réinjectées pour la transplantation, créant une deuxième bulle qui s’est résolue. Des zones d’hyper-BAF légères à modérées sont présentes avec un hyper-BAF focalement augmenté à la limite de la zone de dommage, indiquant un stress chronique de l’EPR natif.

La bulle correspondant à l’injection de CSE-H dans les yeux non prétraités, montrant des taches de cellules pigmentées dans l’image MC et des structures rétiniennes bien préservées dans le scan SD-OCT, est montrée à des fins de comparaison. La maîtrise de cette jolie méthode clinique d’injection sous-rétinienne facilitera la transplantation clinique d’un traitement cellulaire pour des affections telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place des injections sous-rétiniennes dans un modèle de type vivant, de la préparation de cellules souches embryonnaires humaines dérivées de cellules souches pour des injections sous-rétiniennes et de la façon de visualiser l’intégration des cellules de donneurs à l’aide de la tomographie par cohérence optique.