Name: Dissection et la Culture Explant allantoïde murin pour l’analyse In Vitro de l’attachement allantoïdien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez la dissection et la culture d'explant d'allantoïde murin pour analyser l'attachement allantoïdien in vitro. Cette méthode modélise l'étape initiale de la formation placentaire chez les mammifères.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (à A.G.).

Élevage de souris a été approuvé par le Regierung Unterfranken, et toutes les analyses ont été réalisées en stricte conformité avec tous les allemands et l’Union européenne aux lois et règlements concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. revêtement de microplaques plaques avec l’intégrine α4β1 pour Ex Utero allantoïde Explant Culture
<ol><li>Reconstituer l’intégrine α4β1 murin lyophilisée stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 200 µg/ml. Diluer à une concentration finale de 10 µg/mL dans le milieu (37 ° C) PBS. Pipeter 20 µL/puits de la solution de l’intégrine α4β1 dilué dans le nombre requis de puits d’une microplaque (1 allantoïde/puits). NOTE : Éviter la formation de bulles d’air lorsque le revêtement du puits de la plaque de microtitration.</li>
	<li>Incuber les plaques de microtitration pendant 60 min à 37 ° C en les plaçant dans un incubateur de culture de tissu humidifié.</li>
	<li>Soigneusement aspirer le surnageant avec une pipette. Utilisation légère succion et l’inclinaison de la plaque pour éviter de toucher le fond bien avec la pipette. Laver les puits deux fois en ajoutant 50 µL de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) comme de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) et enlever le support de lavage par aspiration douce.</li>
	<li>Étape cruciale : bloc gratuit des sites de liaison en ajoutant 50 µL/puits de 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) / DMEM et incuber pendant ≥ 30 min à 37 ° C en plaçant des plaques de microtitration dans un incubateur de culture de tissu humidifié. NOTE : Les explants allantoïde peuvent fixer sur des surfaces diverses en présence de sérum. Il est donc impératif de bloquer les sites de fixation non spécifique, après avoir enduit les puits avec l’intégrine et avant d’ajouter l’allantoïde disséqué pour explant culture en sérum contenant moyen (voir étape 4.4).</li>
	<li>Gardez de la microplaque à la solution de saturation à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire à l’étape 4.4.</li>
</ol>2. utérus Dissection d’une souris enceinte au Dpc 8
Remarque : Réduire les taux de grossesse de faux-positifs de poids gain discrimination15.
<ol><li>Sacrifier la souris par dislocation cervicale. Désinfecter le manteau dans la région abdominale en les vaporisant avec l’éthanol à 70 % (v/v). NOTE : Porter des gants lorsque vous manipulez des souris. L’euthanasie par dislocation cervicale sans anesthésiques empêche la contamination chimique de l’allantoïde, qui peut-être interférer avec l’attachement de l’allantoïde.</li>
	<li>Ouvrir la peau abdominale en faisant une petite incision à la ligne médiane avec des ciseaux. Utiliser les doigts gantés de tenir la peau au-dessus et au-dessous de l’incision et écartez la peau vers la poitrine et la queue de la souris.</li>
	<li>Saisir le péritoine avec une pince. Avec l’autre main, faire une incision en forme de V de la partie antérieure vers postérieur à l’aide de ciseaux et déplacer le tissu loin d’exposer la cavité abdominale. Utilisez la pince pour pousser les intestins d’un côté pour accéder à l’utérus.</li>
	<li>Localisez les deux cornes utérines. Tenir le col de l’utérus (le segment caudal) avec une pince et couper les ligaments avec des ciseaux. Puis détacher les deux cornes utérines en sectionnant les oviductes avec des ciseaux.</li>
	<li>Utilisez des pinces pour transférer l’utérus dans un stérile 10 cm plat contenant stérile, PBS de température ambiante (RT). Retirez le tissu adipeux, vaisseaux et nerfs qui entourent les cornes utérines avec pince fine et/ou des ciseaux (Figure 1 a).</li>
</ol>3. Dissection de l’embryon
Remarque : Effectuez les opérations suivantes sous un stéréomicroscope équipé d’une plage de zoom 8:1.
<ol><li>Séparer les embryons en coupant entre les sites d’implantation avec des ciseaux. Saisir la musculaire muqueuse utérine des utérus bourgeons avec une pince et tirer à part pour exposer la caduque (Figure 1 b).</li>
	<li>À l’aide de pinces, transférer les bourgeons de l’utérus dans une autre boite de 10 cm contenant stérile, RT PBS.</li>
	<li>Difficulté la caduque autour de l’embryon avec le bout des pinces.</li>
	<li>Faire une incision sur le côté de l’anti-mesometrial de la caduque avec une pince fine (Figure 1) et la caduque, décollez avec une pince pour exposer l’embryon (Figure 1). Remarque : Le pôle mesometrial de la caduque est fortement vascularisé et peut être plus large à sa base que la partie anti-mesometrial, qui contient l’embryon et apparaît plus pâles.</li>
	<li>Disséquer l’embryon avec une pince (Figure 1E, F).</li>
	<li>À l’aide d’une micro-cuillère, transférer l’embryon dans une goutte de solution de PBS stérile contenue dans un récipient stérile de 3,5 cm.</li>
	<li>Transférer l’embryon dans une nouvelle goutte de PBS dans le même plat de 3,5 cm à l’aide d’une micro-cuillère et disséquer l’embryon du sac vitellin à l’aide de pinces (Figure 1, H).</li>
	<li>Éventuellement, si nécessaire (par exemple, pour le génotypage par polymerase chain reaction), transférer le sac vitellin dans un tube stérile en aspirant avec ~ 5 µL PBS dans un grand orifice 200 µL de pipette. Conserver à-20 ° C. Remarque : Des tissus maternels (c.-à-d., le sac vitellin pariétal comme membrane de Reichert et le cône ectoplacental) susceptibles de contaminer la préparation du sac vitellin peuvent conduire à des résultats erronés de génotypage. Suppression de ces tissus est plus facile avant la dissection de l’embryon du sac vitellin.</li>
</ol>4. allantoïde Dissection et Culture Ex Utero sur l’intégrine α4β1 immobilisé
<ol><li>L’allantoïde, coupez son site basale d’insertion à l’extrémité postérieure de l’embryon à l’aide de pinces fines (Figure 1 H).</li>
	<li>Éventuellement, s’il faut du développement mise en scène, compter les paires de segments de l’embryon par inspection visuelle à l’aide d’un microscope équipé d’optique de contraste de phase et un 5 x et objectif × 10. Remarque : L’embryon peut être étendu avec une pince pour faciliter le dénombrement du somite. Fusion et Chorio-accessoire se produisent entre E 8.0 et 9.0 E chez les embryons avec paires ≥ 6 somite. Virage commence dans des embryons avec 6-8 paires de segments.</li>
	<li>Pipette 40 µL/puits de DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 % (v/v), L-glutamine et des antibiotiques dans le nombre requis de micropuits de plaque revêtus (voir Section 1).</li>
	<li>Recueillir l’allantoïde flottant en aspirant avec ~ 5 µL PBS dans un grand orifice d’une pointe de pipette de 200 µL. Transférer 1 allantoïde/puits.</li>
	<li>Incuber les allantoides en plaçant des plaques de microtitration dans un incubateur de culture de tissu humidifié (37 ° C, 5 % de CO2) pour par exemple, 6, 12 et 24 h. Afin d’éviter toute interférence avec l’attachement de l’allantoïde, ne déplacez pas les plaques de microtitration entre ces points dans le temps.</li>
	<li>À chaque moment, marquer l’attachement allantoïde (p. ex., aucun attachement/flottant allantoïde allantoïde partiellement ou totalement attachée ; entièrement propagation allantoïde) à l’aide d’un microscope équipé avec phase contraste ou différentiel interférences contraste une optique et un 5 × ou × 10 objectif (Figure 2). NOTE : Des exemples représentatifs d’allantoides fraîchement isolées et complètement attachées sont illustrés Figure 2. Ex utero, l’extrémité distale du allantoides isolés de souris C57BL/6J de type sauvage s’attache au sein de 4 à 6 h (Ceci est dénommé fixation partielle de l’allantoïde) et fixation complète de l’allantoïde entière est obtenue dans les ~ 12 h de culture. De 18 à 24 heures, l’explant a aplati et a assumé une forme circulaire (appelée pour aussi pleinement répandre allantoïde) CD31 séropositifs au plexus vasculaire9,16.</li>
</ol>5. confirmation de coloration de l’allantoïde explanté pour le CD31 de marqueur de cellules endothéliales
<ol><li>Aspirer le milieu de culture d’explants de propagation complètement et fixer les cellules en ajoutant 40 µL/puits de 4 % (p/v) paraformaldéhyde/PBS. NOTE : Paraformaldéhyde est toxique. Porter des gants et des lunettes de sécurité pour éviter la peau et contact avec les yeux.</li>
	<li>Incuber pendant 10 min à la droite, puis aspirer le surnageant. Laver trois fois en ajoutant 40 µL/puits de PBS et enlever le support de lavage par aspiration douce.</li>
	<li>Permeabilize des cellules et bloquer les sites de fixation non spécifique en ajoutant 40 µL/puits de 0,1 % (v/v) de sérum de chèvre normal de Triton X-100/0.1% (p/v) BSA/10% (v/v) dans du PBS pendant 30 min à RT. Wash deux fois en ajoutant 40 µL/puits de PBS et enlever le support de lavage par aspiration douce. Remarque : Le protocole peut être suspendu pendant la nuit à ce stade.</li>
	<li>Colorer les cellules en ajoutant 20 µL/puits des anticorps anti-CD31 primaire dilué 01:50 dans 0,1 % (p/v) BSA/PBS pendant la nuit à 4 ° C. Laver trois fois en ajoutant 40 µL/puits de PBS et enlever le support de lavage par aspiration douce.</li>
	<li>Détecter les anticorps primaires en ajoutant 20 µL/puits de chèvre secondaire fluorescent marqué des anticorps anti-rat dilué 1 : 200 à 0,1 % (p/v) : BSA/PBS pendant 1 h à RT. Protect microplaques de la lumière par les envelopper dans du papier d’aluminium, soit en plaçant dans une chambre noire. Laver trois fois en ajoutant 40 µL/puits de PBS et enlever le support de lavage par aspiration douce.</li>
	<li>Intégrer des cellules en ajoutant 20 µL/puits de milieu de montage. Incuber pendant ~ 1 h à RT jusqu'à ce que le milieu de montage se solidifie. Stocker les microplaques à RT ou à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>Image du plexus vasculaire de l’allantoïde des explants sous un microscope à fluorescence équipé a × 5 ou 10 × objectif et filtres de fluorescence approprié. NOTE : Images représentatives du plexus vasculaire CD31-positif d’une allantoïde entièrement propagation sont indiquées à la Figure 3. Autres marqueurs pour le plexus vasculaire, tels que des anticorps dirigés contre Flk-1, Flt, Tie-1 ou Tie-2 peut servir bien16.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En présence de sérum, qui est une source riche en molécules de la matrice extracellulaire Pro-adhésif telles que la fibronectine, allantoïde explants s’attacheront facilement à divers plastique, verre ou filtre surfaces9,16. Ainsi, si l’objectif de l’essai effectué est d’étudier plus précisément l’effet d’une modification génétique ou tout autre traitement sur l’attachement allantoïde à immobilisé α4β1, il est essentiel de bloquer des sites de fixation non spécif...

Le placenta est indispensable pour la croissance embryonnaire et développement au sein de l’utérus. Elle constitue l’interface pour l’oxygène, métabolite et échange de nutriments entre la circulation fœtale et maternelle, ainsi que des fonctions comme un organe endocrine et immunologique. Toute insulte endogène ou exogène qui entrave le développement placentaire peut entraîner un retard de croissance intra-utérin, la perte fœtale ou complications de la grossesse, tant chez les souris et les humains1. Alors que le nombre de mutations de souris ciblées qui causent anormale physiologie placentaire continue d’augmenter de2, avec 219 génotypes qui figurent actuellement sur le site Web de génome de souris informatique (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bon nombre de ces phénotypes ne sont pas bien compris d’un point de vue mécaniste. En plus des altérations génétiques, médicaments à petites molécules, anticorps monoclonaux, toxines, agents pathogènes, les métabolites excès ou divers agents environnementaux peuvent affecter développement placentaire et fonction3,4,5 , 6 , 7. encore, simple in vitro tests que les étapes critiques de modèle dans le développement du placenta sont rares.
Murine développement placentaire est initié début mi-gestation, lorsque l’allantoïde (le précurseur du développement du cordon ombilical) émerge de l’extrémité postérieure de l’embryon comme un bourgeon qui se développe vers le chorion8. Chorioadhesive cellules de la couche externe de le œuf liquide allantoïdien médient l’attachement et la propagation de l’allantoïde sur la surface du chorion (Chorio-« fusion »). Le chorion se plie par la suite dans les villosités dans lequel le système vasculaire de l’allantoïde se développe pour former le labyrinthe, la couche interne de placentaire où les nutriments et l’oxygène sont échangés entre les sinusoïdes de sang maternel étroitement juxtaposées et vaisseaux embryonnaires9 ,,10.
La fixation de l’allantoïde sur le chorion est l’étape initiale et critique dans la formation du labyrinthe, et défauts de ce processus sont parmi les causes les plus fréquentes de létalité embryonnaire en milieu1. Bien qu’un certain nombre de souris mutantes ont été décrits où Chorio-accessoire ne parvient pas à se produire10, et la base de données MGI répertorie actuellement 108 souris mutantes qui sont caractérisées par des anomalies Chorio-fusion (http:// www.Informatics.JAX.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l’interaction intercellulaire entre la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire-1 (VCAM-1, exprimé sur le mésoderme allantoïdien) et l’intégrine α4β1 (exprimées sur le mésothélium chorionique, qui est dérivé du mésoderme extra-embryonnaire) semble indispensable pour Chorio-attachement et fusion11,12,13. Marquage immunohistochimique des embryons de type sauvage entier-montent a montré que la VCAM-1 est exprimé dans les deux-tiers distal du pédoncule allantoïdien au jour environ embryonnaire (E) 7,513 (stade de segments de 1-4), et que son expression reste élevée au cours de la Chorio-attachement et - fusion11,12. Échec de fixation allantoïdienne au chorion est généralement détecté par l’analyse histologique des bourgeons de l’utérus. Toutefois, allantoïde tailles sont physiologiquement très variables entre les deux et même au sein des portées du même stade de développement14et l’allantoïde pouvez uniquement attacher au chorion lorsqu’il a atteint une taille suffisante pour établir le contact physique. Reflétant cette variabilité naturelle, Chorio-fixation a lieu quelque temps entre ~ E 8.0 et 9.0 E le dans l’utéruset à une évaluation statistiquement fiable de ce processus par l’histologie est donc tributaire de l’analyse d’un grand nombre de foetus à obtenir suffisamment d’échantillons au stade du développement approprié.
Nous décrivons ici une méthode pour évaluer des attachement allantoïdien ex utero qui est moins tributaire de la taille de l’allantoïde. Nous démontrons la dissection des embryons de souris et leurs allantoides de l’utérus de souris enceintes ~ 8 jours post coitum (dpc ; dpc 0,5 désigne la détection d’un bouchon vaginal), et la culture subséquente de l’allantoïde explants sur α4β1 immobilisé intégrines. Cette méthode permet une évaluation rapide et fonctionnelle de l’attachement et la diffusion de comportement d’explants d’allantoïde multiples en parallèle et à différents moments successifs. Le protocole peut être utilisé pour dépister les effets des mutations ciblées, de drogues ou de différents facteurs environnementaux sur l’allantoïde fixation ex vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J souris de type sauvage</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Code n° de stock :&nbsp ; </td><td></td>000664</tr><tr><td>70 % (v/v) Éthanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Outils de sciences fines</td><td>11000-12</td><td>Pince utilisée pour ouvrir la cavité abdominale.</td></tr><tr><td>Micro pince à dissection</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 forcepts de biologie médicale à pointe fine et pointue.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux fins&nbsp ;</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14094-11</td><td>Lames droites.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Ciseaux à ressort Noyes avec lames de 14 mm pour la dissection des bourgeons utérins.</td></tr><tr><td>Microcuillère</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Diamètre de la cuillère.</td></tr><tr><td>Plaques de microtitration</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>Nous utilisons des lames d’angiogenèse stériles et non revêtues (volume interne 50 & micro ; L) avec une surface hydrophobe qui n’est pas traitée par culture tissulaire pour réduire non-&#945 ; 4&#946 ; Reliure à 1 intermédiaire sur plastique.</td></tr><tr><td>Boîte de 10 cm</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Boîtes stériles de culture de tissus.</td></tr><tr><td>Boîte de 3,5 cm</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Boîtes stériles de culture de tissus.</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à grand orifice&nbsp ;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Pointes de pipette à faible liaison, 200 &micro ;L.</td></tr><tr><td>&#945 ; 4&#946 ; 1 intégrine</td><td>R& D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murin &#945 ; 4&#946 ; 1 intégrine exprimée de manière recombinante et purifiée à partir d’une lignée cellulaire d’ovaire de hamster chinois.</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) de DulbeccoSigma</td> <td>Aldrich</td><td>D8537</td><td>sans Ca2+ et Mg2+.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>La formulation contient 4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium et 3,7 g/L de NaHCO3 mais pas de L-glutamine, qui est ajoutée séparément.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 & micro ; g/mL de streptomycine.&nbsp ; Préparer et conserver les aliquotes à -20 &deg ; C pour éviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Solution mère. Préparer et conserver les aliquotes à -20 &deg ; C pour éviter le gel/dégel.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>Nous utilisons des FBS inactivés thermiquement (chauffés à 56 &deg ; C pendant 30 min en mélangeant pour inactiver le complément).</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Nous utilisons de l’albumine sans protéase ni acide gras. Préparez une solution à 0,1 % (p/v) dans du DMEM. Filtrer stérilement la solution à travers un filtre de culture cellulaire jetable avec un 0,22 & micro ; m taille des pores et membrane à faible liaison aux protéines, et stocke les aliquotes à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>para-Formaldéhyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>Pour préparer une solution de formaldéhyde dans du PBS, pesez la poudre de para-formaldéhyde dans une hotte ventilée et ajoutez-la au PBS préchauffé à environ 60 &deg ; C dans un bécher sur une plaque à mélanger. Ajouter 1 N NaOH goutte à goutte jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse. Laisser refroidir la solution à température ambiante et filtrer à l’aide d’une seringue filtrante de 0,22 mm. Ajustez le pH avec du HCl dilué à environ 6,9 et ajustez au volume final avec du PBS. Nous aliquotes et congelons la solution, mais elle peut également être stockée à 4 &deg ; C pendant environ quatre semaines.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Utilisez des pointes de pipette à large orifice pour manipuler le Triton X-100 non dilué.</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>Pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps dans les analyses d’immunofluorescence.</td></tr><tr><td>&#945 ;-CD31 Anticorps</td> BD <td>Biosciences</td><td>550274</td><td>Anticorps monoclonaux anti-souris purifiés de rat, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-rat de chèvre secondaires</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>IgG anti-rat de chèvre (chaînes lourdes et légères), adsorbés de manière croisée, marqués par fluorescence avec Alexa Fluor 488. D’autres étiquettes fluorescentes sont également possibles.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Milieu de montage pour cytochimie. MW ~31.000</td></tr><tr><td>Labovert ;</td><td>Leitz</td><td>Labovert ;</td><td>Microscope à contraste de phase inversé équipé d’un objectif 4 x et 10 x pour le comptage par paires. D’autres microscopes à contraste de phase (tels que ceux qui sont couramment utilisés dans la culture tissulaire) conviennent également. &nbsp ;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stéréomicroscope avec plage de zoom 8:1 (avec un grossissement compris entre 7,5 x et 60 x) pour la dissection de l’embryon et de l’allantoïde.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Système de microscope pour l’histologie avec éclairage LED. Nous utilisons des objectifs HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 et HC PL FLUOTAR 10 x/0.30. D’autres microscopes équipés d’optiques à contraste de phase et de fluorescence peuvent être utilisés pour évaluer la fixation de l’allantois.</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>Appareil photo de capture numérique 3-CCD fixé au microscope LED DM4000B. Nous utilisons le logiciel Diskus (Hilgers) pour faire fonctionner à la fois le microscope et la caméra.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Microscope confocal pour l’imagerie à haute résolution de l’endothélium dans le plexus vasculaire des explants d’allantoïdes. Des images d’immunofluorescence ont été prises avec un objectif 40x.</td></tr></tbody></table>

dissection et la culture explant allantoïde murin pour l’analyse in vitro de l’attachement allantoïdien

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Le placenta est essentiel pour la croissance et le développement de l’embryon de mammifère. Pour cette raison, nombreuses altérations génétiques et probables insultes aussi environnementales qui perturbent le développement du placenta ou une fonction peuvent causer perte de grossesse précoce chez les souris et les humains. Néanmoins, on manque de simple in vitro tests pour dépister les effets potentiels sur la formation du placenta. Ici, nous nous concentrons sur la modélisation de la première étape critique dans la formation de placenta, qui consiste en la fixation de l’allantoïde sur le chorion. Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer rapidement l’attachement des explants allantoïdien sur l’intégrine α4β1 immobilisé, qui sert de substrat chorio-mimétique. Cette approche in vitro permet une évaluation qualitative de l’attachement et la diffusion de comportement d’explants d’allantoïde multiples à différents moments consécutifs. Le protocole peut être utilisé pour étudier l’effet de mutations ciblées de souris, de drogues ou divers facteurs environnementaux qui ont été liés aux complications de la grossesse ou la perte fœtale sur allantoïde fixation ex vivo.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler et explantation murin allantoides ex vivoet détaille l’évaluation qualitative de l’allantoïde pièce jointe à l’intégrine α4β1, un processus critique pendant en vivo Chorio-fusion. Les résultats représentatifs, illustrés à la Figure 1 a–H montrent les étapes successives d’isolement allantoïde à partir de l’utérus gravide. Des tissus maternels qui entourent les corne...

Nous décrivons un dosage in vitro à l’attachement de Chorio-modèle, la première étape dans la formation du placenta. Le protocole montre la culture dissection et explant de murins allantoides sur l’intégrine α4β1 immobilisée. Fixation de l’allantoïde est évaluée au microscope à des moments prédéterminés.

Dissection et la Culture Explant allantoïde murin pour l’analyse In Vitro de l’attachement allantoïdien

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

L’objectif global de cette procédure est la dissection et la culture d’explants d’allantois murins pour l’analyse de l’attachement allantoïdien in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement embryonnaire de mammifères, telles que le contrôle de l’attachement allantoïdien pour la formation du placenta. Le principal avantage de cette technique est qu’elle modélise la première étape critique de la formation du placenta in vitro.Kerstin Hadamek, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour mettre en place les plaques, ajoutez d’abord 20 microlitres de solution d’intégrine Alpha 4/Beta 1 fraîchement préparée dans chaque puits. Prévoyez un allantois par puits.Ne déposez aucune solution avec des bulles d’air, car cela empêcherait un revêtement correct. Après avoir rempli les puits, incubez la plaque pendant une heure dans un incubateur humidifié. Après l’incubation, aspirez le surnageant des puits tout en tenant la plaque inclinée, afin que la pipette puisse aspirer doucement la solution sans toucher le fond du puits.Ensuite, lavez les puits deux fois avec 50 microlitres de milieu de culture chaud. Lo

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Souris foetal entier Intestin Système de culture pour Ex Vivo Manipulation des voies de signalisation et d'imagerie en direct en trois dimensions du développement des villosités

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Utilisation<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures Upright gouttelettes de toute fœtus organes pour étudier les processus de développement au cours de la souris Organogenèse

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

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Découvrez la dissection et la culture d'explant d'allantoïde murin pour analyser l'attachement allantoïdien in vitro. Cette méthode modélise l'étape initiale de la formation placentaire chez les mammifères.

Dissection et la Culture Explant allantoïde murin pour l’analyse In Vitro de l’attachement allantoïdien

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