À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

L’objectif global de cette expérience est d’utiliser l’édition de gènes CRISPR/Cas9 pour modéliser les mutations de la calréticuline dans les cellules hématopoïétiques dépendantes des cytokines afin d’étudier leur activité oncogène. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des hémopathies malignes, telles que la fonction biologique des mutations conductrices lorsqu’elles sont exprimées à des niveaux physiologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise le système d’édition de gènes CRISPR/Cas9 pour modéliser et étudier la fonction biologique des gènes impliqués dans le cancer.

Pour recuire et phosphoryler les oligos, ajoutez les réactifs à un total de 10 microlitres dans un tube PCR maintenu sur glace. Réglez le programme dans le thermocycleur. Utilisez de l’eau pour diluer la réaction une fois le cycle terminé.

Pour digérer le vecteur lentiGuide-Puro, préparez 50 microlitres de réaction du digesteur. Ensuite, démarrez la réaction de digestion à 55 degrés Celsius dans un bloc de chaleur. Après une heure, ajoutez un microlitre supplémentaire d’enzyme de restriction BsmB1 et continuez la réaction pendant une autre heure.

Pour déphosphoryler l’os coupé, ajoutez sept microlitres de tampon de réaction phosphatase et deux microlitres d’enzyme phosphatase au vecteur digestif. Ensuite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Purifiez l’épine dorsale déjà coupée et déphosphylée à l’aide d’un kit commercial.

Pour préparer le mélange de ligature, ajoutez 15 nanogrammes d’os dorsal digéré et d’autres réactifs dans un tube PCR maintenu sur de la glace et ajustez le volume à 10 microlitres avec de l’eau. Incuber la réaction à température ambiante pendant une heure. Transformez ensuite les cellules compatibles STBL3 avec deux microlitres du mélange de ligature.

Et puis assiette sur le bouillon de lysogénie plaque d’agar contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Après cela, incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Choisissez trois colonies et inoculez-les.

Effectuez une mini-préparation pour chaque culture et séquencez le site d’insertion de l’oligo avec une amorce de la région promotrice U6. Semez des cellules hek293t sur une parabole de 10 centimètres. Et laissez-le pour une incubation d’une nuit.

Pour préparer le mélange d’ADN pour la transfection, pipetez 45 microlitres du réactif de transfection sur l’ADN. À l’aide d’une pipette, mélangez soigneusement l’ADN et le réactif de transfection, et laissez-le reposer pendant 20 minutes. Après cela, ajoutez le mélange de transfection de l’ADN goutte à goutte sur les cellules ensemencées.

Agitez doucement les assiettes. Et incuber à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant une journée. Récoltez le virus contenant du surnageant après 24 et 48 heures en le faisant passer à travers un filtre à onglet de 0,22 micro.

Et aliquote 1,6 millilitres de surnageant dans chaque flacon cryogénique. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension les cellules Ba/F3 dans le milieu en pipetant les cellules de haut en bas plusieurs fois. Ajoutez 500 microlitres de cellules remises en suspension, 1,5 millilitre de surnageant viral, quatre microlitres de polybrène et 10 nanogrammes par millilitre d’interleukine 3 murine dans une plaque de culture tissulaire à six puits.

Centrifugez la plaque à 440 G pendant 120 minutes à 37 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez la plaque dans un incubateur pour une incubation de nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après cela, faites tourner les cellules à 440 G pendant trois minutes.

Et remettez en suspension dans cinq millilitres de milieu frais et chaud dans une assiette à six puits. Pour sélectionner les cellules infectées par Cas9, faites d’abord tourner la cellule vers le bas. Et puis remettre en suspension dans un milieu frais et chaud complété par cinq microgrammes par millilitre de blasticidine après 48 heures de spinfection.

Continuez à sélectionner des cellules pendant neuf jours avec de la blasticidine jusqu’à ce que toutes les cellules non infectées soient mortes. Ensuite, transférez les cellules résistantes dans un milieu avec un microgramme par millilitre de blasticidine. Transduire les cellules parentales et les cellules exprimant de manière stable Cas9 avec la construction rapporteuse pXPR-011 à travers l’infection lentivirale.

Continuez à sélectionner des cellules avec deux microgrammes par millilitre de puromycine pendant trois jours, 48 heures après la spinfection. Infectez les cellules exprimant Cas9 avec de l’acide ribonucléique guide unique à l’aide du lentivirus. Ensuite, utilisez deux microgrammes par millilitre de puromycine pour sélectionner les cellules pendant trois jours, 48 heures après la spinfection.

Bin les cellules Ba/F3 à croissance exponentielle exprimant l’ectopique Cas9 et l’acide ribonucléique guide unique d’intérêt. Aspirez le surnageant et lavez les cellules avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Faites tourner les cellules vers le bas et lavez-les trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de viabilité cellulaire. Après cela, les cellules semeuses en triplicates dans deux millilitres de milieu frais sans interleukine 3 dans six plaques de culture de puits. Commencez à surveiller et à compter les cellules tous les deux jours pendant huit jours.

Des données psychométriques de flux représentatives démontrant l’activité de Cas9 dans les cellules parentales Ba/F3 et la surexpression des cellules Cas9 de Ba/F3 sont présentées ici. Le signal de la protéine fluorescente verte est réduit de 76 % dans les cellules Cas9 surexprimant Ba/F3, ce qui indique une activité robuste de Cas9, tandis que dans les cellules parentales Ba/F3, le signal de la protéine fluorescente verte reste à 100 %. La mutation par décalage de cadre médiée par CRISPR/Cas9 plus une paire de bases a été introduite dans le locus de l’exon neuf de la calréticuline en utilisant la RNase à guide unique m1 et m2.

Les courbes de croissance des cellules Cas9 du récepteur de la thrombopoïétine Ba/F3 ciblées à la calréticuline montrent une croissance indépendante de l’interleukine 3 murine. Cependant, les courbes de croissance des autres types de cellules ne montrent aucune croissance indépendante des cytokines. Les résultats du séquençage confirment l’édition ciblée de l’exon neuf endogyne de la calréticuline dans les cellules Cas9 du récepteur de la thrombopoïétine Ba/F3 ciblées par la calréticuline à l’aide de la RNase guide unique m1 et m2.

Les mutations de décalage de cadre de la paire de base plus une sont indiquées en noir. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de comprendre quel type de mutations dans le gène d’intérêt peut être responsable du phénotype souhaité.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes permettant de caractériser davantage la mutation, telles que son rôle dans la signalisation cellulaire ou dans les interactions protéiques, peuvent être mises en œuvre afin de mieux comprendre le mécanisme par lequel elle provoque la maladie. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’hématologie pour explorer l’effet des mutations de gain de fonction aux niveaux physiologiques sur la transformation cellulaire dans les cellules hématopoïétiques Ba/F3. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la méthodologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9 pour étudier l’activité oncogénique des mutations de gain de fonction dans les cellules hématopoïétiques dépendantes des cytokines.

N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans une installation BL2 plus doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.