Mesure de l’Expression des gènes dans les couches d’Aleurone orge bombardé avec un débit plus élevé

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’expression génique à partir de constructions rapporteures après les avoir introduites dans des cellules d’aleurone d’orge par bombardement de particules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’expression des gènes régulés par les hormones végétales, telles que la façon dont des molécules de signalisation spécifiques agissent pour réguler l’acide abscissique en gènes induits par l’orge. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un débit plus élevé que les méthodes précédentes, ce qui permet de tester un grand nombre de constructions génétiques et de conditions d’incubation.

La démonstration du protocole sera faite par Grace, une étudiante de mon laboratoire. Tout d’abord, placez quelques grains sans embryons dans le couvercle d’une boîte de Pétri en plastique de 90 millimètres contenant 20 millilitres de solution d’absorption et 20 microlitres de chloramphénicol. À l’aide d’une pince stérile, retirez délicatement le tégument transparent de chaque grain.

L’épluchage des téguments du grain d’orge est une étape cruciale. Si les téguments ne sont pas complètement éliminés, les microporteurs d’or ne pourront pas pénétrer dans les cellules d’aleurone. Mais si le peeling est fait trop brutalement, les cellules d’aleurone peuvent être endommagées.

Après avoir épluché le tégument de tous les grains, transférez-les de la boîte de Pétri dans une assiette de vermiculite. Ensuite, placez les grains épluchés sans embryons dans un incubateur à 24 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. Maintenant, étiquetez un tube d’un point de cinq millilitres de chaque traitement qui sera inclus dans l’expérience de bombardement.

Dans chaque tube, ajoutez deux virgule cinq microgrammes de plasmide de contrôle interne de luciférase UBI, deux virgule cinq microgrammes d’un plasmide rapporteur GUS et la quantité souhaitée d’un plasmide effecteur. Ajoutez de l’eau ultra-pure dans chaque tube pour porter le volume total à cinq microlitres. Pour chaque traitement, ajoutez 50 microlitres de microtransporteurs en suspension dans 50 % de glycérol dans chaque tube d’un virgule cinq millilitres contenant de l’ADN plasmidique.

À la dernière étape de la procédure de codage des microsupports, pipetez huit microlitres de microsupports suspendus sur chacun des cinq macrosupports et laissez-les sécher à l’air. Installez l’appareil de bombardement de particules en allumant la pompe à vide, en ouvrant la valve à hélium, puis en allumant le système de distribution de particules. Placez un disque de rupture de 1550 psi dans le capuchon de retenue et montez-le sur le système de distribution de particules.

Placez un macroporteur contenant la combinaison de plasmides souhaitée avec un tamis d’arrêt dans l’ensemble de lancement du microporteur. Insérez l’ensemble dans la fente supérieure de la chambre de bombardement. Ensuite, disposez huit grains sans embryons en un motif radial serré avec les extrémités les plus minces pointant vers l’intérieur sur un cercle de papier filtre qui est collé à plat sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 90 millilitres.

Placez le plat avec les grains dans la chambre de bombardement à une distance de six centimètres de l’écran d’arrêt. Fermez la porte et appuyez sur l’interrupteur à vide pour évacuer la chambre de bombardement à 95 kilopascals. Tournez rapidement l’interrupteur à vide en position de maintien.

Maintenez ensuite l’interrupteur de feu enfoncé pour bombarder l’échantillon. Après avoir relâché le vide, transférez les grains bombardés dans une boîte de Pétri de 60 millimètres étiquetée contenant quatre millilitres de solution d’absorption avec un milligramme par millilitre de chloramphénicol. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les bombardements soient terminés.

Ensuite, incubez les grains bombardés sur une plate-forme vibrante à 100 tr/min à 24 degrés Celsius pendant 24 heures. À l’aide d’une pince, retirez les huit grains bombardés de la boîte de Pétri de 60 millimètres et séchez-les sur une serviette en papier. Divisez les grains en deux tubes étiquetés de deux millilitres, contenant chacun 800 microlitres de tampon de broyage et une bille en acier inoxydable de cinq millimètres.

Après avoir répété l’étape précédente pour tous les grains bombardés, placez jusqu’à 48 tubes de deux millilitres dans deux racks d’un homogénéisateur de billes. Montez ensuite les racks sur l’homogénéisateur et secouez les échantillons à 30 hertz pendant trois minutes. Lorsque vous avez terminé, retirez les grilles de l’homogénéisateur et placez-les sur de la glace pendant cinq minutes pour refroidir à nouveau les échantillons.

Maintenant, montez les grilles sur l’homogénéisateur dans le sens opposé. Agitez à nouveau les échantillons à 30 hertz pendant trois minutes. Après avoir retiré les grilles de l’homogénéisateur, placez-les sur de la glace pendant cinq minutes pour refroidir à nouveau les échantillons.

Ensuite, centrifugez les extraits de grains à 16 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Immédiatement après la centrifugation, décantez les surnageants clairs dans un deuxième ensemble de tubes de microcentrifugation. Vortex brièvement chaque tube et rangez-le sur de la glace.

Après le transfert, le surnageant récupère les billes d’acier inoxydable des granulés afin qu’elles puissent être lavées et réutilisées. Ajoutez maintenant 200 microlitres de tampon de dosage GUS dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Placez 50 microlitres de chaque extrait de grain dans l’un des puits et mélangez avec la pointe de la pipette.

Ensuite, scellez le haut de la plaque avec un film d’étanchéité. Placez la plaque à 96 puits dans un incubateur dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Après l’incubation, centrifuger la plaque à 96 puits à 4 000 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Lorsque vous avez terminé, placez l’assiette sur de la glace. Maintenant, ajoutez 250 microlitres de molaire de carbonate de sodium à point zéro deux dans chaque puits d’une plaque noire à 96 puits. Ajoutez six virgule deux cinq microlitres de chaque mélange de dosage GUS centrifugé dans chaque puits de la plaque noire et mélangez avec la pointe de la pipette.

Inclure des puits à six virgule deux cinq microlitres de 10-40 à 100 micromolaires, quatre méthylombelliférone comme normes. Placez la plaque noire dans un fluorimètre à plaque. Lire la fluorescence de la méthylumbellifère en réglant le gain de l’instrument, de sorte qu’un puits contenant six virgule deux cinq microlitres de 40 micromolaires, quatre méthylombelliférones et 250 microlitres de carbonate de sodium molaire zéro virgule deux donnent une lecture de 100 unités de fluorescence.

Dans cette expérience, une construction de rapporteur HVA1 GUS a été introduite dans des cellules d’aleurone avec une construction effectrice UBI TaABF1. Alors qu’un rapport TaABF1 HVA1 de seulement zéro virgule zéro, un était suffisant pour provoquer une induction triple du gène rapporteur HVA1 en l’absence d’exogénie, d’acide absyssique ou d’ABA. Des niveaux plus élevés de la construction TaABF1 ont entraîné une expression progressivement plus importante de HVA1 de manière dépendante du dos.

L’exogène ABA et TaABF1 pourraient fortement induire l’expression de la construction rapporteuse HVA1 GUS. Dans les deux cas, la présence d’un butanol a fortement inhibé l’induction de HVA1, ce qui suggère que la phospholipase D pourrait jouer un rôle important dans l’activation de l’expression du gène HVA1 par l’ABA via TaABF1. Il a été démontré que l’ABA inhibe fortement l’expression induite par la gibbérelline pour la construction du rapporteur GUS d’Amy32b.

Bien que ni le peroxyde d’hydrogène ni le nitroprussiate de sodium n’aient causé de réduction significative. Ces résultats ne soutiennent donc pas un rôle pour l’oxyde nitrique et le peroxyde d’hydrogène dans les réponses ABA des cellules d’aleurone. Une fois maîtrisée, cette technique peut permettre de mesurer de nombreux échantillons différents pour l’expression des gènes dans un temps relativement court.

Par exemple, le bombardement de 200 échantillons de grains différents peut être effectué par deux enquêteurs en quelques heures. Puis, le lendemain, un seul chercheur peut préparer tous les extraits de protéines en deux heures. Le test GUS modifié effectué sur des plaques de 96 puits nécessite également beaucoup moins de main-d’œuvre que les autres protocoles utilisés dans les futurs tests en tube.