Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique

L’objectif global de cette méthodologie d’échantillonnage de l’air et d’extraction de l’ADN est d’obtenir de l’ADN génomique fongique qui peut être amplifié, séquencé et taxonomiquement placé pour identifier les dangers fongiques potentiels en milieu de travail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’évaluation de l’exposition professionnelle, telles que les dangers fongiques auxquels les travailleurs sont exposés et qui peuvent entraîner des effets négatifs sur la santé. Le principal avantage de cette technique est que les espèces fongiques qui ne sont pas détectées à l’aide de méthodes basées sur la culture ou la microscopie peuvent être élucidées à l’aide d’approches basées sur le séquençage.

Pour assembler la cassette de filtre d’échantillonnage d’air, placez un tampon de support de filtre en cellulose sur la surface quadrillée de la pièce de base, puis, à l’aide d’une pince à filtre, placez un filtre sur le dessus du support de filtre avec le côté collecteur vers le haut. Après l’assemblage, scellez la cassette filtrante en insérant le capot d’extension et en appuyant fermement et uniformément avec une presse manuelle ou pneumatique. Ensuite, placez la cassette assemblée sur l’échantillonneur d’aérosols NIOSH et appuyez autant que possible vers le bas.

Utilisez un morceau de ruban adhésif de 19 millimètres pour enrouler l’extérieur de la cassette filtrante et de l’échantillonneur en maintenant la cassette filtrante en place et en agissant comme un joint d’étanchéité pour éviter les fuites. Vissez fermement et complètement les tubes de collecte dans l’échantillonneur jusqu’à ce qu’ils touchent le fond et enroulez le ruban d’étanchéité autour des tubes agissant comme joint secondaire contre les fuites. Pour effectuer un échantillonnage personnel d’aérosols, placez l’échantillonneur dans la zone respiratoire de la personne.

Fixez l’échantillonneur au revers, à l’épaule ou à la poitrine, puis maintenez la pompe d’échantillonnage au niveau de la taille ou dans un sac à dos. Allumez les pompes et vérifiez au bout d’une minute si la pompe fonctionne. Une fois l’échantillonnage de l’air terminé, prélever l’échantillonneur d’air sur le sujet.

Retirez le ruban d’étanchéité, dévissez les tubes, puis mettez un capuchon dessus. Placez le troisième morceau de cassette filtrante sur le filtre. Tout d’abord, essuyez la cassette d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70 %, puis utilisez un outil d’ouverture de cassette pour ouvrir la cassette d’échantillonnage tout en travaillant dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.

Ensuite, utilisez un lève-filtre pour soulever le tampon de support et le filtre vers le haut. Ensuite, utilisez une pince à filtre pour retirer le filtre et placez-le dans une boîte de Pétri stérile. Coupez le filtre en six morceaux égaux à l’aide d’un scalpel stéroïde, puis placez-les dans un tube renforcé de deux millilitres contenant 300 milligrammes de billes de verre de 200 à 500 micromètres.

Plongez le tube contenant le filtre dans de l’azote liquide pendant 30 secondes, puis placez-le rapidement dans un homogénéisateur de broyeur à billes à une vitesse de 4,5 mètres par seconde pendant 30 secondes. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon de lyse dans les tubes contenant les petits morceaux restants de filtre intact, puis ajoutez 0,3 millilitre de tampon de lyse dans les tubes de prélèvement d’échantillonneur d’air de 15 et 1,5 millilitre et agitez les tubes en position verticale et inversée pendant 10 à 15 secondes respectivement. Transférez le tampon de lyse de chaque tube de collecte dans des tubes renforcés de deux millilitres contenant 300 milligrammes de billes de verre.

Traitez les tubes dans l’homogénéisateur de broyeur à billes pendant 30 secondes, puis centrifugez les échantillons à 20 000 fois la gravité pendant une minute à 22 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre, puis centrifugez-le à nouveau à 20 000 fois la gravité pendant une minute à 22 degrés Celsius. Après avoir ajouté 30 microlitres de réactif de lyse, incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, ajoutez 0,2 millilitre de tampon de liaison et 100 microgrammes par millilitre de protéinase K dans le tube, puis laissez les tubes pour l’incubation dans un chauffe-moteur à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Enfin, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol dans chaque tube. Ensuite, placez des tubes filtrants en fibre de verre d’une capacité de 700 microlitres dans des tubes de collecte de deux millilitres et transférez-y les solutions d’extraction.

Après le transfert, centrifugez les tubes collecteurs à 20 000 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius. Après la centrifugation, insérez la fibre de filtre en verre dans des tubes de collecte frais et jetez le tube de collecte. Dans chaque tube, ajoutez 0,5 millilitre de tampon d’élimination de l’inhibiteur et effectuez une centrifugation à 20 000 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius.

Jetez le tube de collecte après la centrifugation et placez les tubes filtrants dans de nouveaux tubes de collecte. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de lavage dans chaque tube et soumettez-le à nouveau à une centrifugation à 20 000 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius. Jetez le tube de collecte et remplacez-le par des tubes frais après la centrifugation.

Encore une fois, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de lavage dans chaque tube et centrifugez à 20 000 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius. Pour éliminer tout tampon de lavage résiduel, centrifugez enfin les tubes de collecte à 20 000 fois la gravité pendant une minute à 22 degrés Celsius et jetez les tubes de collecte et remplacez-les par des tubes neufs. Après avoir ajouté 100 microlitres de tampon d’élution chaud, incubez les tubes sur la paillasse de laboratoire à température ambiante pendant une à deux minutes et centrifugez les tubes de prélèvement à 20 000 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius.

Placez les tubes filtrants dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre et appliquez à nouveau les éluats pour une autre centrifugation ronde. Utilisez des tubes PCR de 0,5 millilitre pour mettre en place des réactions de 50 microlitres en trois exemplaires avec cinq microlitres d’ADN déjà extrait pour chaque réaction, puis programmez le thermocycleur et démarrez le cycle. Mélangez les trois réactions de PCR dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre.

Ajoutez 750 microlitres de tampon de liaison et mélangez soigneusement en pipetant 10 fois de haut en bas. Ajoutez 450 microlitres du mélange total dans des colonnes de rotation insérées dans des tubes de collecte et commencez la centrifugation à 17, 900 fois la gravité pendant 30 secondes, puis jetez le filtrat et ajoutez les 450 microlitres restants du mélange pour un deuxième cycle de centrifugation. Encore une fois, jetez le filtrat et ajoutez 750 microlitres de tampon de lavage dans les colonnes d’essorage et centrifugez à 17, 900 fois la gravité pendant 30 secondes à 22 degrés Celsius.

Enfin, jetez le filtrat et faites tourner à nouveau les colonnes vides à 17 900 fois la gravité pendant une minute à 22 degrés Celsius. Après avoir transféré les colonnes de centrifugation dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre, pipetez 45 microlitres de tampon d’élution et incubez les tubes sur la paillasse de laboratoire à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les colonnes à 17, 900 fois la gravité pendant une minute à 22 degrés Celsius.

Immergez un gel d’agarose à 1 % dans un tampon TAE à un pli dans une chambre d’électrophorèse, puis mélangez deux microlitres de tampon de chargement à cinq avec huit microlitres d’ADN amplifié. Enfin, chargez les 10 microlitres de l’échantillon sur le gel avec l’échelle d’ADN. Faites fonctionner le gel à 75 volts pendant environ 90 minutes.

Un gel d’agarose représentatif démontre l’amplification des régions d’espacement internes transcrites de l’ADN génomique fongique dérivé d’échantillons d’air professionnel. La voie à l’extrême gauche représente la voie du marqueur ADN. Les bandes de droite représentent les régions d’espacement internes transcrites amplifiées à partir de différents échantillons d’air professionnel de tailles allant de 750 à 1 000 paires de bases.

Un graphique représentatif de Krona montre la présence de diverses espèces fongiques taxonomiques dans un environnement intérieur. L’échantillonneur à cyclone de bioaérosols du NIOSH a été utilisé dans les maisons pour recueillir des bioaérosols pendant une heure afin de déterminer les espèces fongiques présentes. Les données tabulaires représentent les indices de diversité et de richesse des espèces fongiques dans les environnements intérieurs.

Les données montrent des indices de richesse Chao-1 plus élevés, des indices de diversité de Shannon et des coefficients de dissimilitude de Bray-Curtis dans des environnements climatisés et plus froids par évaporation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter des échantillons d’air intérieur et professionnel et d’extraire de l’ADN génomique pour l’analyse des populations microbiennes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser les meilleures méthodes aseptiques pour éviter la contamination microbiologique des échantillons.